第四章-2 基因工程課件

基

因

工

程——目的基因的克隆與基因文庫的構建第四章-2基因工程目的基因的克隆與基因文庫的構建DPCR法CcDNA法A鳥槍法E化學合成法B基因文庫的構建第四章-2基因工程目的基因的克隆與基因文庫的構建基因工程或DNA重組技術三大用途的前提條件是從生物體基因組中分離克隆目的基因，目的基因獲得之后，或確定其表達調控機制和生物學功能，或建立高效表達系統(tǒng)，構建具有經濟價值的基因工程菌（細胞），或將目的基因在體外進行必要的結構功能修飾，然后輸回細胞內改良生物體的遺傳性狀，包括人體基因治療。第四章-2基因工程一般來說，目的基因的克隆戰(zhàn)略分為兩大類：一類是構建感興趣的生物個體的基因文庫，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從基因組文庫中挑出含有目的基因的重組克??；另一類是利用PCR擴增技術甚至化學合成法體外直接合成目的基因，然后將之克隆表達。第四章-2基因工程A鳥槍法鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略鳥槍法操作的改進鳥槍法克隆目的基因的局限性第四章-2基因工程鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略隨機克隆供體細胞的全基因組DNA片段，然后通過快速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的目的重組子，進而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核細菌目的基因的克隆分離

第四章-2基因工程鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略染色體DNA的切斷

超聲波處理：片段長度均一，大小可控，平頭末端

全酶切：片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開，大小不可控部分酶切：片段長度可控，含有粘性末端，目的基因完整與載體連接

如果轉化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體；如果轉化子采用基因產物功能檢測法篩選，則選擇表達型載體如果轉化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為轉化受體細胞

受體細胞；如果轉化子采用基因產物功能檢測法篩選，則選擇能使目的基因表達的受體細胞篩選含有目的基因的目的重組子

菌落原位雜交法、基因產物功能檢測法（篩選模型的建立）

第四章-2基因工程特點速度快；成本較低；簡單易行；第四章-2基因工程鳥槍法操作的改進使用這一改進方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知。如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高重組子中目的重組子的出現(xiàn)頻率使用特征性限制性內切酶切開染色體DNA

第四章-2基因工程鳥槍法操作的改進例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，將染色體DNA用SalI切開，瓊脂糖凝膠電泳分離，用刀片切下相當于1.6-2.0

kb大小區(qū)域內的凝膠塊，從此凝膠塊中回收DNA片段，然后與載體進行拼接在連接前將DNA片段進行分級分離

2.0kb1.6kb1.8kb第四章-2基因工程鳥槍法操作的改進凍融法濾紙法吸附法低融點凝膠法溶解法凝膠DNA片段回收技術

第四章-2基因工程鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識不能獲得的最小長度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內含子結構第四章-2基因工程B基因文庫的構建目的基因的克隆與基因文庫的構建基因文庫的基本概念基因文庫的構建程序基因組文庫重組克隆的排序第四章-2基因工程基因組文庫的構建基因文庫（genelibrary）：用重組DNA技術將某種生物細胞的總DNA或染色體DNA的所有片段隨機地連接在載體上，然后轉移到適當?shù)乃拗骷毎型ㄟ^細胞增殖而構成各個片段的克隆。當制備的克隆數(shù)目多到可以把某種生物的全部基因都包含在內的情況下，這一組克隆的總體就稱為某種生物的基因文庫。同一定義也適用于線粒體或葉綠體ＤＮＡ的基因文庫。由于制備ＤＮＡ片段的切點是隨機的，所以每一克隆內所含的ＤＮＡ片段即可能是一個或幾個基因，也可能是一個基因的一部分或除完整基因外還包含著兩側的鄰近ＤＮＡ順序。第四章-2基因工程

基因文庫的構建就是利用所謂的“鳥搶法”，使基因組的DNA片段隨機地插入適當?shù)妮d體中，引入細胞進行大量繁殖而構建的。第四章-2基因工程基因文庫的基本概念基因庫與基因文庫基因庫（genepool）特定生物體全基因組的集合（天然存在）

基因文庫（genelibraryorgenebank）從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式基因組文庫（含有全部基因）存在（人工構建）。根據(jù)構建方法的不同，基因文庫分為：cDNA文庫（含有全部蛋白質編碼的結構基因）

第四章-2基因工程基因文庫的基本概念基因文庫構建的基本戰(zhàn)略用鳥槍法構建基因組文庫，材料來自染色體DNA用cDNA法構建cDNA文庫，材料來自mRNA在高度分化的生物體中，不同組織和細胞在不同時段的mRNA種類不同（即基因的表達譜不同），因此同種生物體的cDNA文庫一般還有組織細胞的界定，如肝組織cDNA文庫或胚胎組織cDNA文庫等。很顯然，cDNA文庫的信息量遠小于基因組文庫第四章-2基因工程基因組DNA文庫純化基因組DNA

基因組DNA的片斷化物理切割和限制性內切酶

eukaryotes

prokaryotes與載體連接第四章-2基因工程構建基因文庫的基因組DNA必須進行純化后，才能用來制備適用于載體插入片斷大小的隨機片斷基因組DNA的純化

:

原核生物:直接從細胞中體取基因組DNA去除蛋白（蛋白酶消化）,脂類和其它“雜質”。真核生物

:從細胞核中第四章-2基因工程基因文庫的構建程序基因組DNA的制備為了最大限度地保證基因在克隆過程中的完整性，

用于基因組文庫構建的DNA在分離純化操作中應盡量避免過度的斷裂。制備的DNA分子量越大，經切割處理后樣品中含有不規(guī)則末端的DNA片段的比率就越低，重組率和完備性也就越高AAAA用常規(guī)方法制備的染色體DNA的長度一般在100kb左右如果先將細胞固定在低融點凝膠中，然后置入含有SDS、蛋白酶K、RNase的緩沖液中浸泡，可獲得1000kb大小的DNA片段第四章-2基因工程基因文庫的構建程序基因組DNA的切割用于基因組文庫構建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和限制性內切酶部分酶切兩種方法，其目的是：第一，保證DNA片段之間存在部分重疊區(qū)第二，保證DNA片段大小均一超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭部分酶切法一般選用四對堿基識別序列的限制性內切酶，如：Sau3AI或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控

