(高清版)GBT 38483-2020 微生物源抗生素類次生代謝產(chǎn)物抗細菌活性測定 抑菌圈法

ICS07.080A21中華人民共和國國家標(biāo)準微生物源抗生素類次生代謝產(chǎn)物抗細菌活性測定抑菌圈法I國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準化管理委員會GB／T38483—2020本標(biāo)準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準由中國標(biāo)準化研究院提出并歸口。本標(biāo)準起草單位：中國計量大學(xué)、中國標(biāo)準化研究院。ⅠGB／T38483—2020微生物源抗生素類次生代謝產(chǎn)物抗細菌活性測定抑菌圈法本標(biāo)準規(guī)定了用抑菌圈法測定微生物源抗生素類次生代謝產(chǎn)物抗細菌活性的方法。本標(biāo)準適用于微生物源抗生素類次生代謝產(chǎn)物抗細菌活性測定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全要求3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1抑制中濃度對細菌的抑制率達到時的濃度。3.2抗細菌活性抑制細菌生長繁殖的能力。3.3抑菌圈固體培養(yǎng)基表面與試樣接觸的邊界處無菌繁殖的環(huán)帶區(qū)域。利用待測次生代謝產(chǎn)物在瓊脂平板中擴散使其周圍的細菌生長受到抑制形成的抑菌圈大小，計算5實驗室生物安全要求應(yīng)符合GB19489的規(guī)定。6試劑或材料除非另有規(guī)定，所用試劑均為分析純。1GB／T38483—20206.1水。GB/T6682一級水。6.2LB液體培養(yǎng)基。稱取胰蛋白陳10.0g、酵母提取物5.0g、氯化鈉10.0g,然后將上述各成分加于蒸餾水中煮沸溶解調(diào)節(jié)滅菌各成分加于1000mL蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH至7.0±0.2,分裝至250mL錐形瓶中，121℃滅菌20min。6.4指示菌標(biāo)準菌株：革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌革蘭氏陰性菌大腸埃希氏菌也可以采用其他標(biāo)準菌株作為供試菌，具體可參照實際情況進行選擇。7儀器設(shè)備7.1恒溫培養(yǎng)箱：溫度偏差在±1℃以內(nèi)。7.5分光光度計：檢測波長600nm。無菌錐形瓶容量無菌吸管具刻度具刻度或微量移液器。8操作步驟將菌株接種到裝有2mL的LB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃±1℃下培養(yǎng)12h~18h。用接種環(huán)挑取菌懸液以劃線法接種到LB固體平板上，37℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h~24h,然后從平板中挑取單菌落接種在LB固體培養(yǎng)基試管斜面內(nèi)，37℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h~24h,后將試管斜面貯存于1℃~4℃冰箱內(nèi)作為保存菌，保存期不超過一個月，每月傳代一次，傳代次數(shù)不超過10代。8.2菌懸液制備8.2.1用接種環(huán)取保存菌，以劃線法接種到LB固體平板上，37℃±1℃下培養(yǎng)24h。注：LB固體平板在1℃~4℃條件下保存，1周內(nèi)使用。8.2.2取LB液體培養(yǎng)基20mL加入容量為100mL的無菌錐形瓶內(nèi)，用接種環(huán)取8.2.1平皿上的單菌落接種在培養(yǎng)用并以此作為試驗菌懸液。采用分光光度計測定試驗菌懸液OD600為0.5~0.65或（其他）適當(dāng)?shù)姆椒y定菌懸液濃度。注：試驗菌懸液在1℃~4℃條件下保存，在4h內(nèi)使用。8.3供試樣品制備極性樣品直接用水充分溶解（非極性樣品加一定濃度的表面活性劑充分溶解配制成一定濃度的母液，經(jīng)無菌0.45μm濾膜過濾，然后用無菌水（或相應(yīng)的表面活性劑）按2倍或5倍濃度逐級稀釋，制備成至少5個不同濃度的待測溶液；逐級稀釋時應(yīng)確保既有抑制率大于50%分布的濃度點，也有抑制率小于50%分布的濃度點，現(xiàn)配現(xiàn)用。2GB／T38483—20208.4檢測平板制備將8.2.3中的菌懸液用冷卻至55℃左右的LB固體培養(yǎng)基按1∶10的比例稀釋，充分混勻后取15mL于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，輕輕搖動平板使菌液均勻鋪平，待其凝固后制成檢測平板，備用。8.5抑菌活性測定分別將無菌牛津杯輕輕地放在8.4制備的檢測平板中，而后用無菌吸管分別將8.3中制備的200μL不同濃度的供試樣品溶液加入牛津杯中，空白對照組加入200μL對應(yīng)的溶劑，每個處理重復(fù)5次。將平板正置于37℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h~18h，取出，用抑菌圈測量儀測量待測樣品和空白對照組形成的抑菌圈直徑。9結(jié)果計算式中：I—抑制率；D1—供試次生代謝產(chǎn)物平板中形成的抑菌圈直徑，單位為毫米（mmD2—空白對照平板中形成的抑菌圈直徑，單位為毫米（mm）。以五個平行樣的平均值為最終結(jié)果，計算結(jié)果保留到小數(shù)點后兩位。率的概率