SN∕T 4781-2017 出口食品和飼料中產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌檢測方法 實時熒光PCR法

出口食品和飼料中產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌檢測方法實時熒光PCR法I本標準起草單位：中華人民共和國江蘇出入境檢驗檢疫局、中華人民共和國上海出入境檢驗檢1出口食品和飼料中產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌檢測方法實時熒光PCR法本標準規(guī)定了出口食品和飼料中產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌的實時熒光PCR快速檢測方法。本標準適用于出口食品和飼料中產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌(O157、0104、0111、026、0145和O103)的檢測。下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T27403實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分于生物學檢測下列術(shù)語和定義適用于本文件。腸出血性大腸埃希氏菌Shigatoxin-producingEscherichiacolicausingtheattachingand4方法提要對樣品中微生物進行增菌培養(yǎng)后提取核酸，采用實時熒光PCR方法對志賀毒素編碼基因stx和緊23置于一10℃~-20℃保存。非冷凍的易腐樣品若不能及時檢驗，應(yīng)置于2℃~5℃冰箱保存，在24h48.2樣品制備8.2.1固體和半固體樣品稱取25g樣品，放入盛有225mLmTSB的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min,制成1:10樣品勻液，或放入盛有225mLmTSB的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min,制成1:10的樣品勻液。用無菌吸管吸取25mL樣品置于盛有225mLmTSB的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)預(yù)置適當數(shù)量無菌玻璃珠)中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。稱取25g或25mL樣品，分別放入盛有225mLBPW的無菌均質(zhì)杯袋)或錐形瓶中，按照8.2.1或8.2.2步驟，充分混勻。將8.2制備的樣品放于36℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h~24h。8.4核酸提取取8.3增菌液1mL,加到1.5mL無菌離心管中。12000g離心Imin;吸棄上清，取沉淀，加1h;加100μLNaCl(5mol/L),混勻，加80pLCTAB/Na勻，65℃溫浴10min;加等體積三氯甲院/異戊醇(體積比24:1),混勻，12000g離心10min;取上清液，加0.6倍體積異丙醇，輕輕混勻，12000g離心1o0min;取沉淀，用70%乙醇清洗2次。干燥，加100pLTE溶液溶解，立即用于熒光PCR反應(yīng)或貯存-20℃?zhèn)溆?。也可采用等效的商品化核酸提取試劑盒并按其說明提取核酸。8.5實時熒光PCR8.5.1PCR反應(yīng)體系實時熒光PCR反應(yīng)所用引物和探針見附錄BPCR反應(yīng)體系見表1。每個DNA樣品做2個平行管。加樣時應(yīng)使樣品DNA溶液完全落入反應(yīng)液中，不要粘附于壁上，加樣后盡快蓋緊管蓋。TaqManUniversalMast引物(上游)引物(下游)2———5的大腸埃希氏菌為陰性對照，以無菌水為試劑空白對照?？商崆疤崛φ站甑哪０錎NA并儲存在實時熒光PCR反應(yīng)參數(shù)為：50℃/2min;預(yù)變性95℃/10min,45個循環(huán)為95℃/15s,60℃/線剛好超過正常陰性樣品擴增曲線的最高點為準。陽性對照：各基因檢測Ct值<30。首先檢測stx(stx1、stx2)基因和eae基因，對于tx基因陽性[sta1和(或)stx2陽性]和eae基因陽性的樣品繼續(xù)進行rfbE(O157)、wzxO104)、wbdl(O111)wzx(026)、ihz1(0145)和wzx(01O血清組編碼基因的檢測?；駽t值<35,則判定為該基因陽性。Ct值在35～40之間，應(yīng)重做實時熒光PCR擴增。再次擴增后的結(jié)果Ct值仍小于40,并有典型的擴增曲線，且對照結(jié)果均正常，則可判定該基因為stx基因陽性的樣本按照附錄C的步驟進行確證。結(jié)果表述見表2。6stx陰性25g(mL)樣品中未檢出產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌stx陽性，但未分離到STEC菌株stx陽性，到STEC菌株25g(mL)樣品中檢出產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌25g(mL)樣品中檢出腸出血性大腸埃希氏菌25g(mL)樣品中檢出產(chǎn)志賀毒素大腸為了保護實驗室人員的安全，應(yīng)由具備資格的工作人員進行操作，所有培養(yǎng)物和廢棄物應(yīng)參照7將A.1.1.1中各成分溶于1000mL蒸餾水中，加熱溶解，校正pH至8將A.2.1中各成分溶于1000mL蒸餾水中，加熱溶解，校正pH至7.4±0.2,121℃高壓滅菌鹽類兩瓶[ST160(S)]各加入5mL無菌水中攪拌混勻，或取增補劑一瓶[ST162(S)]加入10mL無菌水中該成品平板在室溫可保存一天或在冰箱內(nèi)貯存?zhèn)€月(2C~8℃,避光)。未使用補劑在2℃~8℃環(huán)境中可保持2個月瓊脂稱取干粉29.2g溶于1000mL蒸餾水中，充分攪拌混勻。加熱至100℃,不停攪拌，使其完全溶解。切勿加熱超過100℃,切勿121℃高壓滅菌。若使用微波爐加熱，應(yīng)將培養(yǎng)后的培養(yǎng)基冷卻至45℃~50℃,輕輕地搖動均勻，傾注平皿，使其凝固29.2g/L的比例擴大或縮小制備培養(yǎng)基的量。該成品平板在室溫可保存一天或在冰箱內(nèi)貯存2周(2℃~8℃,避光)。9A.5.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基(山梨醇麥康凱瓊脂)瓊脂A.5.2.1成分96%乙醇g將頭孢克肟溶于酒精中，靜置1h待其充分溶解后過濾除菌。分裝試管，儲存于-20年。解凍后的頭孢克肟溶液不應(yīng)凍存，且在2℃~8℃下有效期14d。將1mL亞碲酸鉀溶液(A.5.2)和10mL頭孢克肟溶液(A.5.3)加入1000mL冷卻至45℃±1℃稱取本品64.5g,加熱溶解于1000mL蒸餾水中，加熱煮沸1min,校正pH至7.4±0.1,分裝于目標基因上游引物、下游引物和探針序列(5'-3’)°上游引物：TTTGTYACTGTSA下游引物：CCCCAGTTCARWGTRAGRTC探針：CTGGATGATCTCAG上游引物：TTTGTYACTGTSA下游引物：CCCCAGTTCARWGTRAGRTC探針：ATAGTCTCGCCAGTA序列中Y為(C,T),S為(C,G),W為(A,T),R為(A,G),M為(A,C)。此引物和探針組合可擴增除了stx2f外的所有stx2變體。目標基因上游引物、下游引物和探針序列(5’-3’)上游引物：TTTCACACTTAT探針：AGGACCGCAGAGGA上游引物：GCAAATAATTACAATGTAT下游引物：GAAATTCTTTGC上游引物：CGAGGCAACACATTA下游引物：TTTTTGAATAGTTATGAA下游引物：AGCAGGCTTTTATATTCT探針：CCCCGTTAAATCAATAC表B.2(續(xù))目標基因上游引物、下游引物和探針序列(5’-3')下游引物：GCCGCCGCAATGC探針：CCGCCATTCAGAATGCA下游引物：GAAAAAAGCACCCCCGTACTTAT(規(guī)范性附錄)STEC分離和確認流程C.1流程STECSTEC分離和確認流程見圖C.1360±1℃培養(yǎng)18h~24h圖C.1STEC分離和確認流程圖若樣品為stx陽性，將增菌液劃線接種于CHROMagarSTEC顯色培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。挑取5個～8個可疑菌落。若樣品含有本標準提到的某種O血清組，吸取增菌液1mL,用抗相應(yīng)O抗原磁珠進行富集后將磁珠涂布于STEC相應(yīng)O血清組顯色培養(yǎng)基。同時將增菌液10倍梯度稀釋，分別取10-?、10-?、10-6稀釋液各100μL分別涂布于CHROMagarSTEC顯色培養(yǎng)基或STEC相應(yīng)O血清組顯色培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。挑取5個～8個可疑菌落。[1]ISO/TS13136:2012Microbiologyoffoodandanimaaction(PCR)-basedmethodforthedetectionoffood-bornepattectionofShiga