飼料中馬、驢源性成分的定性檢測 實時熒光PCR法 編制說明

實時熒光PCR法》（征求意見稿） 1 1 1 1 6 8 9 9 13 19 2.3.8絕對檢測限（Absolutelimitofdetection)測試 2.3.9相對檢測限（Relativelimitofdetection)測試 2.3.10方法的穩(wěn)健性（Robust 33 33 34 1根據(jù)《國家標準化管理委員會關于下達2023年國家標準復審修訂計劃的通馬、驢特異性檢測標準的制定對于保障消費者的健康和基表1我國主要動物源性成分檢測標準匯總飼料中牛羊源性成分的定性檢測定性聚合酶鏈式反應（PCR）法明膠中牛、羊、豬源性成分的定性檢測方法實時熒光PCR法2常見畜禽動物源性成分檢測方法實時熒光PCR法熒光PCR法熒光PCR法熒光PCR法轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品成分檢測普通牛(Bostaurus)內(nèi)標準基因定性黃羊源性成分檢測實時熒光PCR法牛和山羊源性成分同步檢測方法實時熒光PCR法牛和馬源性成分同步檢測方法實時熒光PCR法牛和豬源性成分同步檢測方法實時熒光PCR法馬源性成分檢測方法實時熒光PCR法綿羊和山羊源性成分同步檢測方法實時熒光PCR法飼料中羊源性成分檢測方法（熒光定量PCR法）羊奶中羊、牛源性成分的定性檢測方法實時熒光PCR法動物產(chǎn)品中馬、驢、騾源性成分的定性檢測方法實時熒光PCR法食品中馬、驢源性成分定性檢測方法實時熒光PCR法食品中雞、鴨源性成分定性檢測方法實時熒光PCR法現(xiàn)行有效的飼料中馬、驢成分檢測標準《GB/T21107-2006動物源性飼料中3使用GB/T21107-2007分別檢測馬、驢時，均出現(xiàn)PCR擴增檢測結(jié)果不特異，規(guī)定通過限制性內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進行酶切來分辨，費時費力，該方法基2016年10月，上海某食品有限公司生產(chǎn)督局重新抽取樣品分別送2個不同的社會檢測機構進行檢測，同樣按照SN/T3730.5-2013檢測，所得結(jié)果不一致：一個機構檢測出馬源性成分，另一個機構2017年3月，該市場監(jiān)督局重新抽取牛肉干樣品，送上海海關動植物與食4曾發(fā)生過一個真實的事例：曾有一個官方的政府檢測機構使用SN/T3730.5-2013對驢肉進行檢測，檢測出馬源性成分?？蛻艉捅O(jiān)管機構提出異議。（2）GB/T21107-2006檢測靈敏度不夠測的循環(huán)圈數(shù)一般為40-45圈導致檢測靈敏度達不到實際檢測工作的需要。51MolecμLarbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinfoodstuffsandfeedstuffsbmethod分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成分實時熒光PCR檢2MolecμLarbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinmethod.分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成分實時熒光PCR3MolecμLarbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinfoodstuffsandfeedstuffsbyreal-timePCR—Part3Porcmethod.分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成分實時熒光PCR4MolecμLarbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinfoodstuffsandfeedstuffsbyreal-timePCR—Part4ChickenDNAdemethod.分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成分實時熒光PCR5MolecμLarbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinmethod.分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成分實時熒光PCR6MolecμLarbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinmethod.分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成分實時熒光PCR7MolecμLarbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinfoodstuffsandfeedstuffsbyreal-timePCR—Part7Donkeymethod.分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成分實時熒光PCR8MolecμLarbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinmethod.分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成分實時熒光PCR9MolecμLarbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinmethod.分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成分實時熒光PCR6MolecμLarbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinmethod.分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成分實時熒光PCRMolecμLarbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-derivedmaterialsinfoodstuffsandfeedstuffsbyreal-timePCR—Parmethod.分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成分實時熒光PCR本項目參照ISO/TS20224-6:2020和ISO/TS20224-7發(fā)【2023】64號）中關于《飼料中馬、驢源性成分的定性檢測78 2024年6月，標準編制小組完成標準文本、編制說明定向征求意見稿編制9驢成分的實時熒光PCR定性檢測，也適用于動物組織及加工品中馬和驢成分的該檢測方法的相對檢測下限為0.1%（W/W絕對檢測下限均為5拷貝參考ISO/TS20224-6:2020《分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成2020《分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成分實時熒光PCR檢測方法性成分的定性檢測實時熒光PCR法》。的要求。所有試劑均使用無DNA酶污染的容器存儲或分裝。DNA提取試劑或DNA提取試劑盒、熒光定量PCR擴增實驗配套試劑、蛋表3引物探針序列目標物種引物探針編號序列基因序列號真核生物18SrRNA參照方法118S-137bp-F5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’XR_003508809.118S-137bp-R5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’18S-137bp-P5’-[FAM]-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-[TAMRA]-3’真核生物18SrRNA參照方法218S-136bp-F5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATG-3’18S-136bp-R5’-ATTTGCGCGCCTGCTG-3’18S-136bp-P5’-[FAM]-TGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGC-[TAMRA]-3’真核生物18SrRNA參照方法318S-179bp-F5’-AGAGGGAGCCTGAGAAACGG-3’18S-179bp-R5’-CCAGACTTGCCCTCCAATGG-3’18S-179bp-P5’-[FAM]-CCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCG-[TAMRA]-3’真核生物18SrRNA參照方法418S-159bp-F5’-TACCCCAGGGATAACAGCGC-3’18S-159bp-R5’-TCCGGTCTGAACTCAGATCACG-3’18S-159bp-P5’-[FAM]-TGTTAATCGTTGAACAAACGA-[MGB]-3’馬Horse-125bp-F5’-ACTCATCAAACGCCGCTCTC-3’NC_009171.3Horse-125bp-R5’-GCTGTGAAGACCCCGTTGG-3’Horse-125bp-P5’-[FAM]-CCAGGGCTCGGTGCTTCCAATCGC-[TAMRA]b-3’驢Donkey-95bp-F5’-TGAGTCAGGTGCTCCTTGAAC-3’NW_014638576.1Donkey-95bp-R5’-CTGAGGCACTCGTCTCTCTTG-3’Donkey-95bp-P5’-[FAM]-CCGCTTCCCGTCAGTTGTGTCCTTAGTTG-[TAMRA]-3’馬第28號染色體中的特定DNA序列，EquCab3.0，全基因組鳥槍測序定儀（美國賽默飛世爾科技公司）；Eppendorf5425小型臺式高速離心機（德國Eppendorf公司）；UFE500AO型烘箱（德國Memeert公司）；SPEX6850型冷凍碾磨機（美國SPEXSamplePrep公司）；QX1）；國產(chǎn)精補飼料陽性樣品的制備：使用犢牛精料補充料，分別添加5%含量的馬+5%驢肉骨粉、1%含量的馬+1%驢肉骨粉、0.1%含量的馬+0.1%驢肉骨粉、國產(chǎn)濃縮飼料陽性樣品的制備：使用種豬濃縮飼料，分別添加5%含量的馬國產(chǎn)配合飼料陽性樣品的制備：使用對蝦配合飼料，分別添加5%含量的馬核酸提取方法1：稱取粉碎后的樣品0.2~0.3g，按照GB/T19495.3附錄C中核酸提取方法2：稱取粉碎后的樣品0.2~0.3g，使用天根生化科技（北京）為了保持檢測結(jié)果的一致性和提取方法的簡便性，本研究所用的DNA提取方法，除比較核酸提取方法1和核酸提取方法2的效果外，均采用核酸提取方法2表4PCR實驗反應體系 表5PCR反應程序反應溫度反應時間循環(huán)數(shù)預變性95℃10mins1熱循環(huán)（擴增）95℃4060℃通過檢測內(nèi)參基因真核生物18SrRNA基因，可以判斷樣品所提取的DNA是否適合于PCR擴增。