臨床免疫學檢驗：第八章 酶免疫技術

第八章酶免疫技術放射免疫技術發(fā)光免疫技術酶免疫技術三大經典標記技術三大經典標記技術

第一節(jié)酶免疫技術的特點

是以酶標記的抗體（抗原）作為主要試劑，將抗原抗體反應的特異性和酶的高效催化反應的專一性相結合的一種免疫檢測技術。酶免疫技術概念：能定性、定位、定量主要試劑:

酶標記的抗體或抗原酶結合物特點：免疫學活性酶對底物的催化活性抗原抗體反應的特異性酶高效催化反應的專一性基本原理

＋Ag

-Ab-E(Ag-E-Ab)

S顯色反應Ag(Ab)定性、定量、定位分析基本原理Ab-E(Ag-E)

+

Ag(Ab)靈敏度高、特異性強、準確性好酶標記試劑能夠較長時間保持穩(wěn)定操作簡便、對環(huán)境沒有污染易與其它技術偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣的新方法特點

標記酶的要求：

活性高性質穩(wěn)定專一性強酶催化底物的顯色信號易于判斷和測量方法敏感，重復性好，簡單易行酶的底物易于配制保存，酶及底物價廉

一、酶和酶作用底物糖蛋白（主酶）：與酶活性無關亞鐵血紅素（輔基）：酶的活性基團常用酶及底物1、辣根過氧化物酶（HRP）來源：辣根分子量小(44KD)，易穿透細胞內部；等電點pH7.2，63℃加熱15min穩(wěn)定；疊氮鈉、氰化物、氟化物、強酸可使HRP滅活。酶純度（RZ）=A403nm/A275nm≥3.0RZ值與酶活性無關，酶活性單位比RZ值更為重要ELISA中應用最廣的標記酶DH2+H2O2→D+2H2OHRP供氫體底物：鄰苯二胺（OPD）：橙黃色→棕黃色492nm

四甲基聯(lián)苯胺（TMB）：藍色→黃色，450nm

最常用

受氫體：

專一性高，過氧化物（H2O2，醇過氧化物，尿素過氧化物）HRP底物HRP常用的供氫體底物及其反應產物供氫體底物反應產物終止劑測讀波長二氨基聯(lián)苯胺(diamido-benzidine,DAB)棕色、不溶性2mol/LHCL或H2SO4492nm聯(lián)苯胺(benzidine)藍色、不溶性450nm鄰苯二胺(o-phenylenediamin,OPD)黃色、可溶性同上492nm四甲基聯(lián)苯胺(3,3,5,5-tetramethyl-benzidine,TMB)藍色(黃色)、可溶性同上450nm5-氨基水楊酸(5-aminosalicylicacid,5-ASA)棕色、可溶性3mol/LNaOH550nmABTS(2,2-azino-bis(3-ethylbenzithiazoline-6-sulfonicacd)綠色、可溶性1%SDS405nm注：括號內為終止后的顯色及測讀波長堿性磷酸酶（ALP）：菌源性ALP（80KD,最適pH8.0）腸粘膜ALP(100KD,最適pH9.6）對-硝基苯磷酸酯（pNPP）→對硝基酚（黃色）→405nmALPELISA中禁止使用磷酸鹽緩沖液2、堿性磷酸酶（ALP）NaOH3、β–半乳糖苷酶（β-Gal）血標本中缺乏，不易受內源性酶的干擾，用于均相酶免疫測定4-甲基傘形酮-β-D半乳糖苷（4MUG）→4MUβ-Gal360nm

激發(fā)光450nm熒光酶免疫技術的核心組成部分

二、酶標記抗體或抗原酶結合物（conjugate）/酶標記物：

通過化學反應將酶與抗體或抗原形成的結合物

抗原要求純度高，抗原性完整

抗體需要特異性好、效價高、親合力強以及比活性較高，能批量生產，易純化。技術方法簡單、產率高，重復性好標記反應不影響酶和抗原或抗體的活性酶標記物穩(wěn)定，不形成聚合物制備方法要求直接法：酶分子中的多糖羥基被過碘酸鈉氧化為醛基后再與抗原或抗體分子的氨基結合

改良過碘酸鈉法

HRP標記最常用的方法

交聯(lián)法：具有雙功能或多功能化學基團的交聯(lián)劑為橋，分別與酶和抗體（抗原)結合。

戊二醛交聯(lián)法HRP、AP的標記

制備方法酶結合物的純化葡聚糖凝膠G-200/G-150過柱層析純化50%飽和硫酸銨沉淀提純酶結合物的鑒定質量鑒定：酶活性、抗體（抗原）的免疫活性酶標記率的測定酶量：1mg/mlHRP/IgG：1.5~2.0酶的標記率>0.3塑料：聚苯乙烯（最常用）(小珠、小試管、微量反應板)

聚氯乙烯微粒：需特殊的儀器膜載體：硝酸纖維素膜、尼龍膜、玻璃纖維素膜固相抗體或抗原：把抗體或抗原結合到固相載體的表面三、固相載體包被(coating)：將抗原或抗體結合于固相載體上的過程封閉(blocking)：用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清再包被一次，消除固相載體表面未結合的位點，消除非特異吸附。包被與封閉(pH9.6碳酸鹽緩沖液)酶免疫技術酶免疫組化酶免疫測定均相

異相固相酶免疫測定液相酶免疫測定組織切片或其它標本中抗原的定位

液體標本中抗原或抗體的定性和定量第二節(jié)酶免疫技術分類用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測定