連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進行分級分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機連為一體！第四章-2基因工程

用于構建基因文庫片段的產生大致有兩種方法：一、限制性內切酶完全消化基因組DNA這個方法有兩個特點：1、假如所需的基因含有所用限制酶的識別位點，那么這一基因將被克隆在兩個或數(shù)個片段中，給研究帶來一定的困難。2、一般常用的限制酶大多識別六個bp序列，切割DNA所產生的片段的平均大小相對比較?。s4kb即46＝4096bp），因此整個基因文庫要含有非常大量的重組體，這樣應用分子雜交法進行篩選就十分費事費時。雖然可以用限制酶進行部分消化，產生約20kb的片段，但這種方法必須掌握好酶解的條件。第四章-2基因工程Hae

、Alu第四章-2基因工程第四章-2基因工程二、機械隨機切割這種方法可以制備大片段的DNA（用噬菌體λ作載體約20kb，以cosmid作載體約45kb），從而克服上述的兩處缺點。但是這種方法的不是之處是：所制備的片段的末端順序是隨機的，還必須經過末端修復，人工制造接頭等手續(xù)才能與載體ＤＮＡ進行連接。用于基因文庫構建的載體常用噬菌體λ或cosmid載體，因為它們的容量比較大，可克隆大片段的DNA。雖然cosmid載體比λ載體的容量大，但由于文庫的保存（cosmid載體在E.coli中，λ載體在噬菌體中）λ比cosmid容易，因此λ載體用的更多些。第四章-2基因工程基因文庫的基本概念基因文庫的質量標準除了盡可能高的完備性外，一個理想的基因文庫應具備下列條件：重組克隆的總數(shù)不宜過大以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長度避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選第四章-2基因工程基因文庫的構建程序載體和受體的選擇出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫構建的載體通常選裝載量較大的l-DNA或考斯質粒；對于大型基因組（如動植物和人類）需使用YAC或BAC載體l-DNA由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文庫構建的載體通常選質粒上述幾種載體的最大裝載量如下：質?？妓官|粒15kb25kb45kbBAC300kbYAC400kb用于基因文庫構建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌第四章-2基因工程基因文庫的構建程序從基因文庫中篩選目的基因大型基因組文庫一般由數(shù)十萬甚至上百萬個重組克隆組成。除了一些具有特殊功能的蛋白質編碼基因（如抗藥性基因、結合蛋白編碼基因等）可以采用特殊的正選擇篩選程序（如抗藥性篩選法、酵母雙雜交技術等）直接篩選外，一般的基因組文庫篩選均需多輪操作步驟第四章-2基因工程基因文庫的構建程序從基因文庫中篩選目的基因密集鋪板（1-10萬）雜交挖取鋪板鋪板目的重組克隆第四章-2基因工程video06基因文庫的構建第四章-2基因工程CcDNA法

cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略cDNA法分離目的基因的基本程序cDNA法法克隆目的基因的局限性cDNAlibraries第四章-2基因工程cDNA基因克隆

cDNA文庫是指得到足夠多的分別克隆的cDNA片段，匯集這些克隆應包含某種細胞中各種mRNA的相應順序，每種順序至少有一份拷貝，這種克隆片段的匯集體稱為某種細胞的cDNA文庫。

第四章-2基因工程

cDNAlibrariesmRNAisolation,purificationChecktheRNAintegrity

FractionateandenrichmRNA

SynthesisofcDNA

TreatmentofcDNAends

Ligationtovector第四章-2基因工程cDNA文庫沒有原核生物的cDNA文庫原核生物的mRNA非常不穩(wěn)定；原核生物的基因組文庫比較容易構建，能包含所有基因的序列。第四章-2基因工程cDNA文庫對于真核生物的基因分析cDNA文庫是只含有編碼蛋白的基因文庫cDNAs沒有內含子基因可以在E.coli

中直接表達用于新基因的鑒別組織或特殊類型細胞（基因的特異表達）cDNA文庫第四章-2基因工程cDNA文庫-mRNA分離大部分真核生物的mRNAs有3’poly（A）尾巴

oligo(dT)能與poly(A)尾巴互補，由此來獲得mRNA.AAAAAAAAAAn5’cap第四章-2基因工程第四章-2基因工程1.傳統(tǒng)的分離方法是用oligo(dT)-纖維素柱分離總RNA2.

把oligo(dT)-磁珠同總RNA混合，在強磁場下分離mRNA3.用蔗糖梯度離心mRNA核糖體復合體（溶解細胞）來分離mRNA三種分離mRNA的方法第四章-2基因工程用纖維素純化poly(A)mRNA的流程圖第四章-2基因工程確定mRNA沒被降解

方法:mRNA的翻譯

:用體外蛋白質合成檢測mRNAs。（麥胚無細胞轉譯體系或兔網織細胞裂解物轉譯體系）通過凝膠電泳分析mRNAs:用瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳cDNA文庫-檢測mRNA的完整性第四章-2基因工程克隆特殊的mRNAs克隆一個特殊的基因比建立完整的cDNA文庫更有用凝膠分離:

通過瓊脂糖凝膠電泳回收

mRNAs（根據(jù)mRNA的大?。└患?