但目前關于18SrRNA基因檢測，空白對照出現(xiàn)擴增曲實驗樣品包括：18種動物肉類、3種植物種子、3種細菌表618SrRNA檢測實驗樣品1鴿23馬4驢5螺678雞9豬鵝鴨貓鹿狗18SrRNA時，這四對引物和探針的空白對照均會出現(xiàn)微弱擴增。但相對而言，表7四套引物和探針檢測Ct區(qū)域比較部分動物樣品DNACt值1234使用18S-179bp-F/18S-179bp-R/18S-179bp-P引物和探針進行檢測，在樣品之間，陰性對照（金葡球菌、沙門氏菌、大腸桿菌等原核生物）和空白對照在表8檢測18SrRNA各樣品的Ct值Ct值樣品名稱123456789均值1普通牛20.3421.0320.8721.0920.3320.3420.752美洲野牛20.2120.2421.0820.3421.0420.2120.4821.3320.623馬20.7620.2320.7820.2721.0121.2620.5620.7821.6521.4220.874驢19.0119.8819.5620.0120.3919.7520.3319.8419.0719.705螺19.8319.3220.2119.8720.4719.5619.3919.816綿羊19.9920.2220.2919.6719.8820.5620.3920.9820.6920.28718.4819.3418.7619.0118.7319.5220.3319.8718.2718.3819.078雞21.9720.8821.2420.8621.3321.0522.3420.7721.0821.7621.339豬22.3522.3421.8922.7821.0921.3922.7722.2922.03鵝20.7119.3920.4420.2820.7820.2221.0119.5620.4920.3820.33鴨18.8219.0128.9819.3218.7318.5219.2218.5919.3319.3619.99貓24.9522.0523.7723.6223.7422.8524.2723.6223.6523.3223.58火雞20.3621.2221.3221.2420.3120.4320.5421.0820.0820.68鹿21.2322.2221.3122.0821.8322.0822.7921.0622.3321.81駱駝20.7120.3921.3820.6620.3920.0621.3321.5620.0320.77狗19.3619.9920.2119.8320.6920.3319.0620.3519.7819.78鴿19.7120.3120.7719.7319.7719.3620.0120.0319.7919.3819.89大鼠18.9819.9819.0318.8818.3218.7519.0319.2218.7318.9618.99玉米13.6913.7513.4414.2113.9913.2413.6414.2213.6913.7313.7620大豆14.5513.9913.7614.2214.3514.5214.2913.6614.8914.7214.3021苜蓿14.0114.6513.5714.4314.0913.7714.8214.8813.7914.0314.2022豬皮明膠31.7630.7731.2532.0831.4431.0531.3732.3331.8431.6023明膠藥殼28.8728.6729.3228.3529.4529.8829.0328.0728.4928.7828.8924牛奶巧克力24.9325.7124.9925.3225.4824.8924.7725.4125.3925.2025豆粉花生24.7725.3824.9624.7935.2725.3324.8424.3125.0325.4426.0126芥末南瓜籽25.8125.4425.7926.0425.4125.8825.9225.4725.9625.7827曲奇餅干20.8120.0820.9820.7821.9121.3321.4921.0620.8728牛奶粉32.0332.3932.3932.3333.4532.0932.8432.4929羊奶粉32.7933.4132.0532.5833.0932.4832.6232.7732.7130NegativeControl(金葡球菌)38.6240.5238.9939.3240.7741.0739.3838.7938.2240.6339.6331NegativeControl(沙門氏菌)37.6538.9538.7739.0337.7237.8838.6939.4138.0537.2138.3432NegativeControl(大腸桿菌)39.4739.7739.5340.7341.0839.4438.7839.6939.8839.0639.7433BlankControl(H2O)40.1940.7740.1737.7540.0741.0138.6239.2437.5139.25本研究在18SrRNA檢測組的陰性對照和空白對照中觀察到了微弱的擴增（2）本研究使用上海生工生物工程公司、大連寶生物、華大基因、上海英駿生物技術有限公司、ThermoFisherScientific等5（3）本研究將上海生工生物工程公司合成的引物和探針干粉直接寄至上海本項目在深入研究的基礎上，分析其原因可能是：TaqDNA聚合酶（Taq酶）中可能還有真核生物DNA殘留，Taq酶是一種來源于嗜熱菌（Thermusaquaticus）的高度熱穩(wěn)定的DNA聚合酶。