GB/T 40664-2021 用于高通量測(cè)序的核酸類(lèi)樣本質(zhì)量控制通 用要求（正式版）

ICS07.080GB/T40664—2021用于高通量測(cè)序的核酸類(lèi)樣本國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)I Ⅲ 12規(guī)范性引用文件 1 14質(zhì)量控制要求 24.1通用要求 24.2基因組DNA核酸類(lèi)樣本質(zhì)量要求 34.3總RNA核酸類(lèi)樣本質(zhì)量要求 35質(zhì)量檢測(cè)方法 35.1主要設(shè)備和儀器 35.2核酸類(lèi)樣本質(zhì)量檢測(cè)方法 4附錄A(資料性)核酸類(lèi)樣本完整性檢測(cè)示例圖 5ⅢGB/T40664—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由全國(guó)生物樣本標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC559)提出并歸口。本文件起草單位：深圳華大生命科學(xué)研究院、中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院、深圳華大智造科技股份有限公屬醫(yī)院(廣東省中醫(yī)院)、湖北國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心(武漢海關(guān)口岸門(mén)診部)。GB/T40664—2021隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展和廣泛應(yīng)用，越來(lái)越多種類(lèi)的核酸樣本被用于高通量測(cè)序，從而在DNA和RNA的分子水平來(lái)揭示不同物種間核酸序列的差異以及特定生物學(xué)過(guò)程和疾病發(fā)生過(guò)程中的分子機(jī)理。由于核酸樣本的質(zhì)量會(huì)對(duì)高通量測(cè)序的數(shù)據(jù)結(jié)果產(chǎn)生直接影響，因此制定用于高通量測(cè)序的核酸類(lèi)樣本質(zhì)量控制的通用要求就顯得尤為緊迫和重要，從而保證高通量測(cè)序的核酸樣本具備達(dá)標(biāo)的質(zhì)量，進(jìn)而得到可靠的測(cè)序數(shù)據(jù)，避免信息錯(cuò)誤和信息丟失等情況的出現(xiàn)。本文件是基于高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用和驗(yàn)證數(shù)據(jù)而制定，規(guī)定了多種高通量測(cè)序類(lèi)型的核酸樣本準(zhǔn)入要求，從而提高測(cè)序的成功率及準(zhǔn)確性，對(duì)于規(guī)范整個(gè)高通量測(cè)序市場(chǎng)起到了重要作用。1GB/T40664—2021用于高通量測(cè)序的核酸類(lèi)樣本質(zhì)量控制通用要求1范圍核生物的基因組DNA和總RNA樣本。GB/T30989高通量基因測(cè)序技術(shù)規(guī)程帶有遺傳信息的生物大分子。由四種主要的脫氧核苷酸(脫氧單磷酸腺嘌呤dAMP、脫氧單磷酸鳥(niǎo)嘌呤dGMP、脫氧單磷酸胞嘧啶dCMP和脫氧單磷酸胸腺嘧啶dTMP)通過(guò)3',5'-磷酸二酯鍵連接注：不同種類(lèi)的RNA鏈長(zhǎng)不同，行使各式各樣的生物功能，如與蛋白質(zhì)生物合成有關(guān)的RNA有信使RNA(mes-sengerRNA,mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(transferRNA,tRNA)和核糖體RNA(ribosomeRNA,rRNA);與轉(zhuǎn)錄后加工有關(guān)的RNA有核小RNA(smallnuclearRNA,snRNA)、核仁小RNA(smallnucleolarRNAs,snoRNAs);與生物調(diào)控有關(guān)的RNA有微RNA(microRNAs,miRNA)、干擾小RNA(smallinterferingRNA,siRNA)等。生物細(xì)胞中主要的核糖核酸之一，是一種具有催化能力的核糖酶。注：其單獨(dú)存在時(shí)不能如其他核糖核酸那樣發(fā)揮作用，僅在與多種核糖體蛋白質(zhì)共同構(gòu)成核糖體(一種無(wú)膜細(xì)胞器)后才能執(zhí)行其功能，是含量最高的一種RNA。