通過雜交來實現(xiàn)第四章-2基因工程cDNA

的合成:第一鏈的合成:

mRNA,反轉錄酶，oligo(dT)，核酸末端轉移酶，dNTPs1.oligo(dT)引導的cDNA合成法

2.隨機引物引導的cDNA合成法第二鏈的合成:

根據(jù)在第一鏈3’-末端加尾（C），用補充引物合成第二鏈

第四章-2基因工程cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略mDNAcDNA第一鏈的合成

5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’cDNA第一鏈引物退火逆轉錄酶dNTPs第四章-2基因工程cDNA第二鏈的合成

煮沸NaOH自身引導法：獲得的雙鏈cDNA5’端會有幾對堿基缺失AAAAAAAAAAAAAA5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’TTTTTTTTTTTTTTp

5’TTTTTTTTTTTTTTp

5’AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTOH

3’KlenowdNTPsS1第四章-2基因工程cDNA第二鏈的合成

DNApoldNTPsRNaesH置換合成法：獲得的雙鏈cDNA5’端也會有幾對堿基缺失5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’AAAAAAAAAAAAAAp

5’5’S1AAAATTTOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’5’TTTTTTTTTTTTTTOH

3’AAAAAAAAAAAAAA

5’5’TTTTTTTTTTTTTT

3’3’T4-DNAligase第四章-2基因工程cDNA第二鏈的合成

dCTPTdT引導合成法：獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5’端序列5‘ppp’5G

G

AAAAAOH

3’TTTTTp

5’3‘

HO5‘ppp’5G

G

AAAAACCCCCCCOH

3’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’5‘

pGGGGGGG3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’5‘

pGGGGGGGAAAAAOH

3’NaOH退火KlenowdNTPs第四章-2基因工程cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略雙鏈cDNA的克隆

雙鏈平頭的cDNA通常可以使用下列三種方法克隆入載體中：

平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收

平頭兩端分別接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，這樣重組分子可通過加熱局部變性和S1核酸酶處理回收插入片段加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收

第四章-2基因工程cDNA法分離目的基因的基本程序完備分離程序

提取細胞總mRNA，合成總cDNA，將之全部克隆，然后借助于合適的篩選手段找到目的重組子篩選時，若使用的是多拷貝載體，則采用菌落原位雜交法篩選；若使用的是表達型載體，則采用菌落免疫雜交法篩選完備分離程序適用于mRNA分子數(shù)少的目的基因的克隆，如人胰島素基因、干擾素基因、凝血因子VIII基因等第四章-2基因工程cDNA法分離目的基因的基本程序特異分離程序

提取細胞總mRNA，瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標mRNA，由此合成雙鏈cDNA，然后進行克隆特異分離程序較適用于mRNA豐度極高的目的基因克隆如血紅蛋白基因等

第四章-2基因工程cDNA法分離目的基因的基本程序差異分離程序

利用兩組細胞mRNA種類的差異，分離克隆差異mRNA所對應的cDNA，因而這種程序較適用于分離克隆新基因例如：正常的大鼠FR3T3成纖維細胞中，有些新基因是不能自發(fā)表達的，需在多瘤病毒感染之后方可轉錄。任務是要分離克隆這些新基因，進而研究其生物學功能第四章-2基因工程差異分離程序

多瘤病毒感染的FR3T3細胞正常的FR3T3細胞總mRNA總mRNAcDNA雙鏈cDNA單鏈cDNA提取mRNA合成cDNA合成第二鏈克隆提取mRNA共價交聯(lián)上柱原位雜交病毒誘導表達的基因cDNA克隆第四章-2基因工程cDNA克隆的優(yōu)越性

1.以mRNA為材料；

（一些RNA病毒，不經過DNA中間體，對其研究，cDNA是唯一可行的方法）

2.基因文庫的篩選比較簡單易行；

3.由于每一個cDNA克隆都含有一種mRNA序列，在選擇中出現(xiàn)假陽性的幾率比較低；

4.克隆在細菌中表達的基因，用作基因序列的測定，和發(fā)育過程中或組織中基因特異表達

第四章-2基因工程cDNA法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA結構

細菌或原核生物的mRNA半衰期很短mRNA在細胞中含量少，對酶和堿極為敏感，分離純化困難僅限于克隆蛋白質編碼基因

第四章-2基因工程DPCR法目的基因的克隆與基因文庫的構建

PCR（PolymeraseChainReaction）法，又稱為聚合酶鏈反應或PCR擴增技術，是一種高效快速的體外DNA聚合程序使用PCR法克隆目的基因的前提條件是：已知待擴增目的基因或DNA片段兩側的序列，根據(jù)該序列化學合成聚合反應必需的雙引物PCR法定向擴增目的基因的基本原理第四章-2基因工程5‘5‘目的基因5‘變性加熱5‘5‘引物退火5‘5‘底物聚合5‘5‘5‘5‘加熱變性5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘退火引物底物聚合加熱變性引物退火底物聚合123第四章-2基因工程由TaqDNA聚合酶擴增的PCR產物中，其3’末端總是會帶有一個非模板依賴型的突出堿基，而且這個堿基幾乎總是A，因為TaqDNA聚合酶對dATP具有優(yōu)先聚合活性。由于該突出堿基的存在，克隆時即可以采取TdT末端加同聚尾的方法與載體拼接，也可以使用專門的T載體克隆

PCR克隆目的基因的基本程序5’5’AATT5’5’PCR擴增產物T載體T7lacZMCSoriApr第四章-2基因工程E化學合成法目的基因的克隆與基因文庫的構建化學合成法的基本戰(zhàn)略化學合成的單元操作DNA化學合成的用途第四章-2基因工程化學合成法的基本戰(zhàn)略全基因合成化學合成目的基因的前提條件是基因的DNA序列已知，有三種戰(zhàn)略：小片段粘接法：

混合退火根據(jù)目的基因全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈DNA小片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體

第四章-2基因工程化學合成法的基本戰(zhàn)略全基因合成補釘延長法：

混合退火根據(jù)目的基因兩條互補鏈全序列，分別合成12-15堿基長的單鏈DNA小片段以及20-30堿基長的單鏈DNA中片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體

Klenow酶聚合第四章-2基因工程化學合成法的基本戰(zhàn)略全基因合成大片段酶促法：

混合退火根據(jù)目的基因的全序列，分別合成40-50堿基長的單鏈DNA片段T4-DNA連接酶連接克隆入合適的載體

Klenow酶聚合第四章-2基因工程化學合成法的基本戰(zhàn)略全基因合成上述三種方法各有利弊：化學合成DNA的單片段愈短，收率就愈高，但由于化學合成的份額較大，成本較高；在大片段酶促法合成目的基因時，雖然化學合成的份額相對較小，成本較低，但大片段化學合成的收率極低，例如，每聚合一個單體的產物收率為95%則合成50個堿基長的DNA單鏈大片段的總收率只有7.7%第四章-2基因工程化學合成法的基本戰(zhàn)略探針等寡聚核苷酸合成在某些情況下，往往只知道目的基因編碼產物的部分氨基酸序列，而基因序列未知，此時需要從已知的氨基酸序列推測為其編碼的DNA序列，然后合成探針，篩選由鳥槍法或cDNA法得到的重組子，最終獲得含有目的基因的目的重組子由于大多數(shù)氨基酸擁有簡并密碼子，故在探針序列的設計時必須考慮下列問題：生物體對簡并密碼子的偏愛性，合成系列探針探針應具有足夠的長度，通常在17-20個核苷酸之間探針內部不應出現(xiàn)可能的互補區(qū)域第四章-2基因工程化學合成法的基本戰(zhàn)略探針等寡聚核苷酸合成某段連續(xù)的氨基酸序列CysMetAspGluMetLysArgAsnIle所有可能的DNA序列TGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATACTGATGGGTTCCGACGGCGTCGC設計的簡并探針序列TGTATGGACGAIATGATGTATGGATGAIATGATGCATGGACGAIATGATGCATGGATGAIATGAAG此外還可以參考各種生物體的EST數(shù)據(jù)庫進行傾向性簡并序列設計expressedsequencetag第四章-2基因工程DNA化學合成的用途合成天然基因修飾改造基因

設計新型基因

制備探針、引物、接頭

如生長激素釋放抑制素基因、腦啡肽基因、胰島素基因、干擾素如組織型纖溶酶原激活劑基因、尿激酶原基因等

基因等第四章-2基因工程克隆基因的分離與篩選

1.應用核酸探針

2.應用差別雜交或扣除雜交法

3.應用mRNA差別顯示技術

4.應用表達文庫

5.酵母雙雜交體系

第四章-2基因工程

1應用核酸探針分離克隆的目的基因第四章-2基因工程當把基因文庫轉移到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜之后，就可以同特異性的核酸探針進行菌落或噬菌班雜交，以便篩選出具有目的基因的陽性克隆。這個過程叫做克隆基因的分離或篩選。

應用核酸探針分離目的基因的方法叫做核酸雜交篩選法。此法的最大優(yōu)點是應用廣泛，而且相當有效，尤其適用于大量群體的篩選。

步驟：1.獲得探針2.轉膜3.雜交第四章-2基因工程探針的來源

1.某種生物實驗體系中分離到的基因序列，可作為從其它生物中分離相關基因的核酸探針。

2.根據(jù)蛋白質家族保守性，合成核酸探針。功能相同或相近的蛋白質，存在著具有共同氨基酸序列的區(qū)段（保守區(qū)），往往由彼此相鄰的6~7個氨基酸組成。

自然界中有一些蛋白質的核苷酸編碼序列，在其進化的過程中保持著高度的保守性，這樣就使核酸的種間雜交成為可能。已知組蛋白在因、肌動蛋白基因及β-神經生長因子（β-nervehrowthfactor，NGF）等基因的核苷酸序列，都是有效的同源DNA探針，并已成功地用于分離相關的基因。

在同一蛋白質家族內，也存在著具有共同氨基酸序列的區(qū)段，即所謂的保守區(qū)。這些保守區(qū)往往是由彼此相鄰的6-7個氨基酸組成，這樣的長度顯然適合于推導合成寡核苷酸探針庫，用來分離編碼相關蛋白質的cDNA。第四章-2基因工程寡核苷酸探針的人工合成

知道待分離的目的基因的蛋白質編碼產物，而對其核苷酸序列卻一無所知的情況下，可以按照測定的蛋白質氨基酸序列資料，設計合成寡核酸探針以資使用。由于探針庫中只有一種是與目的基因完全互補的，其它的探針有可能與不相關的片斷雜交，產生假陽性信號。

第四章-2基因工程

猜測體：一種人工合成的用于分離克隆基因的低簡并性的寡核苷酸探針，其核苷酸序列是根據(jù)特定物種當中某種已知蛋白質的密碼子使用頻率，同時又采納了根據(jù)猜測最可能在目的基因中出現(xiàn)的密碼子資料，選擇含有密碼子簡并程度最低的蛋白質區(qū)段進行合成。一種較長的唯一的寡核苷酸序列，它能夠大范圍的卻不能夠完全的同靶序列互補。第四章-2基因工程第四章-2基因工程第四章-2基因工程應用差別雜交或扣除雜交法分離克隆的目的基因第四章-2基因工程差別雜交（differentialhybridization）又稱差別篩選(differentialscreening)

適用于分離經特殊處理而被誘發(fā)表達的mRNA的cDNA。為了增加這種方法的有效性，后來又發(fā)展出了扣除雜交技術。

扣除雜交（subtractivehybridization）又叫扣除cDNA克?。╯ubtractivecDNAcloning）,通過構建扣除文庫得以實現(xiàn)。第四章-2基因工程差別雜交：

差別雜交的技術基礎需要有兩種不同的細胞群體：在一個細胞群體中目的基因正常表達，在另一個細胞群體中目的基因不表達。在這種情況下便可制備到兩種不同mRNA提取物。其一是含有一定比例的目的基因mRNA種的總mRNA群體，其二是不含有目的基因mRNA種的總mRNA群體。通過這兩種總mRNA（或是它們的cRNA拷貝）為探針的平行雜交，對由表達目的的基因的細胞總mRNA構建的克隆庫進行篩選。當使用存在目的基因的mRNA探針時，所有包含著重組體的菌落都呈陽性反應，在X光底片上呈現(xiàn)黑色斑點；而使用不存在目的基因的mRNA探針時，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈陽性反應，在X光底片上呈現(xiàn)黑色斑點。比較這兩種底片并對照原平板，便可以挑選出含目的基因的菌落，供作進一步研究使用.第四章-2基因工程第四章-2基因工程差別雜交的局限性：

1.差別雜交的靈敏度比較低，特別是對于那些低豐度的mRNA而言，這個缺點就顯得更加突出。

2.工作量大，差別雜交需要篩選大量的雜交濾膜，鑒定大量的噬菌斑或克隆片段，因此是十分耗費時間和金錢的工作。重復性差，兩套平行濾膜之間的DNA保有量有差別，導致雜交信號不一致。

第四章-2基因工程扣除雜交：扣除雜交法的本質是除去那些普遍共同存在的、或是非誘發(fā)產生的cDNA序列，從而使欲分離的目的基因的序列得到有效的富集，提高了分離的敏感性。

第四章-2基因工程第四章-2基因工程以T細胞受體（T-cellreceptor，TCR；有時亦稱之為T細胞抗原受體）編碼工因的分離為例子，說明扣除雜交篩選法的基本原理與簡要過程。

TCR基因只能在T細胞中表達，而不能在B細胞中表達。從T細胞mRNA制備來的單鏈cDNA，同大大超量的B細胞的mRNA在有利于發(fā)生DNA-RNA雜交的條件下保溫，所有的能夠在T和B兩類細胞中同時表達的T細胞基因的cDNA分子（約占98%），都能與B細胞的mRNA退火形成DNA-RNA雜交分子，而不能在B細胞中表達的、T細胞特有的cDNA（約占2%），由于B細胞中沒有相應的mRNA，仍然處于單鏈的狀態(tài)。將此種雜交混合物通過羥基磷灰石柱（hydroxylapatitecolumn），于是DNA-RNA雜交雜分便結合在柱上，而游離的單鏈cDNA則過柱流出。如此回收入到的T細胞特異的cDNA被轉變?yōu)殡p鏈cDNA之后，與適當?shù)摩耸删w載體重組并轉染給大腸桿菌寄主細胞，這樣便得到了T細胞持cDNA高度富集的扣除文庫。然后再按照同樣方法制備扣除的cDNA探針，即被B細胞mRNA雜交扣除了的T細胞特異的cDNA探針，篩選文庫，結果成功地分離到了T細胞的TCR基因。

扣除雜交法同樣也可以用來分離缺失突變基因.第四章-2基因工程應用mRNA差別顯示技術（DDRT-PCR）分離克隆的目的基因

(differentialdisplayreversetranscriptionpolymerasechainreaction)第四章-2基因工程根據(jù)表達特性的差異可將高等真核生物的基因分為兩大類：一類叫做看家基因（house-keeping），以其組成型表達模式維持細胞的基本代謝活動；另一類叫做發(fā)育調控基因（developmentalregulatedgene），以其時空特異性表達模式完成個體的正常的生長、發(fā)育與分化。

在生物個體發(fā)育的不同階段，或是在不同的組織或細胞中發(fā)生的不同基因按時間、空間進行有序的表達方式，叫做基因的差別表達（differentialexpression），生物的發(fā)育與分化、細胞的周期變化、生物體對外界環(huán)境壓力反應，以及個體的衰老與死亡等所有的生命過程，都可歸結于基因的差別表達.第四章-2基因工程mRNA差別顯示的原理幾乎所有的真核基因mRNA分子的3′-端都有一段poly（A）序列，根據(jù)這種序列結構特征，P.Liang等人設計合成了總共12種不同的下游引物，用以反轉錄mRNA，合成第一鏈cDNA。這種引物通常叫做3′-端錨定引物，它是由11個或12個連續(xù)的脫氧胸苷酸加上兩個3′-端錨定脫氧核苷酸組成，并用5′-T11MN或5′-T12MN通式表示。其中M為除了T以外的任何一種核苷酸（即A、G或C），而N則為任何一種核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有12種不同的排列組合方式。每一種此類人工合成的寡核苷酸引物，都將能夠把總mRNA群體的1/12分子反轉錄成mRNA-cDNA雜交分子。

由于在這些cDNA群體中，代表某一特定細胞類型或發(fā)育階段的mRNA種的含量是相當?shù)偷?，所以要把一種只在某一發(fā)育階段或某種細胞類型中表達、而在另一發(fā)育階段或某種細胞類型中不表達的目的基因分離出來，就需要通過PCR擴增.第四章-2基因工程原理：用3’-端錨定引物和反轉錄酶合成cDNA的第一鏈；用3’-端錨定引物和5’-端10-mer隨機引物組成引物對，以反轉錄第一鏈為模板進行PCR擴增（DDRT-PCR），在標準的序列膠中電泳2~3小時，可顯示出50~100條長度在100~5000bp之間的DNA條帶。第四章-2基因工程3’-錨定引物：

P.Liang等人設計合成了全部12種不同的引物，用以反轉錄mRNA，合成第一鏈cDNA。這種引物通常叫作3'-端錨定脫氧核苷酸引物，并用5'-T11MN或5'-T12MN通式表示。其中M為除了T以外的任何一種核苷酸（即A、G或C），而N則為任何一種核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有12種不同的排列組合方式。mRNA:5’-NMAAAAAA…AA-3’(12種序列)3’-NMTTTTTTT…TT-5’

第四章-2基因工程第四章-2基因工程5’-隨機引物：

10-mer，更好的同第一鏈結合，從而呈現(xiàn)出更多種的mRNA。一般用20種隨機引物和12種3’-端錨定引物組成的全部240組引物對PCR擴增后，所產生的大約20000條條帶，基本涵蓋了在一定的發(fā)育階段某種類型細胞中所表達的全部的mRNA。第四章-2基因工程

DDRT-PCR（mRNAdifferentialdisplyreversetranscriptionpolymerasechainreaction）

由于在cDNA群體中，代表特定細胞類型或發(fā)育階段的mRNA的含量非常低，所以要把一種只在某一階段或某種細胞類型中表達、而在另一發(fā)育階段或某種細胞類型中不表達的目的基因分離出來，就需要PCR擴增。第四章-2基因工程mRNA差別顯示實驗的基本過程:

1.從一對處于不同發(fā)育階段（或不同基因型）的細胞群體中分離總mRNA，并用3’-端錨定引物作反轉錄合成第一鏈cDNA;2.用5’-端隨機引物和3’-端錨定引物組成的引物對，在加入放射性同位素標記的dNTP的條件下，以第一步反轉錄產物作模板進行PCR擴增。

3.將擴增樣品在變性的DNA測序膠中進行電泳分離；第四章-2基因工程4.將有關的差別表達的DNA條帶從測序膠上切割下來回收其DNA片斷；5.膠塊中的DNA量非常少，不能用于克隆，需進行二次擴增；6.將克隆的特定的DNA分別同基因組DNA及總mRNA作Southern或Northern雜交，測序；7.以此目的片斷作探針從cDNA文庫中或基因組文庫中篩選全長的cDNA克隆或基因組克隆。第四章-2基因工程第四章-2基因工程優(yōu)點：

