酶工程 抗體酶、核酶和極端酶

關于酶工程抗體酶、核酶和極端酶第一節(jié)抗體酶（Abzyme)一、抗體酶的理論基礎抗體蛋白的特性：抗體（antibody）：抗原（antigen）：半抗原（hapten）：第2頁,共61頁，星期六，2024年，5月第3頁,共61頁，星期六，2024年，5月IgG的三級結構第4頁,共61頁，星期六，2024年，5月IgG與抗原形成

的交聯晶格第5頁,共61頁，星期六，2024年，5月抗體與酶的異同：相同點：都是蛋白質，都有特異性。不同點：1）抗體無催化活力，酶有催化活力。2）本質差別：酶是能與反應過渡態(tài)選擇結合的催化物質，抗體是和基態(tài)緊密結合的物質。第6頁,共61頁，星期六，2024年，5月3）酶的活性和合成受到代謝調節(jié)，種類有限?？贵w只有在抗原存在時才產生，種類無限。第7頁,共61頁，星期六，2024年，5月2.酶與底物形成過渡態(tài)理論

酶的催化在于能結合底物產生過渡態(tài)，降低能障（反應的活化能）。以過渡態(tài)類似物作為半抗原，誘導與其互補構象的抗體，使其具有催化活性，可觀察到抗體催化相應底物發(fā)生化學反應。第8頁,共61頁，星期六，2024年，5月二、抗體酶的定義抗體酶又稱催化抗體（catalyticantibody），是抗體的高度選擇性和酶的高效催化能力巧妙結合的產物，本質上是一類具有催化活力的免疫球蛋白，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性。第9頁,共61頁，星期六，2024年，5月

三、抗體酶的制備

1.誘導法用設計好的半抗原，通過與載體蛋白（如牛血清白蛋白）偶聯制成抗原。然后對動物進行免疫，取免疫動物的脾細胞與骨髓瘤細胞雜交，雜交細胞則分泌單克隆抗體，經篩選和純化，得抗體酶。第10頁,共61頁，星期六，2024年，5月第11頁,共61頁，星期六，2024年，5月2.拷貝法用酶作為抗原免疫動物得到抗酶的抗體，再將此抗體免疫動物并進行單克隆化，獲得單克隆的抗抗體。對抗抗體進行篩選，獲得具有原來酶活性的抗體酶。缺點：具有一定的盲目性和偶然性，并且不能產生新酶.第12頁,共61頁，星期六，2024年，5月第13頁,共61頁，星期六，2024年，5月3引入法將催化基團或輔助因子引入到抗體的抗原結合部位，可采用選擇性化學修飾方法，亦可利用蛋白質工程和基因工程技術第14頁,共61頁，星期六，2024年，5月引入法舉例第15頁,共61頁，星期六，2024年，5月四、抗體酶的應用

1.戒毒:

用可卡因水解的過渡態(tài)類似物-磷酸單酯為半抗原，產生的單克隆抗體能催化可卡因的分解，水解后的可卡因片斷失去可卡因刺激功能。第16頁,共61頁，星期六，2024年，5月2.

腫瘤治療

抗體介導前藥治療技術:將能水解前藥釋放出腫瘤細胞毒劑的酶和腫瘤專一性抗體相偶聯，則酶通過和腫瘤結合的抗體存在于細胞的表面。靜脈給藥后，當藥物擴散至腫瘤細胞的表面或附近，抗體酶將前藥迅速水解釋放出抗腫瘤藥物。第17頁,共61頁，星期六，2024年，5月抗體酶的催化反應1．?；D移反應第18頁,共61頁，星期六，2024年，5月2．重排反應第19頁,共61頁，星期六，2024年，5月3．氧化還原反應第20頁,共61頁，星期六，2024年，5月5．磷酸酯水解反應第21頁,共61頁，星期六，2024年，5月6．磷酸酯閉環(huán)反應第22頁,共61頁，星期六，2024年，5月7.光誘導反應a.光聚合反應（二聚作用）第23頁,共61頁，星期六，2024年，5月b.光裂解反應第24頁,共61頁，星期六，2024年，5月研究展望1．研究酶作用機理，獲得蛋白質結構與功能間關系的一般規(guī)律。2．獲得一類新型的蛋白酶。3．催化天然酶不能催化的反應。第25頁,共61頁，星期六，2024年，5月第二節(jié)核酶（Ribozyme)一、核酶的概念二、核酶的種類三、核酶的應用四、核酶面臨的問題五、影響核酶活性的因素第26頁,共61頁，星期六，2024年，5月ribozyme的發(fā)現80年代初期，美國科羅拉多大學博爾德分校的ThomasCech和美國耶魯大學的SidneryAltman各自獨立地發(fā)現RNA具有生物催化功能.從而改變了生物催比劑的傳統(tǒng)概念。為此，T.Cech和S.Altman共同獲得了1989年度諾貝爾化學獎。第27頁,共61頁，星期六，2024年，5月

