現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)講義

現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)講義

?DNA重組技術(shù)與基因檢測(cè)芯片技術(shù)

?動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞活性檢測(cè)技術(shù)

?發(fā)酵工程及分離提取技術(shù)

華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

SCHOOLOFLIFESCIENCES,EASTCHINANORMALUNIVERSITY

2007年9月

弓I言

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，生物工程的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員的需求更為迫切，特別是生

物技術(shù)已經(jīng)滲透到各個(gè)行業(yè)，并已蓬勃發(fā)展。生物技術(shù)的發(fā)展不但要有深厚的理

論基礎(chǔ)，而且要求專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員具有較強(qiáng)的動(dòng)手能力，因?yàn)樵搶W(xué)科是一門(mén)實(shí)踐性

較強(qiáng)的科學(xué)。在培養(yǎng)生物技術(shù)專(zhuān)業(yè)學(xué)生時(shí)要特別注意學(xué)生實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Φ呐囵B(yǎng)，尤其

是專(zhuān)業(yè)基本操作。

本專(zhuān)業(yè)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)課程已經(jīng)包括生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)、微生物實(shí)驗(yàn)、基因工程實(shí)驗(yàn)、

細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)和發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)等課程實(shí)驗(yàn)。這些實(shí)驗(yàn)為培養(yǎng)學(xué)生的基礎(chǔ)操作能

力、提高學(xué)生的實(shí)際動(dòng)手能力等奠定了良好的基礎(chǔ)，但是這些實(shí)驗(yàn)都是單個(gè)的小

實(shí)驗(yàn)，各個(gè)實(shí)驗(yàn)各自為一體，沒(méi)有系統(tǒng)地相互關(guān)聯(lián)，學(xué)生完成實(shí)驗(yàn)后沒(méi)有一個(gè)完

整的概念。

本實(shí)驗(yàn)以基因工程、細(xì)胞工程和發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，組成了生物工程中上

游、中游和下游技術(shù)。其中每一個(gè)部分放棄了原來(lái)單獨(dú)小實(shí)驗(yàn)的結(jié)構(gòu)，而改為一

個(gè)獨(dú)立的大實(shí)驗(yàn)，增加了學(xué)生的設(shè)計(jì)性和主動(dòng)性。這些實(shí)驗(yàn)既注重和加強(qiáng)了原來(lái)

各自的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，又注意到相互聯(lián)系。

本講義分為三個(gè)部分，第一部分“DNA重組技術(shù)與基因檢測(cè)芯片技術(shù)”；第

二部分“動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞活性檢測(cè)技術(shù)”；第三部分“發(fā)酵工程及分離提取

技術(shù)”。這些實(shí)驗(yàn)采取大實(shí)驗(yàn)方法，使學(xué)生有一個(gè)完整的操作過(guò)程，對(duì)理解生物

工程的上游、中游和下游技術(shù)有了感性認(rèn)識(shí)。

第一部分DNA重組技術(shù)與基因檢測(cè)芯片技術(shù)

黃靜陸泉枝編

目錄

前言3

1.相關(guān)基礎(chǔ)知識(shí)4

1.1DNA重組技術(shù)的基本原理4

1.2基因芯片技術(shù)的基本原理6

2.實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?

2.1DNA重組技術(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?

2.2基因芯片技術(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?

3.實(shí)驗(yàn)材料和儀器8

3.1實(shí)驗(yàn)材料8

3.2主要儀器設(shè)備8

3.3實(shí)驗(yàn)器皿8

3.4細(xì)菌培養(yǎng)基8

3.5分子生物學(xué)試劑8

3.6SDS電泳試劑9

3.7基因芯片試劑10

4.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容10

4.1DNA重組技術(shù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容10

4.2基因芯片技術(shù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容11

5.習(xí)題12

6.參考資源12

6.1參考書(shū)目12

6.2參考產(chǎn)品目錄13

6.3參考網(wǎng)站13

附錄一質(zhì)粒DNA的提取14

附錄二瓊脂糖凝膠電泳15

附錄三DNA的純度、濃度的測(cè)定17

附錄四DNA的酶切和連接（體外重組）18

附錄五大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和重組DNA分子的轉(zhuǎn)化19

附錄六重組轉(zhuǎn)化子DNA的鑒定（籃白斑篩選法）21

附錄七重組轉(zhuǎn)化子DNA的鑒定（限制性?xún)?nèi)切酶分析法）22

附錄八DNA的體外擴(kuò)增（PCR技術(shù)）23

附錄九SDS-PAGE電泳25

附錄十毛囊中DNA的提取28

附錄十一基因型檢測(cè)芯片檢測(cè)ACE基因多態(tài)性28

刖s

二十一世紀(jì)是生物學(xué)的世紀(jì)，分子生物學(xué)作為生物學(xué)最前沿的基礎(chǔ)學(xué)科是生物學(xué)類(lèi)專(zhuān)業(yè)

通向生物高技術(shù)的必修課程。隨著人們?cè)诜肿由飳W(xué)水平上的研究和學(xué)習(xí)的深入和廣泛展

開(kāi)，除了在分子水平上了解生物學(xué)的本質(zhì)特征外，在分子水平如何進(jìn)行生物學(xué)操作是生物學(xué)

界共同關(guān)心并十分重視的問(wèn)題。“DNA重組技術(shù)”就是利用分子生物學(xué)的一般原理闡述在

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中所涉及的技術(shù)方法、原理和策略，是一門(mén)指導(dǎo)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作的理論

與實(shí)踐相結(jié)合的課程。

隨著生物科學(xué)和生物技術(shù)的II益發(fā)展，人們?cè)絹?lái)越重視對(duì)生物學(xué)研究手段的了解和掌

握。作為新世紀(jì)的生命科學(xué)學(xué)院的大學(xué)本科生有必要學(xué)習(xí)DNA重組技術(shù)的原理和方法，學(xué)

會(huì)和掌握DNA重組技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)講義就是為基因工程操作的入門(mén)者而編寫(xiě)的。

基因工程技術(shù)的核心內(nèi)容就是DNA重組技術(shù)，即在分子水平上，用人工方法提取或合

成不同生物的遺傳物質(zhì)，在體外切割、拼接和重新組合，然后通過(guò)載體把重組的DNA分子

引入受體細(xì)胞，使外源DNA在受體細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制與表達(dá)，按人們的需要生產(chǎn)出不同的產(chǎn)

物或定向地創(chuàng)造生物的新性狀，并使之穩(wěn)定地遺傳給后代。根據(jù)這一定義，基因工程技術(shù)涉

及到極其廣泛的生物學(xué)新技術(shù)新方法，但它又有一個(gè)基本的操作程序。因而，我們按照DNA

重組技術(shù)的操作程序來(lái)安排實(shí)驗(yàn)，即從載體的選擇一目的基因的制備一體外DNA的重組（酶

切與連接）一重組DNA分子引入受體細(xì)胞一轉(zhuǎn)化子的篩選一重組DNA分子的鑒定等步驟編排

成一個(gè)綜合性大實(shí)驗(yàn)。在這個(gè)綜合性實(shí)驗(yàn)中，每一步實(shí)驗(yàn)既相對(duì)獨(dú)立又與下一步實(shí)驗(yàn)緊密相