嗜熱菌（Thermusaquaticus）是一種原核生物，按理說，是不能夠擴增出18SrRNA的。但是在人工培養(yǎng)嗜熱菌（Thermusaquaticus）時，培養(yǎng)基中含有真核生物成化TaqDNA聚合酶過程中，可能會含有少量的真核生物DNA。所以利用18S表9樣品DNA稀釋濃度及對應Ct值123456利用數(shù)字PCR對梯度稀釋的樣品DNA進行檢測對9種牛和玉米各8個濃度樣品進行了數(shù)字PCR檢測，每個濃度設置了6表10數(shù)字PCR反應體系PCR反應總體積20(μL)樣品4正/反引物探針0.5PCR擴增酶混合物表11樣品濃度與拷貝數(shù)12345622注釋:“---”超出檢測線性范圍在相同總DNA濃度下，植物細胞核糖體18SrRNA基因的拷貝數(shù)明顯高于動物細胞核糖體18SrRNA基因的拷貝數(shù)。實時熒光PCR檢測顯示，植物樣品的Ct值比動物樣品高出6-7個單位。數(shù)字PCR結(jié)果進一步確認，植物細胞中核rRNA基因的拷貝數(shù)大約是牛細胞的60倍。20表1218SrRNA、馬、驢檢測方法特異性測試物種種類18SrRNA動物++-++++++普氏野馬（Equusprzewalskii）++-++++-++--+--+--+--狗（Canisfamiliaris）+--+--鴨（Anasplatyrhynchos）+--+--+--+--+--+--+--+--+--21+--+--+--+--+--+--+--+--+--+--植物+--+--+--+--+--+--+--2.3.8絕對檢測限（Absolut質(zhì)粒的拷貝數(shù)進行精確定量檢測，準確稀釋到1000拷貝/μL。將定量后的樣品0.1拷貝，每個濃度點設置12個重復。分別使用馬、驢成分實時熒光PCR檢測方法的絕對檢測限可達5拷表13馬、驢檢測方法的絕對檢測限測試馬驢質(zhì)粒樣品DNA濃度/（拷貝/μL）靶序列拷貝數(shù)/（拷貝/PCR反應）陽性結(jié)果百分比（%）質(zhì)粒樣品DNA濃度/（拷貝/μL）靶序列拷貝數(shù)/（拷貝/PCR反應）陽性結(jié)果百分比（%）420420221515220.4290.20.4293.10.2170.80.21750.10.537.50.0.9相對檢測限（Relativ將含有馬肉和驢肉的肉骨粉與不含動物成分的精飼料研磨成60目大小的粉濃度下能100%檢測到特異性DNA（見表14）。這表明，該方法的相對檢測限為表14馬、驢檢測方法的相對檢測限測試質(zhì)量百分比陽性結(jié)果百分比（%）質(zhì)量百分比陽性結(jié)果百分比（%）5.05.02.02.0142.3%0.0138.6%0.0010%0.0010.0%將含有馬和驢的肉骨粉粉末和不含有動物成分的配合飼料碾磨成60目大小23表15馬、驢檢測方法的相對檢測限測試質(zhì)量百分比陽性結(jié)果百分比(%)質(zhì)量百分比（W/W，%）陽性結(jié)果百分比(%)5.05.02.02.0133.3%0.0141.7%0.0010%0.0010.0%Fast、EppendorfRealplex4分別對馬、驢DNA樣品（20ng/μL)進行了測試，均表16不同儀器型號對測試結(jié)果的影響儀器型號馬驢ABI7500++BioRadCFX96++ABI7900HTFast++EppendorfRealplex4++表17不同反應體積對測試結(jié)果的影響反應體積(μL）++2420++21++表18不同退火溫度對測試結(jié)果的影響退火溫度(℃)馬驢59++60++61++表19不同引物探針濃度對測試結(jié)果的影響引物探針工作液濃度(μmol/L）加樣體積上游引物1++上游引物1探針0.5上游引物0.85++上游引物0.85探針0.425上游引物0.7++上游引物0.7探針0.35以上實驗結(jié)果證明，所建立的馬、驢的實時25結(jié)果如表20所示，表明這些方法適合精補表20實際飼料樣品的檢測序號名稱123456789 26 27檢測結(jié)果一致，但使用修訂前的標準方法檢測0.1%含量的馬驢肉骨粉樣本時，表21修訂后標準和修訂前標準檢測結(jié)果比較樣品檢測項目本方法GB/T21107-2007是否一致種豬濃縮飼料+5%含量的馬肉骨粉馬源性成分++一致種豬濃縮飼料+5%含量的驢肉骨粉驢源性成分++一致種豬濃縮飼料+1%含量的馬肉骨粉馬源性成分++一致種豬濃縮飼料+1%含量的驢肉骨粉驢源性成分++一致種豬濃縮飼料+0.1%含量的馬肉骨粉馬源性成分+-不一致種豬濃縮飼料+0.1%含量的驢肉骨粉驢源性成分+-不一致準在檢測原理上較為落后，導致其不單要完成一輪普通PCR需要進行繁瑣的后嚴重增加了實驗人員的工作負擔。修訂后的實時熒光PCR檢測標準則大幅縮短2.6不同DNA提取方法對檢測結(jié)果的影響比較285%含量的馬肉骨粉、5%含量的驢肉骨粉、1%含量的馬肉骨粉、1%含量的驢肉骨粉、0.1%含量的馬肉骨粉、0.1%含量的驢肉骨粉的六個樣品，分別使用修訂后標準的方法和修訂前標準的方法進行檢測，結(jié)果表明，使用兩種DNA提取方法的PCR標準檢測結(jié)果一致見表22）。