具有生物催化功能的RNA。一、核酶的概念生物催化劑（Biocatalyst）蛋白質類：天然酶

enzyme

極端酶extremozyme

抗體酶abzyme

生物工程酶其它：模擬酶核酸類:克隆酶遺傳修飾酶蛋白質工程新酶、RibozymeDeoxyribozyme第28頁,共61頁，星期六，2024年，5月I型內含子剪接型核酶

II型內含子錘頭核酶剪切型核酶發(fā)夾核酶自體催化丁型肝炎病毒（HDV)核酶

RNaseP異體催化

二、核酶的分類第29頁,共61頁，星期六，2024年，5月

自然界存在催化分子內反應（incis）的ribozyme(自我剪接型和自我剪切型)和催化分子間反應(intrans)的ribozyme。第30頁,共61頁，星期六，2024年，5月自我剪接ribozyme分類自我剪接ribozyme可分為兩類：Ⅰ型IVS：均與四膜蟲大核rRNA前體的IVS結構相似、催化自我剪接需鳥苷（或5′鳥苷酸）和Mg2+參與。Ⅱ型IVS：結構與四膜蟲的不同，而與細胞核mRNA前體中的IVS相似。它催化自我剪接反應不需要鳥苷或鳥苷酸參與，但仍需Mg2+第31頁,共61頁，星期六，2024年，5月2．自我剪切ribozyme的分類自我剪切ribozyme,自我剪切的RNA結構有錘頭結構和發(fā)夾結構，其中尖頭指出自我剪切的部位。自我剪接ribozyme：包含剪切與連接兩個步驟。第32頁,共61頁，星期六，2024年，5月幾種能進行自我剪切的RNA結構第33頁,共61頁，星期六，2024年，5月催化分子間反應的ribozyme的分類如：L-19IVS具有5種酶活性，可催化多種分子間反應。第34頁,共61頁，星期六，2024年，5月第35頁,共61頁，星期六，2024年，5月1.剪接型核酶

剪接型核酶的作用機制是通過既剪又接的方式除去內含子（Intron)。第36頁,共61頁，星期六，2024年，5月1）I類內含子的自我剪接(Self-splicing)I型IVS是與四膜蟲26srRNA前體的IVS結構相似的間隔序列，具有環(huán)狀結構。通過轉磷酸酯反應，生成成熟的26srRNA及G-IVS，G-IVS經兩次環(huán)化生成L-19IVS。催化過程需要鳥苷酸或鳥苷以及鎂離子參與。剪接機制L-19IVS在體外的多種酶活性第37頁,共61頁，星期六，2024年，5月p3’HO-Gp3’pP-GOHpP-G3‘HO

Ⅰ類內含子的剪接機制Mg2+或Mn2+GMP,GDP,GTP外顯子

內含子或居間序列（Interveningsequence,IVS)5‘第38頁,共61頁，星期六，2024年，5月

第39頁,共61頁，星期六，2024年，5月UCUAAAIVSGUAAPre-rRNAUCU

AAAGUAAUCUoH3’5‘GAAAGUAAUCUUAA5’GAAAGOH3’G-IVSL-19IVS19nt5‘3‘rRNA5‘3‘5‘pGOH3‘5‘3‘四膜蟲rRNA前體自我剪接反應第40頁,共61頁，星期六，2024年，5月第41頁,共61頁，星期六，2024年，5月1、轉核苷酸作用

