GBT 34224-2017 生物產(chǎn)品中功能性微生物檢測(cè)

GB/T34224—2017生物產(chǎn)品中功能性微生物檢測(cè)Methodfordeterminationoffunctionalmicroorganisminbiologicproducts中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局GB/T34224—2017本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口。IlGB/T34224—2017生物產(chǎn)品中功能性微生物檢測(cè)1范圍本標(biāo)準(zhǔn)適用于生物產(chǎn)品中植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus母(Saccharomycescerevisiae)的檢驗(yàn)。下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文GB4789.1食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)總則GB4789.28食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T27405實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品微生物檢測(cè)RB/T151食品微生物定量檢測(cè)的測(cè)量不確定度評(píng)估指南SN/T0330出口食品微生物學(xué)檢驗(yàn)通則SN/T2632微生物菌種常規(guī)保藏技術(shù)規(guī)程SN/T2660食品微生物實(shí)驗(yàn)室菌種保藏方法3術(shù)語和定義3.1注：本標(biāo)準(zhǔn)中的生物產(chǎn)品特指功能性微生物經(jīng)過工業(yè)化生產(chǎn)擴(kuò)繁后加工制成的活菌制劑及添加了該類制劑的3.23.32GB/T34224—20174.2實(shí)驗(yàn)室生物安全要求應(yīng)符合GB19489的規(guī)定。4.3實(shí)驗(yàn)室人員應(yīng)滿足GB4789.1的規(guī)定。4.4菌株保存應(yīng)符合SN/T2632和SN/T2660的規(guī)定。4.5培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求應(yīng)符合G4.6實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制應(yīng)符合GB/T27405的規(guī)定。確定度評(píng)估按照RB/T151的要求執(zhí)行。5.1.2冰箱：2℃~5℃。5.1.10pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙。3GB/T34224—201710倍系列稀釋厭氧培養(yǎng)，37℃±1℃,48h±2h挑選平板上5個(gè)邊緣透明、整齊的菌落分別厭氧培養(yǎng)，37℃±1℃,24h±2h形態(tài)學(xué)鑒定生化鑒定報(bào)告稱取25g樣品，置于225mL生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min制成1:10的樣品勻液；或置于盛有225mL滅菌生理鹽水的無菌均質(zhì)杯中，8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min制成1:10的樣品勻液。應(yīng)先將其充分搖勻后，以無菌吸管吸取樣品25mL放入裝有225mL預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中，充分振搖，制成1:10的樣品勻液。5.4.2.1用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL,沿管壁緩慢注于裝有9mL生理鹽水的無菌試管中(注意吸管尖端不要觸及稀釋液),振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。5.4.2.2另取1mL無菌一次，即換用1次1mL滅菌吸管或吸頭。根據(jù)對(duì)待檢樣品菌含量的估計(jì)，選擇2個(gè)～3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度吸取樣品勻液4GB/T34224—20170.1mL接種于MRS瓊脂平板內(nèi)，使用涂布棒盡可能小心快速地涂布接種液于瓊脂表面，涂布棒不得接觸平皿邊緣。每個(gè)稀釋度接種2個(gè)平板。涂布后，將平板靜置10min使接種物完全被培養(yǎng)基吸收。翻轉(zhuǎn)平皿置于37℃±1℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h±2h。5.4.4菌落計(jì)數(shù)5.4.4.1選取特征菌落數(shù)在30CFU～300CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。5.4.4.2其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2,代表一個(gè)平板菌落數(shù)。5.4.4.3當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。5.4.5鑒定5.4.5.1菌落挑選和純培養(yǎng)挑選平板上5個(gè)邊緣透明、整齊的菌落分別轉(zhuǎn)入MRS肉湯培養(yǎng)基37℃±1℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h±2h后進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生化鑒定。5.4.5.2形態(tài)學(xué)鑒定革蘭氏染色，鏡檢。植物乳桿菌為革蘭氏陽性桿菌，呈直桿狀，長度3.0μm～8.0μm,單個(gè)、成對(duì)或成鏈狀，通常缺少鞭毛，無芽孢。5.4.5.3生化鑒定使用細(xì)菌生化鑒定試劑盒進(jìn)行生化鑒定。鑒定特征見附錄B中表B.1。乳桿菌屬常見菌種主要鑒別特征參見附錄C中表C.1。5.5結(jié)果計(jì)算5.5.1每個(gè)平板中植物乳桿菌的數(shù)量每個(gè)平板中植物乳桿菌菌落數(shù)的計(jì)算見式(1):式中：a——每塊平板上的植物乳桿菌菌落數(shù)；b——挑取后經(jīng)證實(shí)為植物乳桿菌的菌落數(shù)；A——挑取平板上用于驗(yàn)證的菌落數(shù)；C——平板上的所有特征菌落數(shù)?！?.5.2菌落總數(shù)的計(jì)算方法5.5.2.1若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板中植物乳桿菌菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每克(毫升)中菌落總數(shù)結(jié)果。5.5.2.2若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按式(2)計(jì)算：5GB/T34224—2017n?——第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))平板個(gè)數(shù)；菌落數(shù)小于100CFU時(shí)，以整數(shù)報(bào)告。菌落數(shù)大于或等于100CFU時(shí)，對(duì)第3位數(shù)字進(jìn)行修約6.1.10pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙。6GB/T34224—2017嗜酸乳桿菌的檢驗(yàn)程序見圖2。厭氧培養(yǎng)，37℃±1℃,48h±2h厭氧培養(yǎng)，37℃±1℃,24h±2h形態(tài)學(xué)鑒定報(bào)告1:10的樣品勻液；或置于盛有225mL滅菌生理鹽水的無菌均質(zhì)杯中，8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min制成1:10的樣品勻液。預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中，充分振搖，制成1:10的樣品勻液。6.4.2.1用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL,沿管壁緩慢注于裝有9mL生理鹽水的無菌試管中(注意吸管尖端不要觸及稀釋液),振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。6.4.2.2另取1mL無菌吸管或微量移液器吸頭，按上述操作順序，做10倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用1次1mL滅菌吸管或吸頭。7GB/T34224—2017根據(jù)對(duì)待檢樣品菌含量的估計(jì)，選擇2個(gè)～3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度吸取樣品勻液0.1mL接種于MRS瓊脂平板內(nèi)，使用涂布棒盡可能小心快速地涂布接種液于瓊脂表面，涂布棒不得接觸平皿邊緣。每個(gè)稀釋度接種2個(gè)平板。涂布后，將平板靜置10min使接種物完全被培養(yǎng)基吸收。翻轉(zhuǎn)平皿置于37℃±1℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h±2h。6.4.4菌落計(jì)數(shù)6.4.4.1選取特征菌落數(shù)在30CFU～300CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。6.4.4.2其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2,代表一個(gè)平板菌落數(shù)。6.4.4.3當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。6.4.5.1菌落挑選和純培養(yǎng)挑選平板上5個(gè)凸起、表面粗糙、邊緣卷曲的菌落分別轉(zhuǎn)入MRS肉湯培養(yǎng)基37℃±1℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h±2h后進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生化鑒定。6.4.5.2形態(tài)學(xué)鑒定革蘭氏染色，鏡檢。嗜酸乳桿菌為革蘭氏陽性桿菌，呈桿狀，兩端圓，長度0.9μm～6.0μm,單個(gè)、成對(duì)或成鏈狀，無鞭毛，無芽孢。6.4.5.3生化鑒定使用細(xì)菌生化鑒定試劑盒進(jìn)行生化鑒定。鑒定特征見附錄B中表B.2。乳桿菌屬常見菌種主要鑒別特征參見附錄C中表C.1。6.5結(jié)果計(jì)算6.5.1每個(gè)平板中嗜酸乳桿菌的數(shù)量每個(gè)平板中嗜酸乳桿菌菌落數(shù)的計(jì)算見式(3):式中：a——每塊平板上的嗜酸乳桿菌菌落數(shù)；b——挑取后經(jīng)證實(shí)為嗜酸乳桿菌的菌落數(shù)；A——挑取平板上用于驗(yàn)證的菌落數(shù)；C——平板上的所有特征菌落數(shù)?！?.5.2菌落總數(shù)的計(jì)算方法6.5.2.1若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板中嗜酸乳桿菌菌落數(shù)的8GB/T34224—2017平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每克(毫升)中菌落總數(shù)結(jié)果。6.5.2.2若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按式(4)計(jì)算：N——樣品中菌落數(shù)；…………∑C——平板(含適宜范圍菌落數(shù)的平板)菌落數(shù)之和；n?——第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))平板個(gè)數(shù)；n?——第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))平板個(gè)數(shù)；d——稀釋因子(第一稀釋度)。6.6.1結(jié)果判定若樣品菌落符合嗜酸乳桿菌形態(tài)學(xué)及生化鑒定的特征，可判定為嗜酸乳桿菌。6.6.2結(jié)果報(bào)告6.6.2.1定性報(bào)告在25g(mL)樣品中檢出或未檢出嗜酸乳桿菌。菌落數(shù)小于100CFU時(shí)，以整數(shù)報(bào)告。菌落數(shù)大于或等于100CFU時(shí)，對(duì)第3位數(shù)字進(jìn)行修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，采用兩位有效數(shù)字。7枯草芽孢桿菌7.1設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下。7.1.1恒溫培養(yǎng)箱：37℃±1℃。7.1.2冰箱：2℃~5℃。7.1.3恒溫水浴箱：80℃±1℃。7.1.4天平：感量為0.1g。7.1.5均質(zhì)器及無菌均質(zhì)袋、均質(zhì)杯。7.1.6振蕩器。7.1.7無菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸頭。7.1.8無菌錐形瓶：容量250mL、500mL。7.1.9無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。7.1.10顯微鏡：10倍～100倍。7.1.11pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙。7.2培養(yǎng)基和試劑7.2.1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：見A.3。7.2.2營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：見A.4。9GB/T34224—20177.2.5細(xì)菌生化鑒定試劑盒?？莶菅挎邨U菌的檢驗(yàn)程序見圖3。1:10的樣品勻液；或置于盛有225mL滅菌生理鹽水的無菌均質(zhì)杯中，8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min制成1:10的樣品勻液。預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中，充分振搖，制成1:10的樣品勻液。7.4.2.1用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL,沿管壁緩慢注于裝有9mL生理鹽水的無菌試管中(注意吸管尖端不要觸及稀釋液),振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合GB/T34224—2017均勻，制成1:100的樣品勻液。7.4.2.2另取1mL無菌吸管或微量移液器吸頭，按上述操作順序，做10倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用1次1mL滅菌吸管或吸頭。7.4.3培養(yǎng)根據(jù)對(duì)待檢樣品菌含量的估計(jì)，選擇2個(gè)～3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度水浴80℃±1℃維持10min,吸取菌液0.2mL接種于營養(yǎng)瓊脂平板內(nèi)，使用涂布棒盡可能小心快速地涂布接種液于瓊脂表面，涂布棒不得接觸平皿邊緣。每個(gè)稀釋度接種2個(gè)平板。涂布后，將平板靜置10min使接種物完全被培養(yǎng)基吸收。翻轉(zhuǎn)平皿置于37℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h±2h。7.4.4.1選取特征菌落數(shù)在20CFU～200CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于20CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于200CFU的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。7.4.4.2其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2,代表一個(gè)平板菌落數(shù)。7.4.4.3當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。7.4.5鑒定7.4.5.1菌落挑選和純培養(yǎng)挑選平板上5個(gè)表面粗糙、不透明，灰色或微黃色的菌落分別轉(zhuǎn)入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基37℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h±2h后進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生化鑒定。7.4.5.2形態(tài)學(xué)鑒定革蘭氏染色，鏡檢?？莶菅挎邨U菌為革蘭氏陽性桿菌，呈桿狀，長度1.5μm～3.0μm,無莢膜，周生鞭毛，有芽孢，芽孢橢圓形，中生或近中生，芽孢囊不明顯膨大。7.4.5.3生化鑒定使用細(xì)菌生化鑒定試劑盒進(jìn)行生化鑒定。鑒定特征見附錄B中表B.3。7.5.1每個(gè)平板中枯草芽孢桿菌的數(shù)量每個(gè)平板中枯草芽孢桿菌菌落數(shù)的計(jì)算見式(5):a——每塊平板上的枯草芽孢桿菌菌落數(shù)；b——挑取后經(jīng)證實(shí)為枯草芽孢桿菌的菌落數(shù)；A——挑取平板上用于驗(yàn)證的菌落數(shù)；C——平板上的所有特征菌落數(shù)。GB/T34224—20177.5.2菌落總數(shù)的計(jì)算方法7.5.2.1若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板中枯草芽孢桿菌菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每克(毫升)中菌落總數(shù)結(jié)果。7.5.2.2若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按式(6)計(jì)算：N——樣品中菌落數(shù)；…………ΣC——平板(含適宜范圍菌落數(shù)的平板)菌落數(shù)之和；n?——第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))平板個(gè)數(shù)；n?——第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))平板個(gè)數(shù)；d——稀釋因子(第一稀釋度)。若樣品菌落符合枯草芽孢桿菌形態(tài)學(xué)及生化鑒定的特征，可判定為枯草芽孢桿菌。7.6.2結(jié)果報(bào)告在25g(mL)樣品中檢出或未檢出枯草芽孢桿菌。菌落數(shù)小于100CFU時(shí)，以整數(shù)報(bào)告。菌落數(shù)大于或等于100CFU時(shí)，對(duì)第3位數(shù)字進(jìn)行修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，采用兩位有效數(shù)字。8地衣芽孢桿菌8.1設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下。8.1.1恒溫培養(yǎng)箱：37℃±1℃。8.1.2冰箱：2℃~5℃。8.1.3恒溫水浴箱：80℃±1℃。8.1.4天平：感量為0.1g。8.1.5均質(zhì)器及無菌均質(zhì)袋、均質(zhì)杯。8.1.6振蕩器。8.1.7無菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸頭。8.1.8無菌錐形瓶：容量250mL、500mL。8.1.9無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。8.1.10顯微鏡：10倍～100倍。8.1.11pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙。GB/T34224—20178.2.5細(xì)菌生化鑒定試劑盒。地衣芽孢桿菌的檢驗(yàn)程序見圖4。報(bào)告1:10的樣品勻液；或置于盛有225mL滅菌生理鹽水的無菌均質(zhì)杯中，8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min制成1:10的樣品勻液。預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中，充分振搖，制成1:10的樣品勻液。GB/T34224—20178.4.2樣品稀釋8.4.2.1用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL,沿管壁緩慢注于裝有9mL生理鹽水的無菌試管中(注意吸管尖端不要觸及稀釋液),振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。8.4.2.2另取1mL無菌吸管或微量移液器吸頭，按上述操作順序，做10倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用1次1mL滅菌吸管或吸頭。根據(jù)對(duì)待檢樣品菌含量的估計(jì)，選擇2個(gè)～3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度水浴80℃±1℃維持10min,吸取菌液0.2mL接種于營養(yǎng)瓊脂平板內(nèi)，使用涂布棒盡可能小心快速地涂布接種液于瓊脂表面，涂布棒不得接觸平皿邊緣。每個(gè)稀釋度接種2個(gè)平板。涂布后，將平板靜置10min使接種物完全被培養(yǎng)基吸收。翻轉(zhuǎn)平皿置于37℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h±2h。8.4.4菌落計(jì)數(shù)8.4.4.1選取特征菌落數(shù)在20CFU～200CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于20CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于200CFU的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。8.4.4.2其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2,代表一個(gè)平板菌落數(shù)。8.4.4.3當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。8.4.5.1菌落挑選和純培養(yǎng)挑選平板上5個(gè)白色不透明、濕潤、邊緣光滑的菌落分別轉(zhuǎn)入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基37℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h±2h后進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生化鑒定。8.4.5.2形態(tài)學(xué)鑒定革蘭氏染色，鏡檢。地衣芽孢桿菌為革蘭氏陽性桿菌，呈桿狀，長度1.5pm～3.5μm,單個(gè)、成對(duì)或短鏈狀排列，有芽孢，芽孢橢圓形，中生或近中生，芽孢囊不明顯膨大。8.4.5.3生化鑒定用細(xì)菌生化鑒定試劑盒進(jìn)行生化鑒定。鑒定特征見附錄B中表B.4。8.5結(jié)果計(jì)算8.5.1每個(gè)平板中地衣芽孢桿菌的數(shù)量每個(gè)平板中地衣芽孢桿菌菌落數(shù)的計(jì)算見式(7):式中：a——每塊平板上的地衣芽孢桿菌菌落數(shù)；…………GB/T34224—2017b——挑取后經(jīng)證實(shí)為地衣芽孢桿菌的菌落數(shù)；A——挑取平板上用于驗(yàn)證的菌落數(shù)；C——平板上的所有特征菌落數(shù)。N——樣品中菌落數(shù)；∑C——平板(含適宜范圍菌落數(shù)的平板)菌落數(shù)之和；n?——第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))平板個(gè)數(shù)；n?——第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))平板個(gè)數(shù)；d——稀釋因子(第一稀釋度)。在25g(mL)樣品中檢出或未檢出地衣芽孢桿菌。菌落數(shù)小于100CFU時(shí)，以整數(shù)報(bào)告。菌落數(shù)大于或等于100CFU時(shí)，對(duì)第3位數(shù)字進(jìn)行修約9糞腸球菌9.1.2冰箱：2℃~5℃。9.1.9顯微鏡：10倍～100倍。GB/T34224—20179.1.10pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙。9.2.3無菌生理鹽水：見A.10。9.2.5細(xì)菌生化鑒定試劑盒。糞腸球菌的檢驗(yàn)程序見圖5。1:10的樣品勻液；或置于盛有225mL滅菌生理鹽水的無菌均質(zhì)杯中，8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min制成1:10的樣品勻液。應(yīng)先將其充分搖勻后，以無菌吸管吸取樣品25mLGB/T34224—2017預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中，充分振搖，制成1:10的樣品勻液。9.4.2樣品稀釋無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL,沿管壁緩慢注于裝有9mL生理鹽水的無菌試管中(注意吸管尖端不要觸及稀釋液),振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。9.4.2.2另取1mL無菌吸管或微量移液器吸頭，按上述操作順序，做10倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用1次1mL滅菌吸管或吸頭。9.4.3培養(yǎng)根據(jù)對(duì)待檢樣品菌含量的估計(jì)，選擇2個(gè)～3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度吸取樣品勻液0.1mL接種于KF鏈球菌瓊脂平板內(nèi)，使用涂布棒盡可能小心快速地涂布接種液于瓊脂表面，涂布棒不得接觸平皿邊緣。每個(gè)稀釋度接種2個(gè)平板。涂布后，將平板靜置10min使接種物完全被培養(yǎng)基吸收。翻轉(zhuǎn)平皿置于37℃±1℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h±2h。9.4.4菌落計(jì)數(shù)9.4.4.1選取特征菌落數(shù)在30CFU～300CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。9.4.4.2其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2,代表一個(gè)平板菌落數(shù)。9.4.4.3當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。9.4.5鑒定9.4.5.1菌落挑選和純培養(yǎng)挑選平板上5個(gè)暗紅色至粉紅色，表面光滑，周邊整齊菌落分別轉(zhuǎn)入腸球菌肉湯培養(yǎng)基37℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)增菌培養(yǎng)24h±2h后進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生化鑒定。9.4.5.2形態(tài)學(xué)鑒定革蘭氏染色，鏡檢。糞腸球菌為革蘭氏陽性球菌，呈球形或橢圓形，直徑0.5μm～1.0μm,成對(duì)或短鏈狀排列，無芽孢。9.4.5.3生化鑒定使用細(xì)菌生化鑒定試劑盒進(jìn)行生化鑒定。鑒定特征見附錄B中表B.5。腸球菌屬常見菌種主要鑒別特征參見附錄C中表C.2。9.5結(jié)果計(jì)算9.5.1每個(gè)平板中糞腸球菌的數(shù)量每個(gè)平板中糞腸球菌菌落數(shù)的計(jì)算見式(9):GB/T34224—2017式中：a——每塊平板上的糞腸球菌菌落數(shù)；b——挑取后經(jīng)證實(shí)為糞腸球菌的菌落數(shù)；A——挑取平板上用于驗(yàn)證的菌落數(shù)；C——平板上的所有特征菌落數(shù)。9.5.2菌落總數(shù)的計(jì)算方法9.5.2.1若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板中糞腸球菌菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每克(毫升)中菌落總數(shù)結(jié)果。9.5.2.2若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按式(10)計(jì)算：式中：N——樣品中菌落數(shù)；…………∑C——平板(含適宜范圍菌落數(shù)的平板)菌落數(shù)之和；n1——第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))平板個(gè)數(shù)；n?——第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))平板個(gè)數(shù)；d——稀釋因子(第一稀釋度)。9.6報(bào)告9.6.1結(jié)果判定若樣品菌落符合糞腸球菌形態(tài)學(xué)及生化鑒定的特征，可判定為糞腸球菌。9.6.2結(jié)果報(bào)告9.6.2.1定性報(bào)告在25g(mL)樣品中檢出或未檢出糞腸球菌。9.6.2.2定量報(bào)告菌落數(shù)小于100CFU時(shí)，以整數(shù)報(bào)告。菌落數(shù)大于或等于100CFU時(shí)，對(duì)第3位數(shù)字進(jìn)行修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，采用兩位有效數(shù)字。10屎腸球菌10.1設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下。10.1.1恒溫培養(yǎng)箱和恒溫厭氧培養(yǎng)箱：37℃±1℃。10.1.2冰箱：2℃~5℃。10.1.4均質(zhì)器及無菌均質(zhì)袋、均質(zhì)杯。10.1.5振蕩器。10.1.6無菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸頭。10.1.7無菌錐形瓶：容量250mL、500mL。GB/T34224—201710.1.10pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙。10.2.1屎腸球菌選擇性培養(yǎng)基：見A屎腸球菌的檢驗(yàn)程序見圖6。形態(tài)學(xué)鑒定生化鑒定報(bào)告1:10的樣品勻液；或置于盛有225mL滅菌生理鹽水的無菌均質(zhì)杯中，8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min制成1:10的樣品勻液。GB/T34224—2017應(yīng)先將其充分搖勻后，以無菌吸管吸取樣品25mL放入裝有225mL生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中，充分振搖，制成1:10的樣品勻液。10.4.2.1用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL,沿管壁緩慢注于裝有9mL生理鹽水的無菌試管中(注意吸管尖端不要觸及稀釋液),振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。10.4.2.2另取1mL無菌吸管或微量移液器吸頭，按上述操作順序，做10倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用1次1mL滅菌吸管或吸頭。根據(jù)對(duì)待檢樣品菌含量的估計(jì)，選擇2個(gè)～3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度吸取樣品勻液0.1mL接種于屎腸球菌選擇性平板內(nèi)，使用涂布棒盡可能小心快速地涂布接種液于瓊脂表面，涂布棒不得接觸平皿邊緣。