多肽藥物的含量測定方法專家講座

肽類藥品含量測定方法背景：多肽類藥品及其主要優(yōu)勢人體生長和發(fā)育都離不開多肽，多肽是調(diào)整系統(tǒng)功效和細(xì)胞生長基礎(chǔ)。多肽類藥品作為藥品開發(fā)主要方向，它包含各種類型，常見多肽類藥品有以下幾個.多肽類疫苗：多肽類疫苗研制為人類攻克肝炎、艾滋病等疾病帶來了希望。.抗腫瘤多肽類藥品：腫瘤危害人類生存，其產(chǎn)生是多方面原因共同作用結(jié)果，但歸根到底是癌基因表示問題。多肽類抗癌藥品因為其能夠成為腫瘤基因表示時調(diào)控因子，因而成為了抗癌藥品研究新希望。.抗病毒類多肽藥品：普通來說，病毒感染細(xì)胞過程包含以下幾個主要階段：吸附、自我復(fù)制、重新組合、釋放病毒等。?？共《径嚯耐ǔＷ饔糜诓《疚胶筒《緩?fù)制兩個階段，經(jīng)過與宿主細(xì)胞特異性結(jié)合或者病毒蛋白酶結(jié)合來發(fā)揮作用。多肽藥物的含量測定方法專家講座第1頁一、酸堿滴定法示例：苯酪酞測定測定方法：取本品約0.5g精密稱定，加中性乙醇（對酚酞指示液呈中性）60ml，振搖，溶解后加酚酞指示液數(shù)滴，用氫氧化鈉滴定（0.1mol/L)，即可。多肽藥物的含量測定方法專家講座第2頁二、

紫外分度光度法

示例：五肽胃泌素含量測定五肽胃泌素為白色或類白色粉末。本品能促進(jìn)胃酸、胃蛋白酶及內(nèi)因子分泌，其促胃酸分泌作用相當(dāng)于內(nèi)源性胃泌素1/4，作用可連續(xù)10~40分鐘。臨床上主要用于胃酸分泌機(jī)能檢驗。多肽藥物的含量測定方法專家講座第3頁方法原理：供試品加0.01mol/L氨溶液定量稀釋，制成供試液，置紫外可見分光光度計,于280nm波優(yōu)點(diǎn)測定吸收度，計算出其含量。試劑：氨溶液（0.01mol/L）標(biāo)準(zhǔn)品：E1%1cm