1.可以同時比較多個樣品表達的差異；

2.可以同時檢測“上游”及“下游”的基因；

3.檢測靈敏度高，所需樣品少，經PCR擴增一些低峰度的mRNA也可以被檢測出來；

4.結合使用了PCR和序列膠電泳分析兩項技術，使本方法顯得較單方便。第四章-2基因工程局限性：

1.假陽性比例高（50%～75%）；同一長度的條帶，含有多種DNA序列；鄰近條帶回收時，造成人為誤差；

mRNA3’-端序列保守性高，而常用3’-端cDNA作探針。

2.擴增的差別條帶分子長度比較短小（110～450bp）；

第四章-2基因工程應用表達文庫分離克隆的目的基因第四章-2基因工程表達文庫分離克隆的目的基因當沒有可用的核苷酸序列供作篩選基因文庫的探針時，將cDNA克隆在表達載體上，再導入大腸桿菌寄主細胞然后通過對蛋白質產物的鑒定，分離克隆的真核目的基因。將外源的真核基因插入在特殊設計的載體上，使之置于原核信號的控制之下，從而能夠在大腸桿菌細胞中正確地轉錄和轉譯，并表達出外源蛋白質。這樣的克隆載體，特稱為表達載體（expressionvector）。將cDNA克隆在表達載體上，再導入大腸桿菌寄生細胞，如此便構成了cDNA表達文庫。然后通過對蛋白質產物的鑒定，分離克隆的真核目的基因。

第四章-2基因工程特點：1.表達的蛋白質以融合蛋白質的形式存在，其中原核蛋白質的氨基酸序列是整合在真核蛋白質的一個末端，不易被原核細胞中的有關蛋白酶消化降解，因而顯得比較穩(wěn)定，可以得到較高的表達水平。2.cDNA片斷必須置于啟動子序列下游，在其控制之下；按正確的取向和讀碼結構插入，確保產生正確的蛋白質。第四章-2基因工程篩選的方法：

1.利用抗體篩選表達文庫；

2.測定蛋白質的功能；

3.用放射性同位素標記的、帶有特定蛋白質結合位點的DNA片斷作探針篩選表達文庫。第四章-2基因工程在表達文庫的篩選中，也是先將平板中的菌落或噬菌斑原位復印到硝酸纖維素濾膜上。如下圖所示，當培養(yǎng)平板上的噬菌體發(fā)育成斑之后，每個斑中都含有大量的由噬菌體產生的融合蛋白質，在復印過程上它們便被轉移到濾膜上。使用含有目標蛋白質的抗體（第一抗體）的溶液與濾膜混合保溫。經過適當時間之后，抗體便同已經吸附在硝酸纖維素濾膜上的融合蛋白質緊密地結合起來。然后漂洗濾膜除去未結合的抗體，再加入第二抗體或葡萄球菌A蛋白（staphylococcalproteinA，SPA），繼續(xù)與濾膜溫育，第二抗體可以是放射性同位素標記的，也可以是同生物素偶合的，或是同某種酶（比如堿性磷酸酶）結合的。通過這些第二抗體同第一抗體間的結合作用，為我們提供了可觀察的標記（如放射性標記），用以確定能夠表達可被第一抗體特異性識別的目標蛋白質的陽性克隆的位置。最后，將放射性自顯影X光底片和原初平板對照，挑取下陽性克隆，并從中分離重組噬菌體DNA進行測序鑒定。

也可以通過測定蛋白質的功能進行篩選，或用放射性同位素標記、帶有特定蛋質結合位點的DNA片段作探針篩選cDNA表達文庫，從中鑒定出能夠表達出與它發(fā)生特異性結合的目標蛋白質的陽性克隆。

第四章-2基因工程將菌落或噬菌斑原位復制到膜上處理之后蛋白質暴露，與第一抗體溫育漂洗未結合的抗體，加入經標記的第二抗體能與第一抗體結合抗體篩選表達文庫第四章-2基因工程2.測定蛋白質的功能

生物化學研究表明，存在Ca＋＋離子的條件下，鈣調蛋白能與許多種酶結合形成穩(wěn)定的復合物。將放射性同位素標記得鈣調蛋白用作探針篩選cDNA表達文庫，鑒定能夠表達出與它特異性結合的目標蛋白質的陽性克隆。第四章-2基因工程

3.用放射性同位素標記的、帶有特定蛋白質結合位點的DNA片斷作探針篩選表達文庫

鑒定能夠表達出與特定DNA片斷（真核啟動子中與轉錄因子結合的DNA元件）結合的目標蛋白質的克隆。第四章-2基因工程酵母雙雜交體系

（two-hybridsystem）第四章-2基因工程酵母雙雜交體系又叫相互作用陷阱

(interactiontrap)

有效的分離能與已知的靶蛋白質相互作用的蛋白質的編碼基因。應用于真核基因地表達調控，細胞粘合因子間的相互作用、信號轉導通路以及細胞周期與分化、反式因子的鑒定與分離等研究。第四章-2基因工程基本原理：許多真核生物的轉錄激活因子都是由兩個結構上可以分開的、功能上相互獨立的結構域組成（example）；應用重組DNA技術，也可以將來自同一個轉錄因子的、或者兩種不同轉錄因子的、分開的兩種結構域，在體內重新組裝成具有功能的轉錄因子，從而激活UAS（上游激活序列）下游啟動子調節(jié)的報告基因的表達。第四章-2基因工程Example:

釀酒酵母的半乳糖苷酶基因的轉錄激活因子GAL4，在N端1～147位氨基酸區(qū)段有一個結合域（DNA-bindingdomain,DNA-BD）；在C端768～881位氨基酸區(qū)段有一個轉錄激活域（transcriptionactivationdomain,AD）DNA-BD

能識別激活序列并與之結合；AD通過同轉錄機制中的其它成份之間的結合作用啟動下游基因進行轉錄。用DNA重組技術將它們分開，即使在同一個寄主中表達，也不會直接發(fā)生相互作用不能激活相關的效應基因進行轉錄。第四章-2基因工程寄主菌株：剔除掉GAL4基因的釀酒酵母1.SFY526和HF7c帶有報告基因lacZ、HIS3和LEU22.還有兩種可以在大腸桿菌和酵母中自主復制的穿梭載體a.pGBT9(DNA-BD)：靶基因是按正確的取向和讀碼結構被克隆在載體的多克隆位點區(qū)內，于是靶蛋白和GAL4-BD之間產生融合作用，形成雜種蛋白質

b.第二種質粒載體pGAD424(AD質粒載體)用來構建cDNA表達文庫專用載體，克隆cDNA片斷是按正確的取向和讀碼結構插入在載體的多克隆位點區(qū)內，因此由cDNA

編碼的蛋白質便會同GSL4-AD之間產生融合作用，形成雜種蛋白質。

第四章-2基因工程第四章-2基因工程第四章-2基因工程第四章-2基因工程酵母雙雜交體系的主要實驗過程：

a.選擇缺失GAL4編碼基因的酵母寄主菌株-SFY526或HF7c；

b.構建帶有GAL1UAS-啟動子-lacZ（His3）的轉化載體;

c.把已知的靶蛋白質編碼基因克隆到pGBT9的多克隆位點上，把所有cDNA都克隆到pGAD424載體上，構成cDNA表達文庫。

d.從大腸桿菌中分別提取這兩種重組質粒DNA，共轉化感受態(tài)釀酒酵母菌株。

e.將共轉化的酵母菌株涂布于缺少Leu，Trp和His的培養(yǎng)基上，篩選表達相互作用的雜種蛋白的陽性菌落。第四章-2基因工程Theend!第四章-2基因工程ClonginginE.coli大腸桿菌表達系統(tǒng)第四章-2基因工程第四章-2基因工程第四章-2基因工程第四章-2基因工程第四章-2基因工程一：大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢全基因組測序,共有4405個開放型閱讀框架基因克隆表達系統(tǒng)成熟繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國FDA批準為安全的基因工程受體生物大腸桿菌表達外源基因的劣勢缺乏對真核生物蛋白質的復性功能缺乏對真核生物蛋白質的修飾加工系統(tǒng)內源性蛋白酶降解空間構象不正確的異源蛋白細胞周質內含有種類繁多的內毒素(endotoxin)第四章-2基因工程NeedtomastertheexpressionmethodsinE.coliNeedtoknowhowtogetamutantbyhomologousrecombination

Objective&DemandsbefamiliarwithvectorsusedinE.coli第四章-2基因工程第四章-2基因工程二大腸桿菌表達載體的基本組成一個良好的大腸桿菌表達載體：有抗菌素抗性基因決定載體拷貝數(shù)的復制起點(ori)供外源基因插入的多克隆位點。參與控制轉錄與翻譯的必不可少的原件外源基因在原核寄主細胞中表達,它的編碼結構必須是連續(xù)的,不間斷的,處于寄主啟動子有效控制下。第四章-2基因工程pET-28a-c(+)Vectors第四章-2基因工程第四章-2基因工程AntibioticsAntibioticFinalconc.μg/mlKanamycin*100Ampicillin50Chloramphenicol35*HighphosphateinducesKanamycinresistance,100μg/mlissufficientwhenusingmediadescribedabove.第四章-2基因工程1啟動子可使外源基因高水平表達的最佳啟動子必須具備以下幾個條件1)強啟動子，外源基因的蛋白質的表達量占細胞總蛋白的10%-30%以上2)應能呈現(xiàn)出一種低限的基礎轉錄水平3)應該是誘導型的,能通過簡單的方式,使用廉價的誘導物得以誘導。第四章-2基因工程第四章-2基因工程第四章-2基因工程b:如果在啟動子的上游部位放置一個有效的轉錄終止子,那么由該啟動子驅動的克隆基因的轉錄便會被限制在最低本底水平。2終止子

a

:如果在克隆基因編碼區(qū)的3

末端之后，接上一個有效的轉錄終止子，便能夠阻止轉錄通讀過位于下游另一個啟動子

c:轉錄終止子還能增強mRNA分子的穩(wěn)定性,大大提高蛋白質產物水平。第四章-2基因工程在構建大腸桿菌表達載體時，通常是添加全部終止密碼子,阻止核糖體跳躍(skipping)現(xiàn)象。大腸桿菌格外偏愛使用終止密碼子UAA,當其后連上一個U而形成四聯(lián)核苷酸的情況下,轉譯終止效率便會得到進一步加強。第四章-2基因工程3轉譯起始序列mRNA的5

末端之獨特的結構特征,是決定mRNA轉譯起始效率的主要因素。在構建外源基因的高效表達載體時,需認真選擇有效的轉錄起始序列。未鑒定出通用有效的轉譯起始序列的保守結構initiationfactorconservedsequenceuniversial第四章-2基因工程4、reportergene其編碼產物可被快速測定的功能單元。追蹤某些特定的DNA結構(重組質粒)是否已經導入寄主細胞同任何一種目的啟動子連接,其表達活性可作為檢測啟動子功能的依據(jù)。usageβ－半乳糖苷酶基因lacZ、堿性磷酸酶基因、熒光素酶基因(luciferase)基因、半乳糖激酶基因(galK)氯霉素抗性(乙酰轉移酶)基因(cat)四環(huán)素抗性基因(tetr)alkalinephosphatase第四章-2基因工程三常用的大腸桿菌表達載體啟動子廣泛使用的大多數(shù)質粒表達載體啟動子λ噬菌體的PL啟動子大腸桿菌乳糖操縱子lac啟動子色氨酸操縱子trp啟動子pBR322質粒的beta－內酰胺酶啟動子LactoseOperon第四章-2基因工程四真核基因在大腸桿菌中的表達三種表達部位各有不同的優(yōu)缺點//

而且對克隆基因表達產物的制備有很大關系。在細胞質中表達在細胞周質中表達以分泌到細胞外的形式表達。1外源基因在大腸桿菌中表達蛋白質位置cytoplasmperiplasm第四章-2基因工程第四章-2基因工程1)細胞質中表達expressedincytoplasm包含體是存在于細胞質中的一種由不可溶性蛋白質聚集折疊而成的晶體結構。在表達中應盡可能限制包含體產生,并促進形成天然三維結構的蛋白質。多采用與分子伴侶共表達的方法,可能是增加外源蛋白的可溶性和折疊能力的一種有效途徑。insolublechaperon第四章-2基因工程周質:指大腸桿菌一類G-菌中，位于內膜和外膜之間的細胞結構部分。在大腸桿菌中,已成功的使用了各種不同類型信號肽,將細胞質中蛋白的蛋白質轉運至周質。周質中表達外源蛋白質優(yōu)點:A:周質中蛋白質種類少,周質中表達的外源蛋白質能夠被有效的濃縮和純化。b:周質氧化環(huán)境有利于蛋白質按正確的方式折疊c:在周質中蛋白質降解不廣泛。來自原核、真核的外源基因都成功的在大腸桿菌細胞周質中實現(xiàn)了有效表達。2)周質中表達expressedin

periplasm第四章-2基因工程3)分泌表達使在大腸桿菌中表達的外源蛋白質分泌到胞外培養(yǎng)基中進行分離純化,這種研究思路稱為外源蛋白質的分泌表達。第四章-2基因工程目的蛋白穩(wěn)定性高:目的蛋白易于分離目的蛋白末端完整將外源基因與大腸桿菌信號肽編碼序列重組在一起進行分泌表達,其N端的甲硫氨酸殘基可在信號肽剪切過程中被有效除去這些真核基因在大腸桿菌中表達時,蛋白質甲硫氨酸殘基往往不能被切除。分泌表達優(yōu)點

:重組人胰島素原若分泌到細胞周質中,其穩(wěn)定性大約是在細胞質中的10倍許多真核生物成熟蛋白N端不含有甲硫氨酸殘基。intactexcise第四章-2基因工程外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進行分泌型表達;外源基因分泌表達的表達率通常要比包涵體形式低很多分泌表達缺點相對其它生物細胞,大腸桿菌蛋白分泌機制不健全。目前產業(yè)化的異源蛋白分泌型重組大腸桿菌工程菌很少Perfectsound第四章-2基因工程分泌型重組蛋白具有較高比例正確構象，對蛋白酶不敏感蛋白質的分泌機制原核細胞周質中有多種分子伴侶,可阻止分泌蛋白隨機折疊分泌至細胞周質或培養(yǎng)基中重組蛋白很少形成分子間二硫鍵與包涵體相比randomSulferinnerouter第四章-2基因工程重組大腸桿菌--目的蛋白完全分泌分泌型目的蛋白表達系統(tǒng)構建有些G-能將細菌的抗菌蛋白（細菌素）分泌到培養(yǎng)基中,這一過程嚴格依賴于細菌素釋放蛋白

,它激活定位于內膜上的磷酸酯酶,導致細菌內外膜的通透性增大。將細菌素釋放蛋白編碼基因克隆在一個合適的質粒上攜帶大腸桿菌信號肽編碼序列和目的基因的表達質粒轉化受體細胞完全分泌型受體細胞轉化permeabilitybacteriocin第四章-2基因工程二種類型由報告基因編碼序列和另一個基因啟動子及其它的調節(jié)序列構成。用于研究啟動子功能及調控作用分子機理。由一種異源蛋白質基因編碼序列同寄主細胞誘導型啟動子構成。用于生產新型融和蛋白。2融和蛋白質表達將外源基因與受體菌自身的蛋白質編碼基因拼接在一起,并作為一個開放型閱讀框架進行表達。這種雜合基因表達出的蛋白質稱為融合蛋白。

2.1融和基因第四章-2基因工程attention外源基因應裝在受體蛋白編碼基因下游,為融合蛋白提供終止密碼子。在某些情況下,并不需要完整的受體結構基因2.2融和蛋白的表達策略融合蛋白表達質粒的構建原則受體細胞的結構基因能高效表達,且其表達產物可以通過親和層析進行特異性簡單純化兩個結構基因拼接位點處的序列設計十分重要,它直接決定融合蛋白的裂解。兩個蛋白編碼序列應保持一致的翻譯閱讀框架在DNA水平上，人工設計引入的蛋白酶切割位點或化學試劑特異性斷裂位點,可以在體外從純化的融合蛋白分子中釋放回收異源蛋白Baseonconsistent第四章-2基因工程第四章-2基因工程第四章-2基因工程3整合型異源蛋白的表達工程菌在沒有選擇壓力存在下,可以連續(xù)培養(yǎng)而不丟失目的基因表達盒,

這對以改良物種遺傳性狀為目的的基因工程特別有意義3.1整合形式表達目的蛋白的特點目的基因穩(wěn)定表達

目的基因表達率低整合型的目的基因隨受體細胞染色體DNA一起復制,

在大多數(shù)情況下相當穩(wěn)定單拷貝整合的目的基因表達率受到限制,此時可通過強化表達元件加以補償

replicate/stabilitySpecies/improvementintensify第四章-2基因工程第四章-2基因工程1基因結構存在很大差異。大多數(shù)真核基因含有內含子，細菌細胞中沒有除去內含子機制；五大腸桿菌表達真核基因存在的問題2轉錄信號不同。真核基因轉錄的mRNA分子不具有結合細菌核糖體所必須的SD序列。細菌RNA聚合酶不能識別真核生物啟動子3mRNA的分子結構有所差異。絕大多數(shù)真核mRNA分子的3

末端有poly(A)尾巴，在5

末端有一個帽結構。影響mRNA在細菌中的穩(wěn)定性及與細菌核糖體相結合的能力，阻止正常的轉錄和轉譯。4真核生物的蛋白質---有些是通過前體分子加工來的。在細菌中不存在這種修飾作用。5細菌的蛋白酶---可以識別和降解真核生物的蛋白質產物第四章-2基因工程結構不穩(wěn)定性重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導致其表觀生物學功能的喪失六基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現(xiàn)與機制1工程菌遺傳不穩(wěn)定性表現(xiàn)形式基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質粒的不穩(wěn)性,