非洲豬瘟病毒基因IⅡ型重組毒株、基因I型弱毒株和基因Ⅱ型毒株鑒別三重熒光PCR檢測方法

1株鑒別三重熒光PCR檢測方法本文件規(guī)定了非洲豬瘟病毒基因Ⅰ/Ⅱ型重組毒株、本文件適用于豬血清、組織、口腔拭子、肛門拭子等樣品中的非洲豬瘟病毒核酸檢測及基因Ⅰ/Ⅱ型NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范4符號和縮略語實時熒光PCR：實時熒光聚合酶鏈式反應（Real-timefluorescencepolymerasecASFV：非洲豬瘟病毒毒（AfricanswiBHQ：無熒光淬滅基團（Blackholequencher）Ct值：每個反應管內的熒光信號量達到設定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)DEPC：焦炭酸二乙酯（diethypyrocarbonate）FAM：羧基熒光素（CarboxyfluoresceiHEX：六氯-6-甲基熒光素（HexachPBS：磷酸鹽緩沖液（Phosphatebufferedsaline）PCR：聚合酶鏈式反應（polymeraseRNA：核糖核酸（RibonucleicROX：無活性熒光參考染料（Carboxy-X-rhodamin2Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNTEBuffer：Tris-EDTA緩沖液（Tris-EDTAbufferso選取商品化的病毒DNA與RNA共提取試劑盒并參照說明書進選取商品化的Taq酶擴增試劑盒并參照說明書進行配液與擴增。B646L-F1B646L-Probe1X64RX64R-F15’-GGTTCCAAAACAATATTGGCC-3’X64R-R15’-TATTTCACATCCGTGGCATCT-3’X64R-Probe1MGF-R1MGF-Probe1CY5-5’-CAGAAGACGGGGTTCGGATACA-3’-BHQ23超凈工作臺、離心機、電腦、實時熒光PCR儀及配套反應管（板）、組織研磨器、-20℃冰箱、微小，淋巴結選取出血嚴重的整體采集，將所采集樣品放入7.1.3口腔拭子樣品采集：用醫(yī)用將拭子浸入1ml50%甘油-PBS保存液中保存液中，剪去露出部分，蓋緊離心管蓋，密封后冷藏或冷7.3.3口腔拭子樣品、肛門拭子樣品：充分渦旋震蕩含有口腔拭子的管子30s，盡力擠壓拭子后，應管中蓋上PCR反應管蓋，轉移至樣本處理區(qū)備用。A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-反應液A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-酶混合液的制備見附錄A.5，4A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-反應液A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-酶混合液A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-內標8.2加樣（樣本處理區(qū)）待測樣品提取反應體系設為25μl195℃：15s9.1合理調整閾值線，不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進行5等固體廢棄物應在生物安全柜中密封包裝，經(jīng)表6擴增非洲豬瘟病毒HLJ/18株B646L基因全長(1941bp)，序列參見附錄B.1，將非洲豬瘟病毒B646L基連接于pCAGGS載體，構建重組質粒pCAGGS-3X；擴增非洲豬瘟病毒JS/LG/21株MGF_360-14L基因全長及其兩端序列(1321bp)，序列參見附錄B.3，將非洲豬瘟病毒MGF_360-14L基因全長及其兩端序列(1321bp)連接于pCAGGS載體，構建重組質粒pCAGGS-3M；用1×TE緩沖液將重組質粒pCAGGS-3P、pCAGGS-3X、pCAGGS-3M稀釋至分別約104copies/μl，保存于-20℃?zhèn)溆?。pCAGGS載體質粒圖譜及序列參見附錄B.4。PBS（0.01mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.4）配方見A.4A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-反應液A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-反應液配方見表A.4表A.4A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-7MGF-F1（10μM）MGF-R1（10μM）MGF-Probe1（10μM）A.5A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-酶混合液A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-酶混合液配方見表A.5表A.5A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-HighAffinityHotStartTaq(5U/μl)A.6A-ⅠH/ⅠL/Ⅱ-ExROX-內標人工合成一段隨機DNA片段（67bp）作為內標序列片段，序列參見約104copies/μl，保存于-20℃?zhèn)溆?。