原核生物的核糖體所含的rRNA有52核生物有4種rRNA,它們分子大小分別是5S、5.8S、18S和28S。一種簡(jiǎn)便高效的分離和純化DNA片段的方法。注：由于DNA分子的雙螺旋骨架兩側(cè)帶有含負(fù)電荷的磷酸根殘基，因此在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，常用的分子篩有瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠等。具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的DNA在分子篩中泳動(dòng)速度不一樣，因而可依據(jù)DNA分子的大小來(lái)使其分離。在電泳過(guò)程中可以通過(guò)將樣品和示蹤染料或相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參照物一起進(jìn)行電泳而得到檢測(cè)。通常包括自配制及商業(yè)化預(yù)制膠凝膠電泳。RNA完整性，RIS/RIN(RIN2)/RQS值均為1～10,數(shù)值越大表明RNA完整性越好。S表示顆粒物質(zhì)或溶質(zhì)在超速離心場(chǎng)中的沉降速率。注：一般用s表示，8=v/a,其中a為重力加速度或離心加速度，v為沉降速度，即沉降系數(shù)為每單位離心力場(chǎng)的沉高通量基因測(cè)序high-throughputgenesequencing高通量測(cè)序high-throughputsequencing4.1通用要求4.1.1用于高通量測(cè)序的核酸類(lèi)樣本應(yīng)根據(jù)GB/T4.1.2生物樣本及相關(guān)數(shù)據(jù)的使用應(yīng)遵守區(qū)域、國(guó)家和國(guó)際的倫理規(guī)范。GB/T40664—20214.1.4樣本質(zhì)量要求應(yīng)通過(guò)完整性和樣本濃度確定。4.2基因組DNA核酸類(lèi)樣本質(zhì)量要求4.2.1基因組DNA完整性基因組DNA是組成生物基因組的所有DNA。其完整性應(yīng)符合凝膠電泳主帶單一，在23kb左右4.2.2基因組DNA樣本濃度單位體積的液體里含核酸的量，可使用質(zhì)量濃度(ng/μL)表示。基時(shí)儀器檢測(cè)精度不夠且影響文庫(kù)構(gòu)建的成功率，不同文庫(kù)構(gòu)建類(lèi)型和不同高通量測(cè)序儀對(duì)樣本濃度要4.3總RNA核酸類(lèi)樣本質(zhì)量要求總RNA是從基因組轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。包括信使RNA、核糖體RNA及一些與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后加工及轉(zhuǎn)錄后翻譯有關(guān)的非編碼RNA。可通過(guò)總RNA的檢測(cè)確定RNA的完整性。RNA樣本的完整性宜通過(guò)微流控或自動(dòng)化凝膠電泳分析總RNA的RIN值以及rRNA的28S/18S或23S/16S比值進(jìn)行判斷(其中原核生物應(yīng)使用23S/16S數(shù)值進(jìn)行判斷，真核生物應(yīng)使用28S/18S數(shù)值進(jìn)行判斷),真核生物又分為人、動(dòng)物，植物、真菌和昆蟲(chóng)這三類(lèi)作不同要求。不同物種的總RNA完整性要求見(jiàn)表1。微流控分析檢測(cè)圖譜見(jiàn)A.2～A.5。完整性要求樣本類(lèi)型原核生物總RNA植物、真菌總RNA人、動(dòng)物(不含昆蟲(chóng))總RNA—23S/16S或28S/18S18S主帶清晰微流控檢測(cè)圖譜基線(xiàn)基線(xiàn)呈直線(xiàn)基線(xiàn)呈直線(xiàn)基線(xiàn)呈直線(xiàn)基線(xiàn)呈直線(xiàn)總RNA樣本濃度低于1ng/μL時(shí)儀器檢測(cè)精度不夠且影響RNA文庫(kù)構(gòu)建的成功率，不同文庫(kù)構(gòu)建類(lèi)型和不同高通量測(cè)序儀對(duì)樣本濃度有不同要求，樣本濃度應(yīng)大于1ng/μL。5質(zhì)量檢測(cè)方法5.1.2微流控電泳分析儀。34GB/T40664—20215.1.3定量熒光計(jì)：可配合熒光染料檢測(cè)試劑快速完成核酸濃度的讀取，最低應(yīng)能檢測(cè)0.2ng/μL的核酸樣本。