質(zhì)粒DNA構(gòu)型分離和分析方法研究進(jìn)展

摘要作為基因傳遞的載體，質(zhì)粒DNA已被廣泛應(yīng)用于DNA疫苗和基因治療。質(zhì)粒DNA存在不同的構(gòu)型，其中超螺旋構(gòu)型的質(zhì)粒在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染和表達(dá)效率最高。美國食品與藥品監(jiān)督管理局在2007年發(fā)布了質(zhì)粒DNA疫苗的工藝指導(dǎo)原則，建議超螺旋構(gòu)型的比例大于80%，因此建立高靈敏度和高分辨率的方法用于質(zhì)粒DNA構(gòu)型分離和分析具有重要意義。本文就近年來質(zhì)粒DNA構(gòu)型的分離和分析方法進(jìn)行了綜述，主要包括瓊脂糖凝膠電泳法、液相色譜法和毛細(xì)管凝膠電泳法，并對未來質(zhì)粒DNA構(gòu)型分離和分析方法的發(fā)展提出了展望。引言質(zhì)粒DNA是染色體（或擬核）外穩(wěn)定存在的遺傳物質(zhì)，具有自主復(fù)制的能力，廣泛存在于細(xì)菌、真菌、酵母菌和放線菌等生物體內(nèi)。通常，來自細(xì)菌的質(zhì)粒是雙鏈、共價(jià)閉合的環(huán)狀DNA分子，以超螺旋（SC）構(gòu)型存在。在提取、純化和保存過程中，細(xì)菌質(zhì)粒會發(fā)生降解，單鏈斷裂會使SC構(gòu)型轉(zhuǎn)變成開環(huán)（OC）構(gòu)型，雙鏈斷裂會變成線性（L）構(gòu)型。在3種構(gòu)型中，SC構(gòu)型的質(zhì)粒最穩(wěn)定，且在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化和表達(dá)效率也最高。細(xì)菌質(zhì)粒是基因工程中最常用的載體。它能攜帶目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞中，并促使目的基因在受體細(xì)胞中表達(dá)。目前，質(zhì)粒已經(jīng)成為DNA疫苗開發(fā)的一種流行的基因傳遞載體，用于癌癥、過敏、自身免疫和傳染病的治療。與常規(guī)的蛋白或者肽疫苗相比，DNA疫苗更穩(wěn)定、成本更低、制造更簡單且安全性更高。迄今為止，在美國登記的DNA疫苗臨床試驗(yàn)項(xiàng)目已經(jīng)超過500項(xiàng)，主要針對病毒感染和癌癥。此外，質(zhì)粒還被用作基因治療中腺相關(guān)病毒載體和CAR-T細(xì)胞治療中慢病毒載體的構(gòu)建。近來，質(zhì)粒還被作為非病毒基因傳遞系統(tǒng)的一部分，用于表皮生長因子受體特異性CAR-T細(xì)胞的產(chǎn)生。作為基因治療和細(xì)胞治療的關(guān)鍵原材料，質(zhì)粒產(chǎn)品的質(zhì)量至關(guān)重要。各國監(jiān)管機(jī)構(gòu)紛紛出臺相應(yīng)的規(guī)定，對質(zhì)粒產(chǎn)品的純度、安全性和有效性等做了嚴(yán)格的要求。其中，SC構(gòu)型質(zhì)粒比例是衡量產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)，但由于其構(gòu)型的多樣性和復(fù)雜性，使得分離和分析較為困難。本文就瓊脂糖凝膠電泳法、液相色譜法和毛細(xì)管凝膠電泳法在質(zhì)粒構(gòu)型分離和分析中的研究進(jìn)展進(jìn)行了評述，并對未來質(zhì)粒構(gòu)型分離和分析方法的發(fā)展提出了展望。正文部分1

瓊脂糖凝膠電泳法瓊脂糖凝膠電泳（AgaroseGelElectrophoresis，AGE）是DNA分析的常用技術(shù)之一，具有操作簡單、快速和分離范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)理論研究、農(nóng)業(yè)科學(xué)、醫(yī)學(xué)衛(wèi)生和工業(yè)生產(chǎn)等許多領(lǐng)域。AGE法采用瓊脂糖作為電泳支持介質(zhì)，分析原理基于電泳和分子篩雙重作用。DNA在電泳的過程中帶負(fù)電荷，在電場的作用下由負(fù)極向正極遷移。不同大小和構(gòu)型的DNA在瓊脂糖凝膠中的遷移速度不同，從而達(dá)到分離的目的。2

液相色譜法液相色譜法（LiquidChromatography，LC）是根據(jù)待測樣品中的各組份在固-液兩相之間分配行為的差異而進(jìn)行分離的方法。根據(jù)分離模式不同，用于質(zhì)粒DNA構(gòu)型分離和分析的LC方法包括陰離子交換色譜法、親和色譜法、疏水作用色譜法和多峰色譜法等。2.1

陰離子交換色譜法與OC構(gòu)型和L構(gòu)型質(zhì)粒相比，SC構(gòu)型質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)更緊密，電荷密度更高。利用它們的電荷密度差異，可以使用陰離子交換色譜法（AnionExchangeChromatography，AEC）來分離和分析質(zhì)粒的構(gòu)型。但是在不同的離子交換色譜柱中3種構(gòu)型的質(zhì)粒出峰順序并不一致，且分離性能也不盡相同。2.2