pUC57載體質粒圖譜及序列參見附錄B8B.1非洲豬瘟病毒HLJ/18株B64genecomplement(103618CDScomplement(103618..105/translation="MASGGAFCLIANDGKADKIILAQDLLNSRISNIKNVNKSYGKPDPEPTLSQIEETHLVHFNAHFKPYVPKVRPHTGTPTLGNKLTFGIPQYGDFFHDMVGHHILGACHSSWQDAPIQGTSQMGAHGQLQTFPRNGYDWDNQTPLEGAVYTLVDPFGRPIVPGTKNAYRNLVYYCEYPGERLYENVRFDVNGNSLDEYSSDVTTLVRKFCIPGDKMTGYKHLVGQEVSVEGTSGPLLCNIHDLHKPHQSKPILTDENDTQRTCSHTNPKFLSQHFPENSHNIQTAGKQDITPITDATYLDIRRNVHYSCNGPQTPKYYQPPLALWIKLRFWFNENVNLAIPSVSIPFGERFITIKLASQKDLVNEFPGLFVRQSRFIAGRPSRRNIRFKPWFIPGVINEISLTNNELYINNLFVTPEIHNLFVKRVRFSLIRVHKTQVTHTNNNHHDEKLMSALKWPIEYMFIGLKPTWNISDQNPHQHRDWHKFGHVVNAIMQPTHHAEISFQDRDTALPDACSSISDISPVTYPITLPIIKNISVTAHGINLIDKFPSKFCSSYIPFHYGGNAIKTPDDPGAMMITFALKPREEYQPSGHINVSRAREFYISWDTDYVGSITTADLVVSASAINFLLLQNGSAVLRYST"ATGGCATCAGGAGGAGCTTTTTGTCTTATTGCTAACGATGGGAAGGCCGACAAGATTATATTGGCCCAAGACTTGCTGAATAGCAGGATCTCTAACATTAAAAATGTGAACAAAAGTTATGGGAAACCCGATCCCGAACCCACTTTGAGTCAAATCGAAGAAACACATTTGGTGCATTTTAATGCGCATTTTAAGCCTTATGTTCCAGTAGGGTTTGAATACAATAAAGTACGCCCGCATACGGGTACCCCCACCTTGGGAAACAAGCTTACCTTTGGTATTCCCCAGTACGGAGACTTTTTCCATGATATGGTGGGCCATCATATATTGGGTGCATGTCATTCATCCTGGCAGGATGCTCCGATTCAGGGCACGTCCCAGATGGGGGCCCATGGGCAGCTTCAAACGTTTCCTCGCAACGGATATGACTGGGACAACCAAACACCCTTAGAGGGCGCCGTTTACACGCTTGTAGATCCTTTTGGAAGACCCATTGTACCCGGCACAAAGAATGCGTACCGAAACTTGGTTTACTACTGCGAATACCCCGGAGAACGACTTTATGAAAACGTAAGATTCGATGTAAATGGAAATTCCCTAGACGAATATAGTTCGGATGTCACAACGCTTGTGCGCAAATTTTGCATCCCAGGGGATAAAATGACTGGATATAAGCACTTGGTTGGCCAGGAGGTATCGGTGGAGGGAACCAGTGGCCCTCTCCTATGCAACATTCATGATTTGCACAAGCCGCACCAAAGCAAACCTATTCTTACCGATGAAAATGATACGCAGCGAACGTGTAGCCATACCAACCCGAAATTTCTTTCACAGCATTTTCCCGAGAACTCTCACAATATCCAAACAGCAGGTAAACAAGATATTACTCCTATCACGGACGCAACGTATCTGGACATAAGACGTAATGTTCATTACAGCTGTAATGGACCTCAAACCCCTAAATACTATCAGCCCCCTCTTGCGCTCTGGATTAAGTTGCGCTTTTGGTTTAATGAGAACGTGAACCTTGCTATTCCCTCAGTATCCATTCCCTTCGGCGAGCGCTTTATCACCATAAAGCTTGCATCGCAAAAGGATTTGGTGAATGAATTTCCTGGACTTTTTGTACGCCAGTCACGTTTTATAGCTGGACGCCC9CAGTAGACGCAATATACGCTTTAAACCATGGTTTATCCCAGGAGTCATTAATGAAATCTCGCTCACGAATAATGAACTTTACAACCTGTTTGTAACCCCTGAAATACACAACCTTTTTGTAAAACGCGTTCGCTTTTCGCTGATACGTGTCCATAAAACGCAGGTGACCCACACCAACAATAACCACCACGATGAAAAACTAATGTCTGCTCTTAAATGGCCCATTGAATATATGTTTATAGGATTAAAACCTACCTGGAACATCTCCGATCAAAATCCTCATCAACACCGAGATTGGCACAAGTTCGGACATGTTGTTAACGCCATTATGCAGCCCACTCACCACGCAGAGATAAGCTTTCAGGATAGAGATACAGCTCTTCCAGACGCATGTTCATCTATATCTGATATTAGCCCCGTTACGTATCCGATCACATTACCTATTATTAAAAACATTTCCGTAACTGCTCATGGTATCAATCTTATCGATAAATTTCTCCACTACGGAGGCAATGCGATTAAAACCACCCAGTGGTCATATTAACGTATCCAGAGCAAGAGAATTTTATATTAGTTGGGACACGGATTACGTGGGGTCTATCACTACGGCTGATCTTGTGGTATCGGCATCTGCTATTAACTTTCTTCTTCTTCAGAACGGTTCAGCTGTGCTGCGTTACAGTACCTAA注：劃線部分為質粒pCAGGS-3P構建用引物覆蓋部分，加粗部分為非洲豬瘟病毒基因Ⅰ/和Ⅱ型毒株鑒別三重熒光PCR檢測方法中FAM通道檢測B.2非洲豬瘟病毒SD/DY-I/21株X64R基因全長及其兩端序列(963bp)/translation="MLLYIVIIVAYVSYKLVPKQYWPILMFMAYMVYTHEKLDINERSGFWKYIIAKLFRCHGTGGTTTGCTGACTATTTGGAATTTATAGAAGCAAAAATAGATACTTTTACTAATAGCAGTGCATTATAAGTGATCAAAATTTAACATAAAAAAGGTACACATCAACATCATTCATTTGTTTCATGATGTTTGATTCATTACTTTCTACAATCACTGGGGGGGGGGTCTCTCATAGCTTTAGTATTGCTATGGTTTACTAATTATTATGTAGAATTTATAGGAGCAGATATATATGGTGGTAATTGTACTCTATAAGTTTATAAAAATTTCAGTATATTTTTTTTGTTAATATAACAGAAATGATTTAAATTACAAAAAAAAGAGAATCATCATGCTATTATACATTGTTATTATAGTAGCATATGTAAGTTATAAATTGGTTCAAATTAGATATAAATGAAAGATCCGGATTTTGGAAATATATTATAGCAAAACTATTCATTAAAAACATAATACGAAGTGTAATAATTGACTATTTTTTGTTGAATGGAAACTGTTTTTGAGTAATATGTTGAACATAATGGTTTTTATAGATGTTAAATCATTTGATTGTAGTAATTGTACTAAATGATGTGAGATATAAACCTAGTTCAATCAAAATTTAATTTTTTTATAAAAAGCTACAGAGTGTTTTATTAAACGTAGCTTATTTAAAAAGTTACACAATGTTAAAATCTCTACTTACTTTAATTCTTTGTGGGGTTTTAtTAACTTTATCCATATTATGGCTTATTACTTACCATGTAGAACTTATAGAAGCAATAGATGATTTCTACGACTGAAATATAGAATAGTTCATTTTCTATTTGTAAAATAATGATTTATATTCTCTCCTAAAAATACGATCGATCCTTTATATGCTTTGAAAACG注：劃線部分為質粒pCAGGS-3X構建用引物覆蓋部分，加粗部分為非洲豬瘟病毒基因Ⅰ/Ⅱ型重組B.3非洲豬瘟病毒JS/LG/21株MGF_360-14L基因全長及其genecomplement(275CDScomplement(27568..2/translation="MLSLQTLAKKVVACNYLSSDYDYTLQRFGLWWDLGPIHLCNNCKQVFSYKHLQCFSEDDLCLEAALVKELIRLFVDWGANPEYGLIRVPAVYLKRLCAELGGLTPVSEPRLLEILKEVARLKSCAGVLLGYDMFCHNPLLETVTRTTLDTVTYTIPLTGDTAHHLLTKFWFALALRHNFTKAIHYFYKRHKNHLYWRVACSLYFNNIFDIHELCREKEICISPNLMMKFACLREKNYAAIHRLGASLDYGMNLSIYNNNTLNMFFCIDLGGCRTAATAACGCTAGAAGGCTTGTTTATAAGACAGTCATAAGCAGTCTATAAGACAGTCTATAAGCAGTCTATAAGACAGTCTATGATCTATAACTATAATTTCTGGATGGGCTGTAAGATACTCTTCGGCTCGTTTCAGATTTTTTGAAGTATATGTCTTTAGCATATCATATATTTCCTGGGGTTCGGTTACATCTAATACCAAGGTCACATCACGGCTGAAAAGCTGCTTTACTAAGAAAATGTTGCTCAAGTTATACATATAAGCTTTGTGCGCAATGAGTTGTGCCCTATCAAAATCGGCAGCCCCCCAAATCAATACAGAAAAACATGTTTAAAGTATTATTGTTATAGATAGAAAGATTCATGCCATAATCGAGACTAGCCCCCAACCTATGACAGTAATAAATGGCCGCGTAATTTTTTTCCCGCAAGCAAGCAAATTTCATCATCAGATTAGGGCTGATGCAAATCTCTTTTTCACGACACAACTCGTGTATGTCAAAAATGTTATTAAAATAAAGGCTACAAGCTACCCGCCAATAGAGGTGATTTTTATGCCTTTTATAGAAATAGTGAATAGCCTTTGTAAAATTATGTCGTAATGCCAGGGCAAACCAAAACTTTGTTAATAGGTGGTGCGCCGTATCCCCCGTCAACGGAATGTTTGAACAGGTGTACGTAACTGTGTCTAAAGTGGTTCTAGTTACGGTTTCCAAGAGTGGATTATGACAAAACATGTCATAACCCAGCAGAACTCCTGCACAGTTCCAGAAGACGGGGTTCGGATACAGGCGTTAAGCCATATTCAGGATTTGCGCCCCAATCCACAAATAAACGTATAAGTTCAAGATTATCGCTCTTCACGGCCTTTACTAGCGCCGCTACAAAGATCATCCTCAGAAAAACACTGTAAATGTTTATACGAAAAAACTTGCTTACAATTGTTACATAGGTGAATAGGACCTAAATCCCACCACAAACCAAAACGCTGCAACGTATAATCATAGTCACTTGAAAGATAATTGCATGCCACAACTTTTTTGGCCAACGTTTGTAAAGACAACATACTAAGTTTAAAACATCTTAAATCTAAGCTAGCTAACTTTCAAGAAAACCCTCTATCCCTAAGAATATATCTTATAACTAGACTTATAGCAGTAAAAATCAACTTTGGTTATTCTTTTTAATATAAAACGTCTAATTACTTGCAAAGGACTATAAAGCCCA注：劃線部分為質粒pCAGGS-3M構建用引物覆蓋部分，加粗部分為非洲豬瘟病毒基因Ⅰ/Ⅱ型重組PropagationinE.coliGTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGCCGCGCGCCAGCCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCATCTCCAGCCTCGGGGCTGCCGCAGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTGTTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCGAGCTCATCGATGCATGGTACCCGGGCATGCTCGAGCTAGCAGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTAAAACATCAGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCAACATATGCCATATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGTGGCTATAAAGAGGTCATCAGTATATGAAACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAGAAAAGCCTTGACTTGAGGTTAGATTTTTTTTATATTTTGTTTTGTGTTATTTTTTTCTTTAACATCCCTAAAATTTTCCTTACATGTTTTACTAGCCAGATTTTTCCTCCTCTCCTGACTACTCCCAGTCATAGCTGTCCCTCTTCTCTTATGAAGATCCCTCGACCTGCAGCCCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCGGATCCGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCCGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTG注：加粗部分為豬流行性腹瀉病毒、豬A群輪狀病毒、豬delta冠狀病毒三重熒光RT-PCR檢測GAATTCGAGCTCGGTACCTCGCGAATGCATCTAGATATCGGATCCCGGGCCCGTCGACTGCAGAGGCCTGCATGCAAGCTTGGCCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAATCTGACAGTTACCA