生物學(xué)多糖提取純化以及結(jié)構(gòu)解析

2012.10.31糖類介紹多糖提取多糖純化多糖結(jié)構(gòu)分析2012.10.31糖類介紹多糖提取多糖純化多糖結(jié)構(gòu)分析糖類介紹2012.10.31糖類(Carbohydrates)物質(zhì)是含多羥醛或多羥酮類化合物。主要由C、H、O組成，其分子式常用Cn(H2O)n來表示。定義：多羥基醛；多羥基酮；多羥基醛或多羥基酮的衍生物。2012.10.31ContentwelcometousethesePowerPointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperience糖類廣泛分布于生物體中，可以分為單糖、低聚糖和多糖。目前已發(fā)現(xiàn)不少糖類及其衍生物具有藥用價值，尤其在抗凝、降血脂、提高機(jī)體免疫和抗腫瘤、抗輻射方面都具有很廣泛的應(yīng)用。糖類分布2012.10.31糖的分類衍生糖復(fù)合糖多糖寡糖單糖凡不能被水解為更小分子的糖稱。如：核糖、葡萄糖凡能被水解成少數(shù)（2—10個）單糖分子的糖稱~。如：蔗糖葡萄糖+果糖

凡能被水解成多個單糖分子的糖稱~。如：淀粉n葡萄糖與非糖物質(zhì)結(jié)合的糖。如：糖脂、糖蛋白(蛋白聚糖)、糖核苷酸等。糖的衍生物。如：糖醇、糖酸、糖胺、糖苷等