連，只有獲得第一個(gè)步驟的實(shí)驗(yàn)結(jié)果才能開(kāi)始第二個(gè)實(shí)驗(yàn)。因此，實(shí)驗(yàn)也涵蓋了所要訓(xùn)練的

單項(xiàng)技術(shù)。在實(shí)驗(yàn)取材方面，我們以大腸桿菌為基本資料，建立適合于大腸桿菌的DNA重

組技術(shù)實(shí)驗(yàn)。我們旨在通過(guò)這些實(shí)驗(yàn)，讓同學(xué)們獲得分子生物學(xué)最基本的技術(shù)訓(xùn)練，掌握最

基本、最常用的技術(shù)，并對(duì)DNA重組技術(shù)有一個(gè)比較全面而系統(tǒng)的概念。

此外，生物芯片技術(shù)已被國(guó)際公認(rèn)為是正在和將要給二十一世紀(jì)的生物科學(xué)、醫(yī)藥、農(nóng)

業(yè)、環(huán)保等領(lǐng)域帶來(lái)革命性變化的新技術(shù)，作為新世紀(jì)生物技術(shù)專(zhuān)業(yè)的大學(xué)生，有必要接觸

生物芯片的一些基本知識(shí)。鑒于目前實(shí)驗(yàn)條件有限，本實(shí)驗(yàn)教程的內(nèi)容僅涉及一種基因（ACE

基因）的多態(tài)性檢測(cè)，讓同學(xué)們了解基因檢測(cè)芯片技術(shù)的一般原理和操作技術(shù)，為今后的工

作和學(xué)習(xí)打下基礎(chǔ)。

作者

2006.9

1.相關(guān)基礎(chǔ)知識(shí)

1.1DNA重組技術(shù)的基本原理

基因工程技術(shù)的核心內(nèi)容就是DNA重組技術(shù)，即在分子水平匕用人工方法提取或合

成不同生物的遺傳物質(zhì)，在體外切割、拼接和重新組合，然后通過(guò)載體把重組的DNA分子

引入受體細(xì)胞，使外源DNA在受體細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制與表達(dá)，按人們的需要生產(chǎn)出不同的產(chǎn)

物或定向地創(chuàng)造生物的新性狀，并使之穩(wěn)定地遺傳給后代。強(qiáng)調(diào)外源核酸分子（一般情況下

都是DNA）在不同宿主中的繁殖，打破自然種的界限，將來(lái)自不相關(guān)物種的基因放入一個(gè)

宿主中是DNA重組技術(shù)的重要特征。另一個(gè)特征是繁殖。重組DNA技術(shù)主要包括以下幾

個(gè)要素：載體；工具酶；外源DNA,即要克隆或表達(dá)的DNA片斷；原核或真核宿主細(xì)胞。

基因克隆的基本步驟是先用限制性?xún)?nèi)切酶切割外源DNA和載體（質(zhì)粒DNA載體或

噬菌體載體），然后連接酶連接，組成DNA重組分子（重組質(zhì)粒，見(jiàn)圖1）,轉(zhuǎn)化入受體細(xì)

胞，構(gòu)建出基因文庫(kù)，再篩選。除了通常的克隆外，還有亞克隆。初步克隆中的外源片段往

往較長(zhǎng)，含有許多目的基因片段以外的DNA片段，在諸如表達(dá)、序列分析和突變等操作

中不便進(jìn)行，因此必須將目的基因所對(duì)應(yīng)的一小段DNA找出來(lái)，這個(gè)過(guò)程叫“亞克隆”。

圖1重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

載體的作用是把外源DNA帶進(jìn)宿主細(xì)胞，并使之在細(xì)胞內(nèi)建立穩(wěn)定的遺傳狀態(tài)，在細(xì)

胞內(nèi)繁殖、傳代或進(jìn)行表達(dá)。質(zhì)粒載體是最常見(jiàn)的載體，也是使用最方便的載體。它應(yīng)用了

質(zhì)粒的復(fù)制、拷貝數(shù)及不相容性等性質(zhì)。質(zhì)粒載體有抗性基因、琥珀突變抑制基因等多種選

擇標(biāo)記和a-互補(bǔ)、插入失活等篩選標(biāo)記。常見(jiàn)的質(zhì)粒載體有：pBR322、pUC18/19、

pUCl18/119、pGEM-3Z/4Z以及一些多功能的質(zhì)粒載體，如：pBluescriptllKS（土）。大

腸桿菌表達(dá)載體是最常見(jiàn)的原核表達(dá)載體，可分為表達(dá)融合蛋白的載體和非融合蛋白表達(dá)載

體。常用的標(biāo)簽蛋白有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、六聚組氨酸肽、蛋白質(zhì)A和纖維素結(jié)合位點(diǎn)等。

重組DNA所涉及的工具酶，最主要的是II型限制性?xún)?nèi)切酶和DNA連接酶。

II型限制性?xún)?nèi)切酶用來(lái)切割DNA,相當(dāng)于基因工程中的“剪刀H型限制性?xún)?nèi)切醐

識(shí)別回文對(duì)稱(chēng)序列，在回文序列內(nèi)部或附近切割DNA,產(chǎn)生帶3'-羥基和5'-磷酸基團(tuán)

的DNA產(chǎn)物，需Mg2+的存在才能發(fā)揮活性。識(shí)別序列主要為4bp?6bp,或更長(zhǎng)且呈

二重對(duì)稱(chēng)的特殊序列，但有少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列或簡(jiǎn)并序列，切割位置因酶而異。如EcoRi

和Hindill的識(shí)別序列和切割位置如下。

EcoRIGIAATTCHind]]]AIAGCTT

CTTAAtGTTCGAtA

連接酶則是將兩段核酸連接起來(lái)的酶，相當(dāng)于基因工程中的“褪糊”。常用的T4DNA連

接醐是在T4噬菌體感染的大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)和分離的，需Mg2+和ATP的存在才能發(fā)揮活

性。它能催化兩條匹配DNA鏈的3'—0H和5'-P之間形成磷酸二酯鍵而把兩個(gè)DNA

分子連接在一起。

外源DNA就是需要克隆的DNA片斷，一般有四種來(lái)源。（1）限制性?xún)?nèi)切酶切割DNA

產(chǎn)生的片斷，經(jīng)電泳分離后回收獲得；（2）大DNA分子經(jīng)人工剪切產(chǎn)生的片斷，這種片斷

一般是平末端；（3）cDNA,即與mRNA互補(bǔ)的DNA,由真核基因的mRNA逆轉(zhuǎn)錄制備；

（4）人工合成的基因，例如根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸順序和遺傳密碼合成的一些基因。