利用酶標記物與相應的抗原或抗體結合后，標記酶的活性會發(fā)生改變，不用分離結合和游離酶標記物，通過測定標記酶的活性的改變，而確定抗原或抗體的含量。一、均相酶免疫測定酶放大免疫分析技術（EMIT）

enzyme-mutipliedimmunoassaytechnique

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、溶菌酶

注意點!1.Ag－E—Ab:酶活性↓（∵Ab的空間位阻，影響酶活性中心）2.游離酶(Ag-E)有酶活性EMITEMIT

基本原理:

＋

Ag(待測）競爭

Ab（限量）Ag-E當Ag多時Ag-Ab

(多)Ag-E

–Ab＋Ag-E(少)（多）酶活性↑S當Ag少時Ag-Ab(少)Ag-E

–Ab＋Ag-E

(多)（少）酶活性↓酶活性與待測Ag含量呈正相關克隆酶供體免疫分析（CEDIA）

clonedenzymedonorimmunoassayβ-D-半乳糖苷酶CEDIA：注意點!2.形成Ag-ED—Ab時，Ab阻止ED與EA結合,酶活性↓

EAEDAgEDAg抗體活性酶1.酶EA(大)ED(小)

單獨無活性，結合為全酶方具活性

EAED

EAED3.結合力:Ag與Ab＞EA與EDCEDIA原理示意圖：

EA

EAED活性酶AgEDAg抗體EDAg抗體抗體AgAg

EACEDIA基本原理：Ag（待測）競爭EAAbAg-ED（限量）Ag多Ag－Ab（多）＋

Ag-ED－

Ab（少）Ag-ED（多）EAAg-ED－EA（多）（酶活性↑）SAg少Ag－Ab（少）＋

Ag-ED－Ab（多）Ag-ED（少）

EAAg-ED－EA（少）（酶活性↓）S酶活性與待測Ag含量呈正相關分類：液相酶免疫測定固相酶免疫測定

與均相不同之處：需分離游離與結合的酶標記物二、異相酶免疫測定

第三節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗

enzyme-linkedimmunosorbentassay（ELISA）

一、基本原理二、方法類型及反應原理三個必要試劑固相的抗原或抗體酶標記物（酶結合物）酶反應的底物

夾心法間接法競爭法捕獲法ABS-ELISA雙抗體夾心法雙抗原夾心法三大基本方法1、雙抗體夾心法測抗原最常用的方法二價及二價以上的大分子抗原ELISA檢測抗原的方法1、已知抗體包被于載體表面3、加酶標抗體與抗原結合4、加酶作用的底物產生顏色2、加待檢物抗原與抗體結合4、加酶作用的底物不產生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌雙抗體夾心法測抗原1、已知抗體包被于載體表面2、加待檢物無抗原與抗體結合3、加酶標抗體無抗原結合+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYYEEEEEEEEELISA結果：陽性陰性空白注意標本中類風濕因子的干擾2、雙位點一步法選擇針對抗原分子上兩個不同且空間距離較遠的抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體鉤狀效應（hookeffect）：雙位點一步法中，當標本中的待測抗原濃度過高時，過量的抗原可分別與酶標抗體和固相抗體結合而抑制夾心復合物的形成，顯色降低，使最終測定結果低于實際含量，嚴重時可出現(xiàn)假陰性結果。洗滌洗滌3、競爭法測抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE2、加待檢物抗原與酶標抗原競爭與抗體結合3、加酶作用的底物不顯色或顯色弱3、加酶作用的底物顯色1、已知抗體包被于載體表面1、已知抗體包被于載體表面2、加待測物和酶標抗原，酶標抗原與抗體結合YE測小分子抗原或半抗原EEEEEEEE1、間接法（最常用）原理：酶標記的抗抗體（酶標二抗）檢測與固相抗原結合的受檢抗體酶標抗人Ig測總抗體酶標抗人IgG測IgG類抗體酶標抗人IgM測IgM類抗體只需更換固相抗原，可用一種酶標二抗檢測標本中多種針對不同抗原的抗體標本需稀釋ELISA檢測抗體的方法1、已知抗原吸附于載體表面2、加待檢物無抗體與抗原結合3、加酶標抗Ig與抗體結合4、加酶作用的底物產生顏色1、已知抗體吸附于載體表面2、加待檢物有抗體與抗原結合3、加酶標的抗Ig抗體4、加酶作用的底物不產生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌間接法測抗體-YEYYYYYYYYYEYYYYYYYY+EEEEEEEEE2、雙抗原夾心法反應模式與雙抗體夾心法類似用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同：以酶標抗原代替酶標抗抗體。3、競爭法原理：類似檢測抗原的競爭法

應用：HBcAb、HBeAb的檢測YYYEYEYEY待測HBcAb酶標HBcAb溫育、洗板YEYY溫育加入酶作用的底物YEYY顯色的強弱與待測標本中的HBcAb的含量成反比固相HBcAg競爭法測HBcAbEEEEEYYYEYEYEY待測HBeAb酶標HBeAb溫育洗板加入酶作用的底物顯色的強弱與待測標本中的HBeAb的含量成反比固相HBeAb競爭法測HBeAbYYY中和抗原HBeAgYYY溫育洗板YYYEYEY溫育YYYEYEYEEEEEEE4、捕獲法

測IgM類抗體常用于測定病原體急性感染診斷中的IgM型抗體抗人IgMμ鏈抗體樣本（IgM1、2）抗人IgMμ鏈抗體IgM1特異抗原（Ag1）抗人IgMμ鏈抗體抗人IgMμ鏈抗