2012.10.31糖類介紹多糖提取多糖純化多糖結(jié)構(gòu)分析多糖提取2012.10.31單糖、低聚糖常用水或醇提取，然后用不同的有機(jī)溶劑萃取得到不同極性的化合物。多糖常用熱水、稀堿或稀酸溶液進(jìn)行提取。（植物體內(nèi)苷常與水解酶共存，所以要殺酶或抑制酶的活性。）脫脂→去雜→濃縮→再次去雜→脫色→濃縮→冷卻→結(jié)晶（→進(jìn)一步純化）2012.10.31多糖提取粗多糖熱水提稀堿提微波提取超臨界流體萃取超聲提取物理輔助提取2012.10.31熱水提取稀堿提取適合用此方法的多糖主要是不溶性膠類，用冷水浸潤紅0.5mol/LNaOH提取，提取液用酸中和后濃縮，再加乙醇沉淀即得到多糖。甘露聚糖、半乳糖等利用此法可得到相當(dāng)純的物質(zhì)。對于易溶于溫水、難溶于冷水和乙醇的多糖采用這種方法。材料需要先用冷水浸過，再用熱水提取，必要時可加熱至80～90℃，攪拌提取，提取液用正丁醇與氯仿混合液除去雜蛋白，離心除去雜蛋白的清液，透析后用乙醇沉淀即得到多糖。2012.10.31除雜Sevag法(用氯仿:丁醇5:1混合)三氟三氯乙烷法(多糖溶液:三氟三氯乙烷1:1)三氯乙酸法(滴加3%三氯醋酸)酶法等電點沉淀法2012.10.31糖類介紹多糖提取多糖純化多糖結(jié)構(gòu)分析多糖純化2012.10.31純化方法由于提取液還含有多種組分的多糖混合物，因此需要進(jìn)一步純化（1）沉淀法（分級沉淀）（2）鹽析法（3）季銨鹽沉淀法（4）纖維素柱色譜法（吸附+分配）（5）離子交換色譜法（6）凝膠柱色譜法（7）制備區(qū)域電泳法（8）金屬配合物法2012.10.31由于不同相對分子質(zhì)量的多糖在不同濃度的低級醇或低級酮中溶解性不同，可以逐步提高溶液中醇或酮的濃度以使不同組分的多糖依相對分子質(zhì)量由大到小的順序沉淀，最終達(dá)到分離的目的。沉淀原理（為了多糖的穩(wěn)定，一般在PH7時進(jìn)行，酸性多糖在PH2-4時進(jìn)行)2012.10.31利用不同多糖與金屬離子成鹽后在水溶液中的特異性沉淀作用，用硫酸銨、乙酸鉀、氯化鉀等鹽析劑，將不同的多糖逐步析出。鹽析法原理原理金屬配合物法原理：利用不同多糖能與金屬離子形成配合物而沉淀下來，使用多種配位劑沉淀多糖。2012.10.31長鏈季銨鹽是堿性表面活性劑，酸性多糖在溶液中以聚陰離子形式存在，它就與季銨鹽或其堿形成不溶性配合物沉淀，又由于多糖分子酸性越強(qiáng)、相對分子質(zhì)量越大越易沉淀出來，這樣控制季銨鹽濃度即可以分理出不同的酸性多糖季銨鹽沉淀原理與酸性多糖形成不溶性沉淀，使其分離。常用季氨鹽有十六烷基三甲胺溴化物及其氫氧化物和十六烷基吡啶。提高溶液PH值或加入硼砂緩沖液，也可沉淀分離中性多糖。2012.10.31它利用的是不同多糖濃度乙醇中溶解性不同，先用4倍V的乙醇將多糖混合液沉淀在惰性的多孔纖維素柱上，再用不同濃度的乙醇洗脫，使不同多糖分離開來。纖維素柱色譜原理2012.10.31多糖分子帶有電荷，可以與離子交換劑中的離子或基團(tuán)結(jié)合，親和力隨多糖結(jié)構(gòu)與電離性的不同而不同，一般隨分子中酸性基團(tuán)的增加而增強(qiáng)，支鏈多糖比支鏈的更易吸附，然后用不同濃度的鹽溶液進(jìn)行洗脫。離子交換色譜原理常用交換劑為陽離子或陰離子交換纖維素。陽離子交換纖維素適用于分離酸性、中性多糖和粘多糖。中性多糖與硼酸絡(luò)合后可增加酸性，可被陽離子交換纖維素吸附酸性基團(tuán)多的吸附力強(qiáng)，對于線性分子，分子量大的比小的吸附力強(qiáng)，直鏈分子比支鏈分子易吸附2012.10.31分子篩原理，按照分子量的大小不同進(jìn)行分離。常用葡聚糖凝膠（sephadexG）凝膠柱色譜原理除此之外，還有膜分離技術(shù)、超濾膜術(shù)等也應(yīng)用于多糖的分離純化2012.10.31常用的脫色方法對于植物來源的多糖，可能含有酚型化合物而顏色較深，對其進(jìn)行脫色可使其應(yīng)用范圍更加廣泛。常用的脫色方法有:離子交換法、氧化法、金屬絡(luò)合物法、吸附法(纖維素、硅藻土、活性炭等)。

Addyourtitle一般情況下，盡量避免用活性炭處理，因活性炭會吸附多糖，造成多糖損失。2012.10.31黏多糖（又叫酸性黏多糖）是一類廣泛存在于動物體內(nèi)的含糖醛酸和氨基糖殘基的復(fù)合多糖，這是一類較有發(fā)展?jié)摿Φ男滦蜕幬锘蛏镏破贰Ｌ崛。吼ざ嗵谴蠖嗯c蛋白質(zhì)共價結(jié)合，首先常用酶降解部分蛋白或用堿使多糖-蛋白質(zhì)間的鍵斷裂，促進(jìn)提取時的溶解。然后用普通蛋白沉淀法沉淀蛋白。2）分離：①有機(jī)溶劑分離法利用不同濃度的乙醇依次沉淀不同的黏多糖。②季銨化合物沉淀法其含有酸性基團(tuán)，與表面活性劑形成季銨配合物，然后用不同鹽離子濃度解離。③離子交換層析法用陰離子交換劑交換吸附，再用NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫2012.10.31糖類介紹多糖提取多糖純化多糖結(jié)構(gòu)分析多糖結(jié)構(gòu)分析2012.10.31多糖是由多個單糖基以糖苷鍵相連而形成的高聚物多糖的結(jié)構(gòu)包括單糖的組成、糖苷鍵的類型、單糖的排列順序3個基本結(jié)構(gòu)因素。多糖的生物大分子結(jié)構(gòu)比蛋白質(zhì)更為復(fù)雜，這不僅因為組成多糖的單糖品種繁多(目前已知的單糖有200多種)，而且即使只有一種單糖組成的多糖其連接方式的不同以及可能有的支鏈(蛋白質(zhì)支鏈較少)造成多糖的結(jié)構(gòu)測定非常困難。2012.10.31概念：多糖由多個單糖以糖苷鍵相連而成的高分子聚合物。方向：左：非還原端；右：還原端。多糖的性質(zhì)：膠體溶液、無甜味、無還原性、有旋光性，但無變旋現(xiàn)象。2012.10.31多糖的結(jié)構(gòu)：一級結(jié)構(gòu)：①單糖的組成；②糖苷鍵的類型；③單糖的排列順序。二級結(jié)構(gòu)：取決于一級結(jié)構(gòu)，指其分子骨架。2012.10.31多糖的種類：