5.2核酸類(lèi)樣本質(zhì)量檢測(cè)方法5.2.1基因組DNA核酸類(lèi)樣本的檢測(cè)方法采用凝膠電泳法檢測(cè)DNA核酸樣本的完整性，宜使用1%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電壓120V,電泳時(shí)間30min;采用熒光染料法進(jìn)行核酸濃度的檢測(cè)，按照對(duì)應(yīng)的熒光染料檢測(cè)試劑流程進(jìn)行操作。5.2.2總RNA核酸類(lèi)樣本的檢測(cè)方法采用微流控電泳或自動(dòng)化凝膠電泳分析法檢測(cè)總RNA核酸樣本的完整性，具體操作參考微流控電泳或自動(dòng)化凝膠電泳的操作說(shuō)明；常規(guī)樣本宜采用熒光染料法進(jìn)行總RNA濃度的檢測(cè)，微量樣本宜采用微流控電泳或自動(dòng)化凝膠電泳分析法檢測(cè)總RNA的濃度。5GB/T40664—2021A.1基因組DNA樣本完整性檢測(cè)凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA樣本完整性結(jié)果見(jiàn)圖A.1。泳道2、泳道3的樣本降解嚴(yán)重，高通量測(cè)序結(jié)果堿基測(cè)序準(zhǔn)確率低于99%。bpbp400002000094168144655761084361407223130說(shuō)明：Mnarker,參照標(biāo)準(zhǔn)，用于指示核酸分子大小的一系列核酸分子；bp——basepair,堿基對(duì)，用于表示DNA核酸類(lèi)樣本分子大小的單位。注2:泳道2、泳道3:樣本DNA主帶不清晰，有彌散，降解嚴(yán)重。圖A.1凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果A.2原核總RNA樣本完整性檢測(cè)微流控電泳檢測(cè)原核總RNA樣本完整性結(jié)果見(jiàn)圖A.2。6GB/T40664—2021RNAArca;201.8RNAConeen|raliL17-403ng/μLrRNARatio[23S16S]:1.2RNAInlegrityNumber(RIN)7.9[B.02.07,AnomalyThreshold(s)manuallyadapled]Ecoli711RNAConcentrationrRNARatio[23S/16S] 23S和16S的rRNA比值：RNAIntegrityNumber(RIN)——儀器自己計(jì)算出的一個(gè)數(shù)值，代表了RNA的完整性。圖A.2原核樣本微流控電泳檢測(cè)結(jié)果A.3植物總RNA樣本完整性檢測(cè)微流控電泳檢測(cè)植物總RNA樣本完整性結(jié)果見(jiàn)圖A.3。7GB/T40664—2021OverallResultstorsaimplc8:RNAArea:RNAConcentration:rkNARatio[28S/185]:RNAIntegrityNumber(RIN):A6260ngiulL6.8(B02.07)FUntA62RNAAreaRNAConcentrationrRNARatio[28S/18S]RNAIntegrityNumber(RIN) ——樣本8的總結(jié)果； 圖A.3植物樣本微流控電泳檢測(cè)結(jié)果A.4昆蟲(chóng)總RNA樣本完整性檢測(cè)微流控電泳檢測(cè)昆蟲(chóng)總RNA樣本完整性結(jié)果見(jiàn)圖A.4。8GB/T40664—2021OvcrallResultsforsample8:RNAArea:RNAConcentration:rRNARatro|28S/18S|:RNAIntegrityNumber(RIN):NA(B3.02.07)Ld—1RNAArea RNAIntegrityNumber(RIN)——儀器自己計(jì)算出的一個(gè)數(shù)值，代表了RNA的完整性。昆蟲(chóng)樣本沒(méi)有此數(shù)值，所以顯示N/A。圖A.4昆蟲(chóng)樣本微流控電泳檢測(cè)結(jié)果A.5動(dòng)物總RNA樣本完整性檢測(cè)微流控電泳檢測(cè)動(dòng)物總RNA樣本完整性結(jié)果見(jiàn)圖A.5。GB/T40664—202104000RNAArcaRNAConccntration:FU——熒光單位，熒光的大小反映了核酸類(lèi)樣本的濃度；ntOverallResultsforsam