每個(gè)稀釋度接種2個(gè)平板。涂布后，將平板靜置10min使接種物完全被培養(yǎng)基吸收。翻轉(zhuǎn)平皿置于37℃±1℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h±2h。10.4.4.1選取特征菌落數(shù)在30CFU～300CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。以2,代表一個(gè)平板菌落數(shù)。挑選平板上5個(gè)暗紅色至粉紅色、表面光滑凸起，周邊整齊的菌落分別轉(zhuǎn)入腸球菌肉湯培養(yǎng)基37℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h±2h后進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生化鑒定。使用細(xì)菌生化鑒定試劑盒進(jìn)行生化鑒定。鑒定特征見附錄B中表B.6。腸球菌屬常見菌種主要鑒別特征參見附錄C中表C.2。每個(gè)平板中屎腸球菌菌落數(shù)的計(jì)算見式(11):GB/T34224—2017a——每塊平板上的屎腸球菌菌落數(shù)；…………b——挑取后經(jīng)證實(shí)為屎腸球菌的菌落數(shù)；A——挑取平板上用于驗(yàn)證的菌落數(shù)；C——平板上的所有特征菌落數(shù)。10.5.2菌落總數(shù)的計(jì)算方法10.5.2.1若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板中屎腸球菌菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每克(毫升)中菌落總數(shù)結(jié)果。10.5.2.2若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按式(12)計(jì)算：ΣC——平板(含適宜范圍菌落數(shù)的平板)菌落數(shù)之和；n?——第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))平板個(gè)數(shù)；n?——第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))平板個(gè)數(shù)；d——稀釋因子(第一稀釋度)。10.6.1結(jié)果判定若樣品菌落符合屎腸球菌形態(tài)學(xué)及生化鑒定的特征，可判定為屎腸球菌。10.6.2結(jié)果報(bào)告在25g(mL)樣品中檢出或未檢出屎腸球菌。菌落數(shù)小于100CFU時(shí)，以整數(shù)報(bào)告。菌落數(shù)大于或等于100CFU時(shí)，對(duì)第3位數(shù)字進(jìn)行修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，采用兩位有效數(shù)字。11產(chǎn)朊假絲酵母11.1設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下。11.1.1恒溫培養(yǎng)箱：28℃±1℃。11.1.2冰箱：2℃~5℃。11.1.3天平：感量為0.1g。11.1.4均質(zhì)器及無菌均質(zhì)袋、均質(zhì)杯。11.1.5振蕩器。GB/T34224—201711.1.10pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙。28℃±1℃,72h±2h報(bào)告1:10的樣品勻液；或置于盛有225mL滅菌生理鹽水的無菌均質(zhì)杯中，8000r/min～10000質(zhì)1min～2min制成1:10的樣品勻液。GB/T34224—2017應(yīng)先將其充分搖勻后，以無菌吸管吸取樣品25mL放入裝有225mL生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中，充分振搖，制成1:10的樣品勻液。11.4.2.1用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL,沿管壁緩慢注于裝有9mL生理鹽水的無菌試管中(注意吸管尖端不要觸及稀釋液),振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。11.4.2.2另取1mL無菌吸管或微量移液器吸頭，按上述操作順序，做10倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用1次1mL滅菌吸管或吸頭。根據(jù)對(duì)待檢樣品菌含量的估計(jì)，選擇2個(gè)～3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度吸取樣品勻液0.2mL接種于孟加拉紅瓊脂平板內(nèi)，使用涂布棒盡可能小心快速地涂布接種液于瓊脂表面，涂布棒不得接觸平皿邊緣。每個(gè)稀釋度接種2個(gè)平板。涂布后，將平板靜置10min使接種物完全被培養(yǎng)基吸收。翻轉(zhuǎn)平皿置于28℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h±2h。11.4.4.1選取特征菌落數(shù)在10CFU～150CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于10CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于150CFU的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩以2,代表一個(gè)平板菌落數(shù)。挑選平板上5個(gè)紅色、平滑、邊緣齊整的菌落分別接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基中，28假菌絲或有隔菌絲。使用酵母菌生化鑒定試劑盒進(jìn)行生化鑒定。鑒定特征見附錄B中表B.7。每個(gè)平板中產(chǎn)朊假絲酵母菌落數(shù)的計(jì)算見式(13):GB/T34224—2017式中：…………a——每塊平板上的產(chǎn)朊假絲酵母菌落數(shù)；b——挑取后經(jīng)證實(shí)為產(chǎn)朊假絲酵母的菌落數(shù)；A——挑取平板上用于驗(yàn)證的菌落數(shù)；C——平板上的所有特征菌落數(shù)。