為70計算儀器設(shè)備：紫外可見分光光度計注：分光光度法應(yīng)以配制供試品同批溶劑為對照，采取1cm石英吸收池。以吸收度最大波長作為測定波長，普通供試品吸收度讀數(shù)，以在0.3-0.7之間誤差較小。儀器狹縫波帶寬度應(yīng)小于供試品吸收帶半寬度，不然測得吸收度偏低。狹縫寬度選擇，應(yīng)以降低狹縫寬度時供試品吸收度不再增加為準(zhǔn)。因為吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，所以測定供試品吸收度后應(yīng)減去空白讀數(shù)，再計算含量。多肽藥物的含量測定方法專家講座第4頁三、效價測定法實例（1）：抑肽酶效價測定抑肽酶(Trasylol，別名：抑胰肽酶、屈來密多)能抑制胰蛋白酶及糜蛋白酶，阻止胰臟中其它活性蛋白酶原激活及胰蛋白酶原本身激活。臨床用于預(yù)防和治療急性胰腺炎、纖維蛋白溶解引發(fā)出血及彌漫性血管內(nèi)凝血。還可用于抗休克治療。在腹腔手術(shù)后，直接注入腹腔可預(yù)防腸粘連。抑肽酶經(jīng)過酶上絲氨酸活性部分，形成抑肽酶-蛋白酶復(fù)合物而到達(dá)抑制作用。然而與不一樣蛋白酶結(jié)合，顯示出不一樣離解常數(shù)。與胰蛋白酶結(jié)合最牢靠．與人體纖溶酶結(jié)合不很牢靠。多肽藥物的含量測定方法專家講座第5頁（1）底物溶液制備(2)胰蛋白酶稀釋溶液制備精密量取胰蛋白酶溶液1ml，用硼砂－氯化鈣緩沖液（pH8.0）稀釋成20ml，室溫放置10min，置于冰浴中。取N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽171.3mg，加水溶解并稀釋至25ml。臨用時配制。胰蛋白酶溶液制備取胰蛋白酶對照品適量，精密稱定，加鹽酸滴定液（0.001mol/L）溶解并制成每1ml中約含0.8單位（每1ml中約含1mg）溶液，臨用時配制并置于冰浴中。(3)供試品溶液制備取本品適量，精密稱定，加硼砂一氯化鈣緩沖液（pH8.0）溶解并制成每1ml中約含1.67單位（每1ml中約含0.6mg）溶液，精密量取0.5ml與胰蛋白酶溶液2ml，再用硼砂一氯化鈣緩沖液（pH8.0）稀釋成20ml，反應(yīng)10分鐘，置冰浴中（2小時內(nèi)使用）。多肽藥物的含量測定方法專家講座第6頁(4)測定法取硼砂－氯化鈣緩沖液（pH8.0）9.0ml與底物溶液1.0ml，置25ml燒杯中，于25℃±0.5℃恒溫水浴中放置3～5分鐘，在攪拌下滴加氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L）調(diào)整pH值為8.0，精密加入供試品溶液（經(jīng)25℃保溫3～5分鐘）1ml，并馬上計時，用1ml微量滴定管以氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L）滴定釋放出酸，使溶液pH值一直保持在7.9～8.1。每隔60秒讀取pH值恰為8.0時所消耗氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L）體積（ml），共6分鐘。另精密量取胰蛋白酶稀釋溶液1ml，按上法操作，作為對照（重復(fù)一次）。以時間為橫坐標(biāo)，消耗氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L）為縱坐標(biāo)作圖，應(yīng)為一條直線。供試品和對照兩條直線應(yīng)基本重合，求出每秒鐘消耗氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L）體積（ml），按下式計算。每1mg抑肽酶效價（單位）式中4000為系數(shù)；W為抑肽酶制成每1ml中約含1.67單位時酶量，mg；n1為對照測定時每秒鐘消耗氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L）體積，ml；n2為供試品溶液每秒鐘消耗氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L）體積，ml；2為供試品溶液中所加入胰蛋白酶量為對照測定時2倍；f為氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L）校正因子。多肽藥物的含量測定方法專家講座第7頁效價單位定義能抑制一個胰蛋白酶單位[每秒鐘能水解1μmolN-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）為一個胰蛋白酶單位（microkatal）]活力稱為一個抑肽酶活力單位（EPU）。每1EPU抑肽酶相當(dāng)于1800KIU。注意事項：（1）本試驗測定原理：在一定條件下（pH8.0，25℃），胰蛋白酶可使N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯水解為N-苯甲酰-L-精氨酸，使溶液pH下降，當(dāng)加入氫氧化鈉滴定后，使溶液pH又回到8.0，水解繼續(xù)進(jìn)行。（2）當(dāng)胰蛋白酶中加入抑肽酶后，使50%胰蛋白酶活性被抑制，剩下胰蛋白酶繼續(xù)與底物進(jìn)行水解反應(yīng)，用氫氧化鈉滴定釋放出酸，使pH一直維持7.9~8.0，在一定時間內(nèi)，依據(jù)依據(jù)樣品消耗氫氧化鈉（0.1mol/L）體積（ml)算出活力單位。多肽藥物的含量測定方法專家講座第8頁實例（2）桿菌肽效價測定：

利用桿菌肽能夠抑制微生物生長特征，進(jìn)行