1）均一多糖(同多糖)：由一種單糖縮合而成。2012.10.31不均一多糖(雜多糖)：由不同類型單糖縮合而成2012.10.31一：分子量及分子式的確定質(zhì)譜分析測定分子量和分子式。苷類化合物一般極性較大，無揮發(fā)性，遇熱氣化時易于分解，采用電子轟擊質(zhì)譜(EI—MS)常常不能獲得分子離子峰?，F(xiàn)多采用化學(xué)電離質(zhì)譜(CI-MS)、場解吸質(zhì)譜(FD-MS)、快原子轟擊質(zhì)譜(FAB-MS)和電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)等方法來獲得分子離子蜂，尤其是ESI-MS及FAB-MS兩種質(zhì)譜法更是目前測定苷類分子量常用的方法。2012.10.31組成苷的苷元和單糖的鑒定

一般是將苷鍵全水解，用PC檢出單糖的種類，糖類的PC常用的展開劑大多為含水的溶劑系統(tǒng)，如正丁醇-醋酸-水(4:1:5)，EtOAc-吡啶-水(2:1:2)等，經(jīng)顯色后用薄層掃描法求得各種糖的分子比。用GC或HPLC對單糖定性定量，GC常以甘露醇或肌醇為內(nèi)標(biāo)，用已知單糖作為對照品。NMR譜，也可以有效地鑒定苷分子中糖的種類。苷分子量-苷元分子量，求出糖的數(shù)目氫譜中端基質(zhì)子信號數(shù)(5ppm左右)，碳譜中端基碳信號的數(shù)目(90-112ppm)。2012.10.31苷元和糖之間連接位置的確定13C-NMR：苷化位移規(guī)律，將苷和苷元的碳譜相比較。成苷后，α-C約+8ppm,β-C約-4ppm二維核磁共振譜(如HMQCCOSY及HMBC譜)等技術(shù)廣泛用于確定連糖位置。2012.10.31糖與糖的連接位置的確定全甲基化物進(jìn)行甲醇解，分析其甲醇解產(chǎn)物。甲基化法雖然不能解決多糖中單糖的連接順序，但它對于闡明單糖的連接方式(鍵構(gòu)型)、重復(fù)結(jié)構(gòu)中某種單糖的數(shù)目、末端糖的性質(zhì)以及分支點的位置等非常有用。2012.10.31采用的方法通常是將這些甲基化的單糖進(jìn)行了TLC鑒定，并與標(biāo)準(zhǔn)品對照。近來亦有用GC-MS聯(lián)用儀對其進(jìn)行鑒定的報道。全甲基化甲醇解：2012.10.31苷鍵構(gòu)型的確定酶水解轉(zhuǎn)化糖酶--------水解β-果糖苷鍵麥芽糖酶--------水解α-葡萄糖苷鍵杏仁苷酶--------水解β-葡萄糖苷鍵,專屬性較低纖維素酶--------水解β-葡萄糖苷鍵NMR譜法測定利用端基質(zhì)子的偶合常數(shù)利用α-苷鍵和β-苷鍵的端基碳的化學(xué)位移差別利用2D-NMR譜2012.10.31糖鏈連接順