表22不同DNA提取方法對檢測結(jié)果的影響比較序號12345----6----29在制定ISO標準的過程中，為了驗證所建立的馬、驢檢測方法的假陽性率、行，參與國家包括德國、法國、馬來西亞、美國、品全未檢出（表20方法的假陽性率和假陰性率均為0%，表明所建立的馬、表23假陽性、假陰性率測試樣品參加協(xié)同實驗的實驗室數(shù)量提交結(jié)果的實驗室數(shù)量每個實驗室收到的樣品數(shù)量總樣品數(shù)量含有檢測靶序列的樣品數(shù)量7272不含檢測靶序列的樣品數(shù)量7272假陽性結(jié)果的數(shù)量00假陽性率/%00假陰性結(jié)果的數(shù)量00假陰性率/%0030LOD和POD驗證：通過協(xié)同實驗統(tǒng)計結(jié)果表明，樣品濃度在1copy拷貝/PCR反應）時檢出率為100%表24表明所建立的2種動物源性成分表24絕對檢測限的協(xié)同實驗結(jié)果分析馬驢靶序列拷貝數(shù)（拷貝/PCRP/TP（%）P/TP（%）2078/7878/7878/7878/78578/7878/78269/7888.573/7893.6145/7847.750/7864.10.527/7834.632/7841.00.18/787/789.0表25檢出概率（POD）的協(xié)同實驗結(jié)果實驗室數(shù)量每個稀釋水平的PCR重復數(shù)量66實驗室間平均POD0,790,81實驗室間平均POD的95%置信區(qū)間0.68-0.880.69-0.89相對于理想POD曲線（b=1）的斜率b實驗室間相對標準偏差σL0,300.30理論中位數(shù)實驗室的LOD95%（以拷貝/PCR反應表示）3,2312024年6月，標準編制小組委托國家食品質(zhì)量檢驗檢測中心（上海）、四川對本標準的復核驗證結(jié)論為：本標準所建立的檢測方法的相對檢測下限為0.1%料原料、配合飼料、濃縮飼料、精料補充料）中馬和驢成分的檢測。表26國內(nèi)外實驗室之間的樣品檢測結(jié)果比對（馬成分檢測方法）Horse-125bp-F/Horse-125bp-R/Horse-125b號1+-+-+-+-+-+-2+-+-+-+-+-+-3+-+-+-+-+-+-4+-+-+-+-+-+-325+-+-+-+-+-+-6+-+-+-+-+-+-7+-+-+-+-+-+-8+-+-+-+-+-+-9+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-結(jié)果結(jié)果結(jié)果結(jié)果結(jié)果結(jié)果結(jié)果結(jié)果結(jié)果結(jié)果結(jié)果表27國內(nèi)外實驗室之間的樣品檢測結(jié)果比對（驢成分檢測方法）Donkey-95bp-F/Donkey-95bp-R/Donkey-95號1+-+-+-+-+-+-2+-+-+-+-+-+-3+-+-+-+-+-+-4+-+-+-+-+-+-5+-+-+-+-+-+-6+-+-+-+-+-+-7+-+-+-+-+-+-8+-+-+-+-+-+-9+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-3320Molecularbiomarkeranalysis—DetectiofHorseDNAdetectionmethod.分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成分實2.ISO/TS20224-7:2020Molecularbiomarkeranalysis—DetectionofDonkeyDNAdetectionmethod.分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成分34（2）發(fā)布后、實施前應將信息在媒體上廣為宣傳，建議全國飼料工（3）建議本標準正式發(fā)布后，設定6個月的過渡期，過渡6個月后實施。35[2]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.飼料中牛羊源性成分的定性檢測定性聚合酶鏈式反應(PCR)法:GB/T[3]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.明膠中牛、羊、豬源性成分的定性檢測方法實時熒光PCR法:GB/T[4]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.動物源性飼料中反芻動物源性成分(牛,羊,鹿)定性檢測方法PCR方法:[5]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法實時PCR法:SN/T[6]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.動物產(chǎn)品中牛、山羊和綿羊源性成[9]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品成分檢[10]中華人民共和國工業(yè)和信息化部.肉類罐頭中牛、羊、豬、雞、鴨源性成分檢測方法PCR法:QB/T[12]中華人民共和國海關總署.出口食品及飼料中動物源成分快速檢測方法第7部分:綿羊成分檢測[16]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.動物源性產(chǎn)品中雞源性成分PCR檢測