親和色譜法親和色譜法（AffinityChromatography，AC）是基于目標(biāo)生物分子與載體上特定配體的可逆相互作用來分離和分析生物分子的色譜方法。配體和目標(biāo)生物分子之間的相互作用包括靜電作用、疏水作用、氫鍵、范德華力、配位鍵和弱共價(jià)鍵等，可利用競爭性配體進(jìn)行特異性洗脫，也可采用改變pH值、離子強(qiáng)度和極性等非特異性洗脫方式進(jìn)行洗脫。AC法具有選擇性高、特異性好和分辨率高等優(yōu)勢，在質(zhì)粒純化和分析中深受研究者的青睞。2.3

疏水作用色譜法作為質(zhì)粒純化和構(gòu)型分離的工具，疏水作用色譜（HydrophobicInteractionChromatography，HIC）受到了極大的關(guān)注。HIC中質(zhì)粒DNA的分離依賴于通過疏水載體的流動(dòng)相緩沖液中的鹽濃度，高濃度的鹽能增強(qiáng)質(zhì)粒DNA與疏水載體的相互作用，反之亦然。HIC分離包括4步：平衡、樣品應(yīng)用、洗脫和再生。平衡步驟是通過含有鹽的緩沖液來制備用于分離的固定相；樣品應(yīng)用步驟將樣品引入固定相，并通過中等濃度的鹽洗滌弱結(jié)合的物質(zhì)；洗脫階段通過梯度降低鹽濃度來分離質(zhì)粒DNA的異構(gòu)體；最后一步是固定相的再生，除去所有強(qiáng)作用的分子。HIC的條件溫和，具有極好的回收率。2.4

多峰色譜法多峰色譜（MultimodalChromatography，MMC），又叫混合模式色譜，是近年來興起的一種具有潛力的色譜方法。該方法在固定相載體上修飾具有多個(gè)活性位點(diǎn)的配體，這種配體在相同條件下可以表現(xiàn)出多種相互作用，利用該優(yōu)勢可以實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒DNA異構(gòu)體的分離和分析。3

毛細(xì)管凝膠電泳法毛細(xì)管凝膠電泳（CapillaryGelElectrophoresis，CGE）是毛細(xì)管電泳的一種分離模式，主要適用于蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的分離，具有高效、微量、靈敏及自動(dòng)化等特點(diǎn)。3.1

CGE分離介質(zhì)CGE分離介質(zhì)主要包括化學(xué)膠和物理膠兩大類?；瘜W(xué)膠是指交聯(lián)或化學(xué)鍵合到毛細(xì)管壁上粘度較高的凝膠，物理膠則指不交聯(lián)或鍵合到管壁上粘度較低的高分子溶液。3.2

CGE分離通道毛細(xì)管是CGE的分離通道，毛細(xì)管壁的性質(zhì)直接影響質(zhì)粒DNA不同構(gòu)型的分離效果。對于非涂層毛細(xì)管來說，電滲流是最大的驅(qū)動(dòng)力來源之一。電滲流情況的存在，能夠有效增加分離的速度，但是也減少了分離的時(shí)間和分離的有效距離，電滲流的波動(dòng)也極大影響了遷移時(shí)間的重復(fù)性。許多研究工作采用未涂層的毛細(xì)管來分離質(zhì)粒DNA異構(gòu)體，通過優(yōu)化一些實(shí)驗(yàn)參數(shù)，如緩沖溶液的濃度、酸堿度、篩分聚合物的濃度和聚合物分子長度等條件，來減少電滲流對質(zhì)粒DNA異構(gòu)體分離效果的影響，但是效果往往不佳。3.3

CGE檢測模式毛細(xì)管電泳中應(yīng)用最多的檢測器是紫外（UV）檢測器，其次是熒光檢測器。激光誘導(dǎo)熒光（LIF）檢測器是熒光檢測器的一種，它采用激光作為激發(fā)源，具有極窄的帶寬、高空間相干性和可忽略的色差，很容易聚焦到毛細(xì)管的微通道上。自從Gassmann等首次將LIF檢測器引入到毛細(xì)管電泳以來，毛細(xì)管電泳的靈敏度和特異性得到了顯著的提高。4

展望展望質(zhì)粒DNA構(gòu)型的分離和分析，對于質(zhì)粒DNA的純化、質(zhì)量評估以及穩(wěn)定性監(jiān)測等具有重要意義。AGE作為最早應(yīng)用于質(zhì)粒DNA構(gòu)型分離和分析的技術(shù)，具有操作簡單、快速和分離范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。然而，靈敏度低和重復(fù)性差限制了其在治療用質(zhì)粒DNA分離和分析中的應(yīng)用。液相色譜中，AEC仍然是質(zhì)粒DNA異構(gòu)體分離和分析的主要手段。AC具有較高的選擇性、特異性和分辨率等優(yōu)勢，在質(zhì)粒純化和分析中受到了研究者廣泛的關(guān)注。近年來發(fā)展起來的MMC允許在單個(gè)色譜程序中同時(shí)與樣品進(jìn)行一次以上的相互作用，成為非常有潛力的質(zhì)粒分