2CpCpCpCpCCpCpCpCpCpC+CpCpCpC2、水解作用

CpCpCpCpCCpCpCpC+pC3、轉磷酸作用CpCpCpCpCpCp+UpCpUCpCpCpCpCpC+UpCpUp4、去磷酸作用

CpCpCpCpCpCpCpCpCpC+Pi5、限制性內切酶作用

CpUpCpUpN+GCpUpCpU+GpN第42頁,共61頁，星期六，2024年，5月2）Ⅱ類內含子的自我剪接Ⅱ型IVS是與細胞核mRNA前體的IVS結構相似的間隔序列。通過轉磷酸酯反應，生成成熟的RNA及套環(huán)狀的IVS。催化的剪接反應不需要鳥苷或鳥苷酸參加，但仍需要鎂離子(Mg2+)。剪接機制第43頁,共61頁，星期六，2024年，5月p2‘HO-Ap

p-Ap3’OHpP-AHO3’Ⅱ類內含子的剪接機制Mg2+套環(huán)的形成5‘3‘外顯子連接第44頁,共61頁，星期六，2024年，5月2.剪切型核酶

這類RNA進行自身催化的反應是只切不接。

1）自體催化剪切型

剪切機制

第45頁,共61頁，星期六，2024年，5月轉酯化過程：由靠近切割位點3‘端的2’OH或氧原子對切割位點的磷原子實施親核攻擊，產生5‘-OH和2’，3‘-環(huán)磷酸二酯。

剪切機制核酶自身剪切反應第46頁,共61頁，星期六，2024年，5月錘頭型核酶的二級結構和空間立體結構示意圖三個雙螺旋區(qū)。13個核苷酸殘基保守序列。剪切反應在右上方GUX序列的3‘端自動發(fā)生。第47頁,共61頁，星期六，2024年，5月發(fā)夾（hairpin）結構1989年漢普（Hample）研究煙草環(huán)斑病毒（sTRSV）的負鏈RNA的自我剪切反應，提出發(fā)夾結構（hairpinstructure）模型。發(fā)夾核酶結構模型第48頁,共61頁，星期六，2024年，5月四個螺旋區(qū)、三個連接區(qū)和兩個環(huán)。剪切反應發(fā)生在底物識別序列GUC的5‘端。5‘3‘

發(fā)夾二級結構模型剪切位點第49頁,共61頁，星期六，2024年，5月2)異體催化剪切型

核糖核酸酶P(RNaseP)是內切核酸酶，是核糖核蛋白體復合物，能剪切所有tRNA前體的5‘端，除去多余的序列，形成3’-OH和5’-磷酸末端。

RNaseP由M1RNA和蛋白質亞基組成。第50頁,共61頁，星期六，2024年，5月三、核酶的應用1.基礎理論：生命起源的探索2.醫(yī)藥：

1）通過識別特定位點而抑制目標基因的表達，抑制效率高，專一性強。如抗肝炎病毒、抗人類免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-Ⅰ)、抗腫瘤。

2）免疫原性低，很少引起免疫反應。3.植物抗病毒第51頁,共61頁，星期六，2024年，5月

四、核酶面臨的問題1、核酶催化效率低。2、核酶本身是RNA，很容易被核酸水解酶

RNase破壞。第52頁,共61頁，星期六，2024年，5月五、影響核酶活性的因素1、pH值對活性的影響：pH7.0-7.5時核酶活性最高。2、二價金屬陽離子對活性的影響:Mg2+Mn2+

3、抗生素對活性的影響：大多數為抑制效應4、變性劑對活性的影響:5、溫度對活性的影響:

第53頁,共61頁，星期六，2024年，5月Ribozyme研究進展與展望對各種已知ribozyme結構與功能關系的研究。可找出其結構功能域和必需基團，據此可進行分子改造，以獲得分子更小的、高效的ribozyme第54頁,共61頁，星期六，2024年，5月研究熱點：從催化分子內反應的自我剪切ribozyme設計出催化分子間反應的ribozyme.