外源DNA分子與載體（質(zhì)粒）經(jīng)過(guò)相同的酶切可以產(chǎn)生相互匹配的粘末端或平末端，

經(jīng)DNA連接酶連接就構(gòu)成了重組DNA分子（重組質(zhì)粒）。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化就是指將質(zhì)?；蛞运?/p>

為載體構(gòu)建的重組DNA分子導(dǎo)入細(xì)菌（受體細(xì)胞）的過(guò)程。這一步是實(shí)現(xiàn)重組克隆的增殖。

受體細(xì)胞要接納外源DNA,必須處于感受態(tài)。所謂感受態(tài)，就是細(xì)菌具有吸收周?chē)h(huán)境

中的DNA的生理狀態(tài)。為了提高受體菌攝取外源DNA的能力，提高轉(zhuǎn)化效率以獲得更多的

轉(zhuǎn)化子，人們摸索出了不同的方法處理細(xì)菌，使其處于感受態(tài)。目前主要采用電轉(zhuǎn)化法和

CaCb法將外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞中，并需要相應(yīng)地制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞和CaCb感受態(tài)

細(xì)胞。

電轉(zhuǎn)化法是利用瞬間高壓在細(xì)胞上打孔，因而使外源DNA能進(jìn)入細(xì)胞，一般轉(zhuǎn)化率為

109?1O10轉(zhuǎn)化子/pgDNA；對(duì)于熱激法，是利用冰冷的CaCb處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，

可以誘導(dǎo)其產(chǎn)生短暫的“感受態(tài)”，易于攝取外源DNA。轉(zhuǎn)化率約IO。?io7轉(zhuǎn)化子/解

DNA。

獲得轉(zhuǎn)化子后可以采用多種方法篩選和鑒定目的克隆。首先可根據(jù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特征進(jìn)行

初步篩選。由于載體都具有供篩選用的遺傳標(biāo)記，如抗生素，細(xì)胞轉(zhuǎn)化后獲得了這種遺傳特

性，使用含適當(dāng)?shù)南鄳?yīng)抗生素的培養(yǎng)基即可初步篩選出轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)初步篩選出來(lái)

的細(xì)菌不一定都含有重組DNA,還需進(jìn)一步對(duì)DNA進(jìn)行分析。常用方法之一是進(jìn)行重組

質(zhì)粒的抽提，然后電泳分析，觀(guān)察其分子量與原有載體相比是否增大；方法之二是將抽提的

重組質(zhì)粒進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶分析，觀(guān)察酶切下來(lái)得到的DNA片段大小是否與預(yù)計(jì)的相符；方

法之三是以重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR鑒定，觀(guān)察PCR產(chǎn)物的大小是否與目的基因大小相符；

方法之四則是將重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列分析，直接分析重組質(zhì)粒上的插入片段即目的基因的

大小與序列是否正確。

在確證得到核酸序列?致的基因后，接下來(lái)就要想辦法使該基因得到表達(dá)，獲得基因表

達(dá)產(chǎn)物——蛋白（肽）。通常采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行量

化、比較及特性鑒定。SDS電泳不但能觀(guān)察到蛋白在電場(chǎng)中的泳動(dòng)位置，而且還能知

道蛋白的分子量大小以及由幾個(gè)亞基組成。此外，還可將電泳膠上的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到尼龍

膜匕以親和反應(yīng)或免疫反應(yīng)來(lái)檢測(cè)特異蛋白的存在，即所謂的WesternBlotting。

在基因表達(dá)產(chǎn)物也得到確證之后，就可以對(duì)表達(dá)的蛋白（肽）進(jìn)行發(fā)酵和分離純化，

并研究其生物學(xué)功能。

1.2基因芯片技術(shù)的基本原理

基因芯片（genechip）技術(shù)是自20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來(lái)的新興技術(shù)，又稱(chēng)DNA芯

片（DNAchip）,是指將許多特定的寡核甘酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定

于支持物上，然后與待測(cè)的標(biāo)記樣品的基因按堿基配對(duì)原理進(jìn)行雜交，再通過(guò)激光共聚焦熒

光檢測(cè)系統(tǒng)或CCD成像掃描系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一探針上的熒

光信號(hào)作出比較和檢測(cè)，從而迅速得出所要的信息。

基因芯片基本技術(shù)通常包括：芯片制作、樣品制備（標(biāo)記）、生物分子反應(yīng)（雜交）以

及數(shù)據(jù)分析（雜交信號(hào)的檢測(cè)及分析）等步驟。在本實(shí)驗(yàn)教程中，我們給大家介紹單基因多

人份的基因檢測(cè)芯片的基本原理和技術(shù)。

本實(shí)驗(yàn)教程使用的基因芯片制作是在醛基修飾后的玻璃基片上制造的。DNA探針（寡

核甘酸片段，與被檢測(cè)的靶DNA互補(bǔ)）溶液與點(diǎn)樣緩沖液以1：1比例混合，通過(guò)點(diǎn)樣儀

點(diǎn)到醛基基片上，然后用芯片活化液固定8小時(shí)。固定后DNA探針將與醛基玻片共價(jià)結(jié)合,

形成陣列；在基因陣列周?chē)N上反應(yīng)艙，完成芯片制作過(guò)程。

樣品制備：通過(guò)向樣本，如毛發(fā)、口腔粘膜脫落細(xì)胞、全血中加入抽提液，煮沸、離心

等操作，使樣品中的細(xì)胞裂解釋放出DNA、同時(shí)使蛋白變性沉淀，完成樣本DNA的抽提。

抽提獲得的染色體DNA濃度太小，直接進(jìn)行雜交檢測(cè)無(wú)法獲得信號(hào)。將抽提獲得的染色體

DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。針對(duì)待檢基因序列的SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)20bp左右的上、下

游引物用于擴(kuò)增靶DNA,同時(shí)，在引物的5'端加上標(biāo)簽序列，對(duì)擴(kuò)增靶DNA進(jìn)行標(biāo)記。

雜交反應(yīng)：將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物變性成單鏈DNA分子，由于基因芯片上固定有與標(biāo)

簽序列相結(jié)合的標(biāo)簽探針，可與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)堿基配對(duì)進(jìn)行特異性雜交。這樣，芯片

上的每個(gè)標(biāo)簽探針都結(jié)合有一個(gè)擴(kuò)增靶DNA分子。然后將芯片與經(jīng)生物素（Biotin）標(biāo)記

的特異性檢測(cè)探針進(jìn)行雜交，就可以知道樣本DNA序列中的SNP信息，即到底是屬于野生

型還是突變型，是雜合子還是純合子。在雜交反應(yīng)中，序列組成、靶標(biāo)DNA分子和探針的

長(zhǎng)度、雜交溫度、鹽濃度等均會(huì)影響雜交效率和強(qiáng)度。

顯色原理：采用生物素標(biāo)記的堿性磷酸酶（AP）催化的NBT/BCIP顯色反應(yīng)的檢測(cè)方

法。首先，特異性檢測(cè)探針上的生物素先與鏈親和素堿性磷酸酶復(fù)合物（Stripavitin-AP）反

應(yīng)，生成新的復(fù)合物：Biotin-Stripavitin-AP.后者發(fā)生如下的顯色反應(yīng)：

Biotin-Stripavitin-AP+BCI-P—BCI-OH+Pi（pH7.5）

BCI-OH+NBT—藍(lán)紫色沉淀

其中，BCIP為5溟4氯-3呼I跺磷酸；NBT為硝基四氮哇藍(lán)。

檢測(cè)原理：采用CCD（ChargeCoupledDevice即電荷耦合器件）原理，將芯片上的色

斑信號(hào)掃描成圖像，用ArrayDoctor分析軟件進(jìn)行分析，給出靶基因SNP信息。

—生物素標(biāo)記的檢測(cè)探針

獷增的靶PCR分子

標(biāo)簽序列相互結(jié)合

單基因多人份基因芯片檢測(cè)原理示意圖

2實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?/p>

2.1DNA重組技術(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?/p>

本實(shí)驗(yàn)利用質(zhì)粒載體克隆外源DNA片段，通過(guò)這個(gè)實(shí)驗(yàn)大家可以掌握質(zhì)粒載體的抽提、

外源DNA的準(zhǔn)備、酶切、連接及感受態(tài)細(xì)胞的制備、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化以及陽(yáng)性克隆子的鑒

定和驗(yàn)證等。

2.1.1提取基因工程中的運(yùn)載基因的載體DNA,掌握最常用的提取和純化DNA的方法。

2.1.2掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理，學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳的操作。并以此法進(jìn)一步區(qū)分質(zhì)粒

DNA中染色體DNA和RNA的污染；估計(jì)出質(zhì)粒DNA分子量的大?。河^(guān)察質(zhì)粒DNA三種

基本構(gòu)象的比例；也可用此法純化DNA及計(jì)算出DNA的濃度，是基因工程實(shí)驗(yàn)中最常用

的實(shí)驗(yàn)方法。

2.1.3學(xué)習(xí)和掌握用紫外分光光度法測(cè)定DNA的純度和濃度。

2.1.4學(xué)習(xí)和掌握限制性?xún)?nèi)切酶的特性、酶解和瓊脂糖凝膠電泳的操作方法。了解限制性?xún)?nèi)

切酶是DNA重組技術(shù)的關(guān)鍵工具，瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定DNA片段的有效方法。

2.1.5學(xué)習(xí)和掌握感受態(tài)細(xì)胞的制備過(guò)程。

2.1.6掌握質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化方法，學(xué)習(xí)把體外重組的DNA（即連接反應(yīng)物）導(dǎo)入受體細(xì)胞（感受

態(tài)細(xì)胞），使受體菌具有新的遺傳特性，并從中選擇出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

2.1.7學(xué)習(xí)從轉(zhuǎn)化子中篩選和鑒定目的克隆的方法，掌握菌落PCR和限制性?xún)?nèi)切酣酶切兩種

鑒定方法。

2.1.8掌握PCR反應(yīng)的基本原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)，了解引物設(shè)計(jì)的一般要求。

2.2基因芯片技術(shù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?/p>

2.2.1了解從毛囊中提取基因組DNA的原理和技術(shù)。

2.2.2了解在PCR擴(kuò)增過(guò)程中如何對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)記。

2.2.3掌握核酸雜交反應(yīng)原理，將樣品與生物素標(biāo)記的探針雜交，通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)得出基

因的基因型。

2.2.4熟悉利用基因芯片技術(shù)檢測(cè)人染色體基因多態(tài)性的基本原理和方法。

3實(shí)驗(yàn)材料和儀器

3.1實(shí)驗(yàn)材料：

菌種：大腸桿菌JM101,大腸桿菌DH5a

質(zhì)粒:pUC18/19（Ampr）

3.2主要儀器設(shè)備：

超凈工作臺(tái)；恒溫培養(yǎng)箱；恒溫振蕩器；恒溫水浴鍋；微波爐；低溫冰箱；

臺(tái)式高速離心機(jī)；漩渦混合器：分析天平；脫色搖床

穩(wěn)壓電泳儀；垂直/水平式電泳槽；紫外一可見(jiàn)光分光光度計(jì)；紫外檢測(cè)儀；SDS

電泳系統(tǒng)

PCR擴(kuò)增儀：凝膠成像分析系統(tǒng)

ACE基因檢測(cè)芯片（上海百傲科技有限公司提供）

BaiO生物芯片識(shí)讀儀（上海百傲科技有限公司提供）

ArrayDoctor分析軟件（上海百傲科技有限公司提供）

3.3實(shí)驗(yàn)器皿：

錐形瓶；試管；燒杯；量筒；三角推棒；培養(yǎng)皿；

tip頭;Eppendorf管;微量移液槍?zhuān)?ul-1000u1）；微量進(jìn)樣器（50u1或100u1）；

一次性手套，牙簽。

3.4細(xì)菌培養(yǎng)基：

LB液體培養(yǎng)基

蛋白陳1.0%

酵母膏0.5%

NaCl0.5%

PH7.5

固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂。將上述培養(yǎng)基滅菌后（1.1公斤/cn?,保溫20分鐘），加入

100mg/mL的Amp,使其終濃度為100ug/mL。

3.5分子生物學(xué)試劑：

RNaseA溶液：10mg/mL,0.IMNaOAcpH4.8,0.3mMEDTA,80—100℃加熱10分鐘，

自然冷卻到室溫，分裝，-20℃保藏。

DNAMarker；限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI或4MIU；入DNA（線(xiàn)狀）；質(zhì)粒純化Kit；TaqDNA

聚合酶,4XdNTP；引物

溶液1：50mM葡萄糖；25mMTris-HCl（pH8.0）；10mMEDTA

溶液H：0.2NNaOH；l%（w/v）SDS

溶液HI：5MKAc60mL；冰醋酸11.5mL；H2O28.5mL

核酸上樣緩沖液：50%蔗糖，0.2%浸酚蘭溶液

(1)TBE緩沖液(Tris-硼酸)：89mMTris-硼酸；2mMEDTA(pH8.0)o

(2)TAE緩沖液(Tris-HAc)：0.04MTris-HAc,1mMEDTA(pH8.0)?

瓊脂糖：按所需濃度稱(chēng)取，并用核酸電泳緩沖液配制，微波爐或煤氣加熱熔化使用。

EB染液替代品：Goldemview染料

氨芾青霉素(Amp)溶液：100mg/mL,無(wú)菌水溶解

IPTG溶液(20%,m/V)：20mgX-gal溶于1mL二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存

X-gal溶液(20%,m/V)：1gIPTG溶于4mL去離子雙蒸水中，定容至5mL,過(guò)濾滅

菌后，-20℃保存

苯酚：氯仿：異戊醇=25：24：1(V/V/V)

70%冷乙醇(一20℃保藏)

3.6SDS電泳試劑：

儲(chǔ)備液

1.2MTris-HCl(pH8.8),100ml

2.IMTris-HCl(pH6.8),100ml

3.10%SDS,100ml

4.50%甘油,100ml

5.50%溟酚蘭,10ml

工作液

A液：100ml

1.30%丙烯酰胺(29.2g)

2.0.8%甲叉雙丙烯酰胺(0.8%)

加蒸儲(chǔ)水至100mL過(guò)濾，棕色瓶避光保存。

B液：100ml

1.75ml2MTris-HCl(pH8.8)

2.4ml10%SDS

1.21mlH2O

C液:100ml

1.50mllMTris-HCl(pH6.8)

2.4ml10%SDS

3.46mlH2O

過(guò)硫酸鉉，5ml

0.5g過(guò)硫酸鍍?nèi)苡?ml蒸儲(chǔ)水。

電泳緩沖液，IL

1.3g

2.14.4g甘氨酸

3.IgSDS

加蒸鏘水定容到IL。

5X上樣緩沖液，10ml

1.0.6mlIMTris-HCI（pH6.8）

2.5ml50%甘氨酸

3.2ml10%SDS

4.0.5ml2-筑基乙醇

5.1ml1%溟酚蘭

染色液,IL

1.1g考馬斯亮藍(lán)R-250

2.450ml甲醇

3.450mlH2O

4.100ml乙酸

脫色液，IL

1.100ml乙醇

2.100ml冰醋酸

3.800mlH2O

其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純

3.7基因芯片試劑：

毛囊DNA提取試劑盒，Baio基因型檢測(cè)芯片試劑盒（上海百傲科技有限公司提供）

4實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

4.1DNA重組技術(shù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

4.1.1載體的制備

從大腸桿菌中提取質(zhì)粒作為運(yùn)載外源基因的載體。并將提取到的質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電

泳，觀(guān)察質(zhì)粒大小、構(gòu)型和純度。為作下一步的酶切，連接及轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，還必須測(cè)定DNA

的純度和濃度。將提取到的質(zhì)粒用分光光度計(jì)檢測(cè)260nm、280nm波長(zhǎng)吸光值，可檢測(cè)質(zhì)

粒純度并根據(jù)吸光值計(jì)算出濃度。

4.1.2目的基因的制備

根據(jù)已知基因序列，設(shè)計(jì)兩條引物，運(yùn)用PCR方法擴(kuò)增出目的基因片斷。將擴(kuò)增片斷

用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用PCR產(chǎn)物回收Kit純化PCR產(chǎn)物，為下一步酶切準(zhǔn)備。注意，

如果是真核基因，應(yīng)該是用其cDNA序列進(jìn)行克隆。

4.1.3體外DNA的重組（酶切與連接）

選擇合適的兩種限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)供體（目的基因）和受體（載體）同時(shí)進(jìn)行酶切，產(chǎn)生

相匹配的粘性末端，再利用T&DNA連接酶將基因片段與我體連接起來(lái)，在體外構(gòu)建成重組

DNA分子。

4.1.4重組DNA分子引入受體細(xì)胞

制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。將重組DNA分子轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，抗性平板篩選并培養(yǎng)

過(guò)夜觀(guān)察。

4.1.5轉(zhuǎn)化子的篩選

利用重組質(zhì)粒的氨革抗性和藍(lán)白斑篩選法對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行初篩。

4.1.6重組DNA分子的鑒定

采用菌落PCR法鑒定和限制性?xún)?nèi)切醐分析來(lái)進(jìn)一步確定陽(yáng)性克隆?；蛘咄ㄟ^(guò)DNA測(cè)序

來(lái)直接檢驗(yàn)。

4.1.7目的基因產(chǎn)物的檢測(cè)

將陽(yáng)性克隆發(fā)酵培養(yǎng)，若是誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒，則加入誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，然后用

SDS分析目的基因產(chǎn)物的大小與表達(dá)量等，若有合適抗體,還可直接用Westernblotting

檢測(cè)目的基因是否表達(dá).

4.2基因芯片技術(shù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

4.2.1毛囊中DNA的抽提

采集帶毛囊的毛發(fā)，經(jīng)裂解后分離出全基因組DNA。

4.2.2人染色體ACE基因的PCR擴(kuò)增

將抽提獲得的全基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。針對(duì)ACE基因（Angiotensin

ConvertingEnzyme血管緊張素轉(zhuǎn)化酶）序列的SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)20bp左右的上、下游引物

用于擴(kuò)增靶DNA,同時(shí)，在引物的5'端加上標(biāo)簽序列，對(duì)擴(kuò)增靶DNA進(jìn)行標(biāo)記。

4.2.3ACE基因的基因型檢測(cè)芯片雜交、顯色、檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)雜交，使PCR產(chǎn)物的標(biāo)簽序列與基因芯片上的標(biāo)簽探針結(jié)合。

提高溫度，將基因芯片與帶有生物素標(biāo)記的特異性檢測(cè)探針雜交、顯色并進(jìn)行檢測(cè)分析。

4.2.4檢測(cè)結(jié)果的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（瓊脂糖凝膠電泳方法）

人類(lèi)ACE基因的16內(nèi)含子中，存在287bp的插入/缺失（I/D）多態(tài)性。因此通過(guò)PCR擴(kuò)

增再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)有490bp（I等位基因）和190bp（D等位基因）兩個(gè)片

段，故可出現(xiàn)三種DNA基因型：（1）由兩個(gè)490bp等位基因構(gòu)成的基因型H；（2）由兩個(gè)

190bp等位基因構(gòu)成的基因型DD；（3）由一個(gè)490bp、一個(gè)190bp等位基因組成的基因型

ID。因此，可以通過(guò)電泳驗(yàn)證基因芯片的檢測(cè)結(jié)果。

-23?bp

-37?bp

-515bp

695bp

-994bp

-1543b

IIDDID

圖4.1ACE擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果

M：分子量標(biāo)記

II：純合子插入型

ID：雜合子插入/缺失型

DD：純合子缺失型

5習(xí)題

1.原核表達(dá)系統(tǒng)的基本要素有哪些？

2.為何真核基因在原核系統(tǒng)中表達(dá)時(shí)要用其cDNA進(jìn)行克?。?/p>

3.實(shí)驗(yàn)小論文

以“XXX基因的克隆和表達(dá)”為題，模擬一個(gè)來(lái)源于真核生物的基因在大腸桿菌中進(jìn)

行表達(dá)的實(shí)驗(yàn)論文。要求簡(jiǎn)單介紹欲克隆基因的背景知識(shí)，克隆策略及重組DNA分子篩選等

內(nèi)容。書(shū)寫(xiě)格式請(qǐng)參考《中國(guó)科學(xué)》雜志上相關(guān)文章格式。實(shí)驗(yàn)小論文中應(yīng)包含如下內(nèi)容:

標(biāo)題，摘要（中英文），關(guān)鍵詞，前言，材料，方法，結(jié)果，討論和參考文獻(xiàn)等。

4.如何實(shí)現(xiàn)一人份多基因檢測(cè)的基因芯片設(shè)計(jì)、制備？

6參考資源

6.1參考書(shū)目：

1.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版），科學(xué)出版社翻譯版，2002

2.基因工程原理（第二版）上冊(cè)，吳乃虎，科學(xué)出版社，1998

3.基因工程原理（第二版）下冊(cè)，吳乃虎，科學(xué)出版社，2001

4.現(xiàn)代基因操作技術(shù)，胡福泉主編，人民軍醫(yī)出版社，2000

5.基因工程概論，張惠展編著，華東理工大學(xué)出版社，1999

6.基因工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)（第二版），彭秀玲編著，湖南科學(xué)技術(shù)出版社，1998

7.生物芯片技術(shù)實(shí)驗(yàn)教程，邢婉麗，程京主編，清華大學(xué)出版社，2006

6.2參考產(chǎn)品目錄：

很多分子克隆技術(shù)是由些知名公司開(kāi)發(fā)出來(lái)的，其分子生物學(xué)產(chǎn)品目錄產(chǎn)品介紹部分

有很多值得我們學(xué)習(xí)的信息。她既對(duì)產(chǎn)品所涉及的基因操作原理作出論述，也對(duì)產(chǎn)品的技術(shù)

參數(shù)作出詳細(xì)的比較介紹。其工作原理、操作步驟深入淺出，圖文并茂，幫助初學(xué)者對(duì)操作

原理和實(shí)驗(yàn)步驟的理解。其附件、附表等參考信息欄目對(duì)研究工作者也有很強(qiáng)的借鑒意義。

如NewEnglandBiolabs公司在分子生物學(xué)試劑方面，Bio-Rad公司在分子生物學(xué)儀器方面

都有很深的造詣。

1.Invitrogen公司分子生物學(xué)產(chǎn)品目錄www.invitrogen.com

2.NewEnglandBiolabs公司分子生物學(xué)產(chǎn)品目錄www.neb,com

3.Promage公司分子生物學(xué)產(chǎn)品目錄www.promage,com,cn

4.TAKARA公司分子生物學(xué)產(chǎn)品目錄www.takara.com.cn

6.3參考網(wǎng)站：

互聯(lián)網(wǎng)上有很多關(guān)于分子生物學(xué)以及生物芯片的網(wǎng)站，這里僅僅羅列了一部分。

www.bioon.com生物谷

www.biooo.com中國(guó)生物論壇

www.biolover,com中文分子生物學(xué)個(gè)人交流網(wǎng)

www.dnalc.org冷泉港實(shí)驗(yàn)室

www.ncbi.nlm.nih.gov美國(guó)國(guó)立生物信息中心

www.genehealth,com,cn上海百傲科技有限公司

13

附錄

.附錄一質(zhì)粒DNA的提取

質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的主要載體，它在基因操作中具有重要作

用。質(zhì)粒的分離與提取是最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

質(zhì)粒的提取方法很多，大多包括3個(gè)主要步驟：細(xì)菌的培養(yǎng)、細(xì)菌的收集和裂解、質(zhì)粒

DNA的分離和純化。本實(shí)驗(yàn)以堿裂解法為例，介紹質(zhì)粒的抽提過(guò)程。

一、原理：

從細(xì)菌如大腸桿菌或枯草桿菌中提取DNA的方法很多，其分離原理可根據(jù)DNA分子

大小的不同、堿基組成的差異以及質(zhì)粒DNA的超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)來(lái)進(jìn)行。目

前常用的有堿變性提取法、酸酚法；PEG法、煮沸法以及浪化乙錠——氯化銅梯度離心法。

這些方法各有利弊，有的操作繁瑣，難以控制，有的純度不夠，有的需要昂貴的儀器。而堿

變性法被認(rèn)為是一種既經(jīng)濟(jì)，且DNA收得率又高的被普遍采用的提取方法。用這種方法提

取的DNA可用于酶切、連接和轉(zhuǎn)化。

堿變性法提取質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分

離的目的。在pH高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而變

性。質(zhì)粒DNA的部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)結(jié)構(gòu)的兩條互補(bǔ)鏈不能完全分離，

當(dāng)以pH4.8的NaAC緩沖液調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)到原來(lái)的構(gòu)型，

保存于溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性，形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)離心與不穩(wěn)定的大分

子RNA、蛋白——SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而去除，從而達(dá)到分離的目的。

二、操作步驟：

1.挑取大腸桿菌JM101（pUC19）單菌落接種于20mLLB液體培養(yǎng)基中（含氨節(jié)青

霉素100ug/mL）,于37c振蕩搖床中培養(yǎng)過(guò)夜（10—12小時(shí)）。

2.取1.2mL培養(yǎng)物入一1.5mLEppendorf管中，12000rpm,離心20s,棄盡上清。

3.往沉淀中加100ul溶液I,旋渦器上振蕩使菌體重懸，37℃水浴15min。

4.往3中溶液加200ul溶液II,輕柔混勻至溶液澄清，冰浴5min。

5.往4中溶液加150ul溶液III,輕柔顛倒2次,冰浴lOmin；12000rpm,離心15min。

吸上清，轉(zhuǎn)入一新的1.5mLEppendorf管中。

6.往5中上清加入等體積苯酚/氯仿/異戊醉（25：24：1）混合物，用力混勻成乳狀

不分層；12000rpm,離心lOmin。

7.吸6中上清，轉(zhuǎn)移至新的1.5mLEppendorf管中，加入等體積氯仿，用力混勻；

12000rpm,離心5min。

8.吸7中上清至新的無(wú)菌1.5mL離心管中，加入等體積異丙醇，室溫放置15分鐘；

或加入兩倍體積的無(wú)水乙醇；-20℃靜置30min。12000rpm,離心15min。

9.小心奔去上清，加入lmL-20℃預(yù)冷的70%乙醇，顛倒3次，12000rpm,離心2min；

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棄盡液體，室溫干燥至沉淀變透明。

10.加入20ul無(wú)菌水溶解沉淀；RNaseA(10mg/mL)lul(1/20體積加入，終濃度0.5

mg/mL),37℃水浴15分鐘。-20℃保藏。

附錄二瓊脂糖凝膠電泳

一、原理：

溪化乙錠(EB)在紫外光照射下能發(fā)出熒光。當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時(shí)，加

入的EB就插入DNA分子中形成熒光絡(luò)合物，使發(fā)射的熒光增強(qiáng)幾H音。而熒光的強(qiáng)度正

比于DNA含量，如將已知的標(biāo)準(zhǔn)樣品做電泳對(duì)照，就可估計(jì)出待測(cè)樣品的濃度。電泳后的

瓊脂糖凝膠直接在紫外燈下拍照，只需5?10ng(lng=10-9Pg)DNA,就可從照片上比較鑒

別。如肉眼觀(guān)察，可檢測(cè)0.05ng?0.01ug的DNA。在凝膠電泳中，DNA分子的遷移速度

與分子量的對(duì)數(shù)值呈反比關(guān)系。可以以此特征區(qū)別染色體DNA、質(zhì)粒DNA和RNA,若用

小刀取下含質(zhì)粒DNA的凝膠帶經(jīng)電泳洗脫則可得純DNA。若將質(zhì)粒DNA用單一切點(diǎn)的酶

消化后，與己知分子量大小的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段進(jìn)行電泳對(duì)照，觀(guān)察其遷移距離就可估計(jì)出該