11.5.2菌落總數(shù)的計(jì)算方法11.5.2.1若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板中產(chǎn)朊假絲酵母菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每克(毫升)中菌落總數(shù)結(jié)果。11.5.2.2若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按式(14)計(jì)算：式中：N——樣品中菌落數(shù)；…………∑C——平板(含適宜范圍菌落數(shù)的平板)菌落數(shù)之和；n?——第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))平板個(gè)數(shù)；n?——第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))平板個(gè)數(shù)；d——稀釋因子(第一稀釋度)。11.6.1結(jié)果判定若樣品菌落符合產(chǎn)朊假絲酵母形態(tài)學(xué)及生化鑒定的特征，可判定為產(chǎn)朊假絲酵母。11.6.2結(jié)果報(bào)告11.6.2.1定性報(bào)告在25g(mL)樣品中檢出或未檢出產(chǎn)朊假絲酵母。11.6.2.2定量報(bào)告菌落數(shù)小于100CFU時(shí)，以整數(shù)報(bào)告。菌落數(shù)大于或等于100CFU時(shí)，對(duì)第3位數(shù)字進(jìn)行修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，采用兩位有效數(shù)字。12釀酒酵母12.1設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下。12.1.1恒溫培養(yǎng)箱：28℃±1℃。12.1.2冰箱：2℃~5℃。12.1.3天平：感量為0.1g。12.1.4均質(zhì)器及無菌均質(zhì)袋、均質(zhì)杯或滅菌乳缽。12.1.5振蕩器。GB/T34224—201712.1.10pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙。釀酒酵母的檢驗(yàn)程序見圖8。瓊脂平板內(nèi)28℃±1℃,72h±2h菌落計(jì)數(shù)形態(tài)學(xué)鑒定報(bào)告稱取25g樣品，置于225mL生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min制成1:10的樣品勻液；或置于盛有225mL滅菌生理鹽水的無菌均質(zhì)杯中，8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min制成1:10的樣品勻液。GB/T34224—2017應(yīng)先將其充分搖勻后，以無菌吸管吸取樣品25mL放入裝有225mL生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中，充分振搖，制成1:10的樣品勻液。12.4.2樣品稀釋12.4.2.1用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL,沿管壁緩慢注于裝有9mL生理鹽水的無菌試管中(注意吸管尖端不要觸及稀釋液),振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。12.4.2.2另取1mL無菌吸管或微量移液器吸頭，按上述操作順序，做10倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用1次1mL滅菌吸管或吸頭。根據(jù)對(duì)待檢樣品菌含量的估計(jì)，選擇2個(gè)～3個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度吸取樣品勻液0.2mL接種于孟加拉紅瓊脂平板內(nèi)，使用涂布棒盡可能小心快速地涂布接種液于瓊脂表面，涂布棒不得接觸平皿邊緣。每個(gè)稀釋度接種2個(gè)平板。涂布后，將平板靜置10min使接種物完全被培養(yǎng)基吸收。翻轉(zhuǎn)平皿置于28℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h±2h。12.4.4.1選取特征菌落數(shù)在10CFU～150CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于10CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于150CFU的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。12.4.4.2其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2,代表一個(gè)平板菌落數(shù)。12.4.5.1菌落挑選和純培養(yǎng)挑選平板上5個(gè)菌落大、紅色、平滑、邊緣齊整的菌落分別接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基中，28℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)增菌培養(yǎng)24h～48h后進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生化鑒定。12.4.5.2形態(tài)學(xué)鑒定鏡檢。釀酒酵母呈卵圓形或圓形，直徑5.0μm～10.0μm,單個(gè)、成雙或成簇排列，多邊芽殖。12.4.5.3生化鑒定使用酵母菌生化鑒定試劑盒進(jìn)行生化鑒定。鑒定特征見附錄B中表B.8。12.5結(jié)果計(jì)算12.5.1每個(gè)平板中釀酒酵母的數(shù)量每個(gè)平板中釀酒酵母菌落數(shù)的計(jì)算見式(15):GB/T34224—2017式中：a——每塊平板上的釀酒酵母菌落數(shù)；b——挑取后經(jīng)證實(shí)為釀酒酵母的菌落數(shù)；A——挑取平板上用于驗(yàn)證的菌落數(shù)；C——平板上的所有特征菌落數(shù)。12.5.2菌落總數(shù)的計(jì)算方法12.5.2.1若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板中釀酒酵母菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每克(毫升)中菌落總數(shù)結(jié)果。12.5.2.2若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按式(16)計(jì)算：N——樣品中菌落數(shù)；…………∑C平板(含適宜范圍菌落數(shù)的平板)菌落數(shù)之和；n?