樣品分子量的大小。DNA分子在凝膠中泳動(dòng)的速度還與DNA分子本身的構(gòu)型有關(guān)，共價(jià)

閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)，一條鏈斷開(kāi)的開(kāi)環(huán)DNA(ocDNA)，兩條都斷開(kāi)的線(xiàn)狀DNA

(LDNA)在電泳中的遷移速率不同，一般cccDNA泳動(dòng)最快，LDNA次之，ocDNA最慢,

因而可以通過(guò)電泳來(lái)區(qū)別質(zhì)粒DNA的構(gòu)型。

二、操作步驟：

1、選擇適當(dāng)大小的電泳槽(大、中、小、微等類(lèi)型)。

2、選擇適當(dāng)大小的點(diǎn)樣梳其底部離電泳槽水平面的距離為1~2mm。

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3、制備瓊脂糖凝膠：按照被分離DNA分子量的大小，決定凝膠中瓊脂糖的含量。一般

可參照下表：

瓊脂濃度（％）0.30.60.70.91.21.52.0

分離線(xiàn)型DNA分子

5?601-200.8-100.5-70.4-60.2-40.1?3

的有效范圍（Kb）

4、稱(chēng)取1%濃度的瓊脂糖，加入TBE（或TAE）緩沖液，在微波爐中熔解，待凝膠冷卻

到50℃左右時(shí):輕輕倒入電泳槽水平板上，除掉氣泡。

5、待凝膠冷卻至凝固后，在電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，使其正好漫過(guò)凝膠表面，然后取

出點(diǎn)樣梳，保持點(diǎn)樣孔的完好。

6、在待測(cè)樣品中加入1/5體積的上樣緩沖液，混勻后小心地進(jìn)行點(diǎn)樣。每孔加樣10?15

□1,一般不超過(guò)20nlo

7、打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，最高電壓不超過(guò)5V/cm,即小電泳槽不得超過(guò)50V,當(dāng)瓊脂糖濃度低于

0.5%時(shí)，電泳溫度不能太高。

8、電泳時(shí)間隨實(shí)驗(yàn)具體要求而定，一般待DNA帶分開(kāi)后即可停止，當(dāng)澳酚藍(lán)泳動(dòng)至2/3

凝膠忖可停止電泳，約需L5小時(shí)左右。

9、電泳結(jié)束后，小心取出凝膠，放入染色液中染色15'左右。

10、將凝膠放在紫外觀(guān)察燈下觀(guān)察電泳結(jié)果。

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附錄三DNA的純度、濃度的測(cè)定

——紫外分光光度法

一、原理：

核酸具有吸收紫外光線(xiàn)的能力，在波長(zhǎng)為260nm的條件下具吸收峰值，而蛋白質(zhì)在

280nm時(shí)具有吸收峰值。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)，純核酸溶液0口26。=1.8?2.0時(shí)，認(rèn)為已達(dá)到所要求

的純度。在樣品中含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)時(shí)，會(huì)使OD26,OD280的比值下降。用此法測(cè)定時(shí)，只

能區(qū)別核酸和蛋白質(zhì)，而無(wú)法區(qū)別質(zhì)粒DNA與染色體DNA及RNAo

二、計(jì)算

DNA濃度（ug/mL）=OD26（＞稀釋倍數(shù)/0.026XL

DNA純度=OD260/OD280（要求比值在1.8-2.0范圍內(nèi)）

注：L為比色杯厚度（cm,一般為1cm。）

核酸和蛋白質(zhì)的吸光度

蛋白質(zhì)出核酸/%OD260：OD280蛋白質(zhì)/%核酸/%OD260；OD280

10000.5745551.89

9551.0640601.91

90101.3235651.93

85151.4830701.94

80201.5925751.95

75251.6720801.97

70301.7315851.98

65351.7810901.98

60401.815951.99

55451.8401002.00

50501.87

三、操作步驟：

1、取石英杯兩只,分別加入TE緩沖液2990U1。

2、在對(duì)照杯中加入10U1TEbuffer,在樣品杯加入10口1樣品。蓋上蓋子，上下幾次

搖勻。

3、放入751型分光光度計(jì)的比色槽中，使用氫燈，分別測(cè)出OD260和OD280的值。

4、按上述計(jì)算公式算出你所制備的DNA的純度和濃度。

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附錄四DNA的酶切和連接(體外重組)

一、原理：

各種限制性?xún)?nèi)切酶能專(zhuān)一的識(shí)別和切開(kāi)特定的堿基順序：

HindIII能識(shí)別和切割順序?yàn)椋?/p>

I

5'A——A——GC——T——T3'

3'T——T——C——GA——A5'

t

HindIII在載體pUC19上只有一個(gè)酶切點(diǎn)，用HindIII醒切載體pUC19時(shí)，就產(chǎn)生帶

有AGCTT的5'粘性末端的線(xiàn)型DNA分子。

HindIIIWXDNA(48.5kb),則產(chǎn)生23130,9416,6557,4361,2322,2027,

564,125bp大小8個(gè)片段。

由于采用同樣的限制性?xún)?nèi)切的醐切質(zhì)粒pUC19和XDNA,在T&DNA連接能的作用下,

PUC19(載體)和入DNA(供體)不同大小片段的DNA粘性末端共價(jià)結(jié)合，產(chǎn)生?個(gè)線(xiàn)型

的重組DNA分子。在T&DNA連接酶的繼續(xù)作用下，重組DNA分子兩端的粘性末端又共價(jià)

結(jié)合，自身環(huán)化成為一個(gè)重組的環(huán)形DNA分子。

二、操作步驟：

1、酶切反應(yīng)：按順序在滅菌的1.5mLEppendorf管中加入

(1)無(wú)菌去離子水

(2)10X酶切緩沖液

(3)入DNA或質(zhì)粒pUC19

(4)限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI或//加/皿(在冰浴中進(jìn)行，防止酶失活)。

蓋緊上述兩只Eppendorf管蓋子，用手指彈幾次使混合均勻。在離心機(jī)上離心5s,使樣

品溶液集中到Eppendorf管底部。

于37℃水浴酶解2小時(shí)后，取上述兩個(gè)樣品的酶切反應(yīng)物溶液各4ul,進(jìn)行瓊脂糖凝

膠電泳，觀(guān)察酶切反應(yīng)情況。剩余的樣品繼續(xù)在37℃水浴中酶切2小時(shí)。

待電泳觀(guān)察酶切反應(yīng)完全后，將上述反應(yīng)液置65℃水浴中保溫10T5分鐘，中止酶切

反應(yīng)。

2、連接反應(yīng)：按順序在滅菌的1.5mLEppendorf管中加入

(1)無(wú)菌去離子水

(2)10XT4DNA連接酶緩沖液

(3)供體：XDNA醐切(純化)產(chǎn)物

(4)載體：質(zhì)粒pUC19酶切(純化)大片段

(5)T4DNA連接酶(在冰浴中進(jìn)行，防止酶失活)

注意：為取得較好的轉(zhuǎn)化效率，供體和載體的摩爾比應(yīng)控制在3—10：1。

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將連接反應(yīng)管中搖勻后放入12℃條件下連接反應(yīng)過(guò)夜或16℃下連接反應(yīng)2-3小時(shí)。

操作中的注意事項(xiàng)：

1、基因工程是微量操作技術(shù)，DNA樣品與內(nèi)切酶的用量都極少，必須嚴(yán)格注意吸樣量

的標(biāo)準(zhǔn)性。

2、要注意酶切時(shí)加樣的次序，各項(xiàng)試劑加好后，最后再加醐液。待用的內(nèi)切醐要放在

冰中，用后立即放回-20℃冰箱，防止內(nèi)切酶失活。

3、凡用在酶切和連接反應(yīng)中的一切塑料器皿(Eppendorf管，吸頭等)，都要反復(fù)用水

洗干凈，最后用dd^O清洗，濕熱滅菌，置50℃溫箱中烘干，使用前打開(kāi)包裝，用鍍子夾

取，不直接用手去拿，嚴(yán)防手上雜酶污染。

4、當(dāng)樣品在370c與65c保溫時(shí)，請(qǐng)注意防止因蓋子未蓋嚴(yán)密使水汽進(jìn)入管內(nèi)，使溶液

體積大量增加而造成實(shí)驗(yàn)失敗。同時(shí)要防止由于標(biāo)簽脫落而分不清樣品類(lèi)型。

附錄五大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和重組DNA分子的轉(zhuǎn)化

一、原理：

重組DNA轉(zhuǎn)化不同細(xì)菌有不同的轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化效率的高低與受體菌的感受態(tài)有關(guān)。所

謂感受態(tài)，就是細(xì)菌具有吸收周?chē)h(huán)境中的DNA的生理狀態(tài)。關(guān)于感受態(tài)的本質(zhì)與存在，說(shuō)

法很多，目前主要兩種假設(shè)：1、局部原生質(zhì)體化假說(shuō)，即認(rèn)為是由于細(xì)菌表面的細(xì)胞壁結(jié)

構(gòu)發(fā)生變化——局部失去細(xì)胞壁或局部溶解細(xì)胞壁，使DNA分子能通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞；2、

酶受體假說(shuō)，認(rèn)為感受態(tài)細(xì)胞的表面形成一種感受態(tài)的細(xì)胞使極少數(shù)。而只有感受態(tài)的細(xì)胞

才能穩(wěn)定地收取外源DNA分子。而且感受態(tài)是在短暫時(shí)間內(nèi)發(fā)生地。一般出現(xiàn)在細(xì)菌對(duì)數(shù)生

長(zhǎng)的后期。作為基因工程的受體菌必須是基因重組缺陷突變體，必須能同外來(lái)DNA分子發(fā)生

遺傳重組，同時(shí)它們又必須是限制系統(tǒng)缺陷或限制與修飾系統(tǒng)均缺陷的菌株。使外來(lái)基因

(DNA)不受其限制酶的降解，這樣才能進(jìn)行遺傳操作。受體菌的感受態(tài)往往通過(guò)CaCk處

理而獲得。DNA分子轉(zhuǎn)化的復(fù)雜過(guò)程如下：

1、吸附：完整的雙鏈DNA分子吸附在受體菌的表面；

2、轉(zhuǎn)入：雙鏈DNA分子解鏈。單鏈DNA分子進(jìn)入受體菌，另一條鏈被降解；

3、自穩(wěn)：外源質(zhì)粒DNA分子在受體菌內(nèi)又復(fù)制成雙鏈環(huán)狀DNA；

4、表達(dá)：外源基因隨同復(fù)制子同時(shí)復(fù)制，并被轉(zhuǎn)錄翻譯。對(duì)DNA分子來(lái)說(shuō)，成功轉(zhuǎn)化

的比率極小，僅占DNA分子的0.01虬

二、操作步驟：

(-)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(CaCb法)

1、從新活化的E.coliDH5a菌平板上挑取一單菌落,接種于3?5mLLB液體培養(yǎng)中，37℃

振蕩培養(yǎng)12h左右，直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將該菌懸液以1:100?1:50轉(zhuǎn)接于100mLLB液體

培養(yǎng)基中，37℃振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液開(kāi)始出現(xiàn)混濁后，每隔20?30min測(cè)一次

OD600nm,至OD600nmW0.5時(shí)停止培養(yǎng)；

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2、每組取培養(yǎng)液2個(gè)1.5mL轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，在冰上冷卻20-30min,于4℃,4000r

/min離心lOmin（從這一步開(kāi)始，所有操作均在冰上進(jìn)行，速度盡量快而穩(wěn)）；

3、倒凈上清培養(yǎng)液，用1mL冰冷的O.lmol/LCaCb溶液輕輕懸浮細(xì)胞，冰?。?/p>

4、0?4℃,4000r/min離心lOmin；

5、棄去上清液，加入500Hl冰冷的0.1mol/LCaC12溶液，小心懸浮細(xì)胞。0?4℃,4000r

/min離心lOmin；

6、棄去上清液，加入100口冰冷的（Mmol/LCaC12溶液，小心懸浮細(xì)胞，冰上放置片

刻后，即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液；

7、制備好的感受態(tài)細(xì)胞懸液可直接用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，也可加入占總體積15%左右高壓滅

菌過(guò)的甘油，混勻后分裝于1.5mL離心管中，置于-70C條件下，可保存半年至一年。

（―）細(xì)胞轉(zhuǎn)化

1、分別取3個(gè)100出感受態(tài)細(xì)胞懸液（如是冷凍保存液，則需化凍后馬上進(jìn)行下面的操

作），第一組,加入10間重組質(zhì)粒DNA（體積不超過(guò)10川）+1005感受態(tài)細(xì)胞，此管為

轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)組。第二組，插入DNA片段對(duì)照組，即酶切后DNA片段25ng+100出感受態(tài)

細(xì)胞懸液；第三組，質(zhì)粒DNA對(duì)照組，即Ing未酶切質(zhì)粒DNA十100口感受態(tài)細(xì)胞

懸液。

2、將以上各樣品輕輕搖勻，冰上放置20-30min,于42℃水浴中保溫1-2min,然后迅

速冰上冷卻2min

3、立即向上述管中分別加入0.8mLLB液體培養(yǎng)基（不需在冰上操作），使總體積到

0.9mL,該溶液稱(chēng)為轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液，搖勻后于37℃振蕩培養(yǎng)約45-60min,使受體菌恢

復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并使轉(zhuǎn)化體表達(dá)抗生素基因產(chǎn)物（Amp）。

（三）平板培養(yǎng)（有時(shí)需要稀釋?zhuān)?/p>

1、取各樣品培養(yǎng)液0.1mL,分別接種于含抗菌素LB平板培養(yǎng)基上，涂