——第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))平板個(gè)數(shù)；n?——第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))平板個(gè)數(shù)；d——稀釋因子(第一稀釋度)。12.6.1結(jié)果判定若樣品菌落符合釀酒酵母形態(tài)學(xué)及生化鑒定的特征，可判定為釀酒酵母。12.6.2結(jié)果報(bào)告12.6.2.1定性報(bào)告在25g(mL)樣品中檢出或未檢出釀酒酵母。菌落數(shù)小于100CFU時(shí)，以整數(shù)報(bào)告。菌落數(shù)大于或等于100CFU時(shí)，對(duì)第3位數(shù)字進(jìn)行修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，采用兩位有效數(shù)字。GB/T34224—2017(規(guī)范性附錄)培養(yǎng)基和試劑A.1MRS瓊脂培養(yǎng)基蛋白胨牛肉膏酵母浸膏葡萄糖吐溫-80檸檬酸銨乙酸鈉硫酸鎂硫酸錳磷酸氫二鉀蒸餾水20.02.05.00.10.052.015.0gggggggA.1.2制法將上述成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，補(bǔ)足蒸餾水至1000mL,于25℃時(shí)調(diào)節(jié)pH至7.3±0.2,分裝于適宜容器中，121℃滅菌15min。A.2MRS肉湯培養(yǎng)基A.2.1成分蛋白胨牛肉膏酵母浸膏葡萄糖吐溫-80檸檬酸銨乙酸鈉硫酸鎂硫酸錳磷酸氫二鉀蒸餾水20.0g2.0g0.05g2.0gA.2.2制法將上述成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，補(bǔ)足蒸餾水至1000mL,于25℃時(shí)調(diào)節(jié)pH至7.3±0.2,分GB/T34224—2017裝于適宜容器中，121℃滅菌15min。A.3營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基A.3.1成分蛋白胨牛肉膏氯化鈉蒸餾水5.0gggmLA.3.2制法將上述成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，補(bǔ)足蒸餾水至1000mL,于25℃時(shí)調(diào)節(jié)pH至7.2±0.2,分裝于適宜容器中，121℃滅菌30min。A.4營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基A.4.1成分蛋白胨牛肉膏氯化鈉蒸餾水A.4.2制法將上述成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，補(bǔ)足蒸餾水至1000mL,于25℃時(shí)調(diào)節(jié)pH至7.2±0.2,分裝于適宜容器中，121℃滅菌30min。A.5KF鏈球菌瓊脂培養(yǎng)基A.5.1成分月示蛋白胨麥芽糖酵母浸膏甘油磷酸鈉氯化鈉溴甲酚紫疊氮化鈉2,3,5-氯化三苯四氮唑蒸餾水20.010.010.05.01.013.00.40.1gggggmLGB/T34224—2017A.5.2制法將上述成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，補(bǔ)足蒸餾水至1000mL,于25℃時(shí)調(diào)節(jié)pH至7.2±0.2,分裝于適宜容器中，煮沸5min,冷至50℃左右，傾入無菌平皿，備用。A.6屎腸球菌選擇性培養(yǎng)基A.6.1成分胰蛋白胨酵母浸膏葡萄糖磷酸氫二鈉磷酸氫二鉀溴甲酚紫疊氮化鈉2,3,5-氯化三苯四氮唑蒸餾水20.0g2.0g4.0g4.0g20.0gA.6.2制法將上述成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，補(bǔ)足蒸餾水至1000mL,于25℃時(shí)調(diào)節(jié)pH至7.4±0.2,分裝于適宜容器中，煮沸5min,冷至50℃左右，傾入無菌平皿，備用。A.7腸球菌肉湯培養(yǎng)基A.7.1成分牛肉浸膏酵母浸膏牛膽粉氯化鈉檸檬酸鈉七葉苷檸檬酸鐵銨疊氮化鈉蒸餾水3.05.010.05.01.00.25gggggmLA.7.2制法將上述成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，補(bǔ)足蒸餾水至1000mL,于25℃時(shí)調(diào)節(jié)pH至7.1±0.2,分裝于適宜容器中，121℃滅菌30min。GB/T34224—2017A.8孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基A.8.1成分蛋白胨5.0g葡萄糖10.0g磷酸二氫鉀1.0g硫酸鎂0.5g瓊脂孟加拉紅0.033g氯霉素0.1g蒸餾水1000mLA.8.2制法將上述成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，補(bǔ)足蒸餾水至1000mL,分裝于適宜容器中，121℃高壓滅菌15min,避光保存?zhèn)溆?。A.9麥芽汁液體培養(yǎng)基A.9.1成分麥芽浸粉氯霉素蒸餾水A.9.2制法gmL將上述成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，補(bǔ)足蒸餾水至1000mL,于25℃時(shí)調(diào)節(jié)pH至5.6±0.2,分裝于適宜容器中，121℃滅菌30min。A.10無菌生理鹽水A.10.1成分氯化鈉蒸餾水A.10.2制法稱取8.5g氯化鈉溶于1000A.11革蘭氏染色A.11.1結(jié)晶紫染色液A.11.1.1成分結(jié)晶紫mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min。GB/T34224—20171%草酸銨水溶液80mLA.11.1.2制法A.11.2革蘭氏碘液A.11.2.1成分碘化鉀2g蒸餾水300mLA.11.2.2制法A.11.3.1成分蒸餾水90mLA.11.3.2制法A.11.4染色法GB/T34224—2017(規(guī)范性附錄)功能性微生物生化鑒定特征B.1植物乳桿菌生化鑒定特征表B.1植物乳桿菌生化鑒定特征植物乳桿菌植物乳桿菌甘油—纖維二糖十赤蘚醇一麥芽糖十D-阿拉伯糖一乳糖十L-阿拉伯糖一蜜二糖十核糖十蔗糖十D-木糖一海藻糖十L-木糖一菊糖—葡萄糖十棉籽糖十半乳糖十淀粉—果糖十糖原一甘露糖十木