小麥及其制品中轉(zhuǎn)基因成分普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢驗(yàn)方法編制說(shuō)明

《小麥及其制品中轉(zhuǎn)基因成分普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢測(cè)方法》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)編制說(shuō)明一、任務(wù)來(lái)源和制標(biāo)依據(jù)本國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法的制訂是根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)委下達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)制訂計(jì)劃（編號(hào)20071660-T-449），在完成了兩項(xiàng)科研課題和一項(xiàng)檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上由黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局負(fù)責(zé)起草的。本標(biāo)準(zhǔn)是按照GB/T1.1-2000《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第一部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)規(guī)則》的要求進(jìn)行編寫(xiě)的。二、編制本標(biāo)準(zhǔn)的目的和意義由于小麥的遺傳基因非常復(fù)雜，所以轉(zhuǎn)基因小麥品種的研究比其它作物花費(fèi)了更長(zhǎng)的時(shí)間。2001年美國(guó)孟山督公司獲得世界第一株抗草甘膦除草劑轉(zhuǎn)基因小麥品系(RoundupReadyWheat)，并于2005年6月在美國(guó)FDA申請(qǐng)注冊(cè)登記，計(jì)劃2006年后進(jìn)行商業(yè)化種植；美國(guó)氰胺公司創(chuàng)制的抗咪唑啉酮(IMI-Wheat)除草劑轉(zhuǎn)基因小麥，德國(guó)艾格福公司創(chuàng)制的抗草銨膦（LibertyLinkWheat）除草劑轉(zhuǎn)基因小麥，還有其它抗病、抗蟲(chóng)和改良品質(zhì)的轉(zhuǎn)基因小麥品種也相繼問(wèn)世。目前商品化的轉(zhuǎn)基因小麥?zhǔn)?999年加拿大批準(zhǔn)食用的SWP965001品系，它是通過(guò)化學(xué)誘變獲得的抗硫苯脲除草劑的作物。我國(guó)的轉(zhuǎn)基因小麥有改良品質(zhì)的（優(yōu)質(zhì)HMV谷蛋白亞基），抗穗發(fā)芽，抗蚜蟲(chóng)（GAN），雙價(jià)抗病基因，抗除草劑的等等品系。目前我國(guó)已經(jīng)被批準(zhǔn)進(jìn)入生產(chǎn)試驗(yàn)的是改良品質(zhì)的轉(zhuǎn)基因小麥。如本課題研究的提高小麥面筋含量并改善面包的烘烤品質(zhì)的高分子量谷蛋白亞基轉(zhuǎn)基因小麥品系B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2。目前，國(guó)際上主要的糧食作物ISO標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有轉(zhuǎn)基因小麥的檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)，而我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T）和現(xiàn)有的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及檢驗(yàn)檢疫標(biāo)準(zhǔn)（SN/T）中也沒(méi)有轉(zhuǎn)基因小麥的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)。為此，國(guó)家質(zhì)檢總局和國(guó)家科技部非常重視，于2004年分別下達(dá)給我局科研項(xiàng)目《轉(zhuǎn)基因小麥定性定量PCR檢測(cè)方法研究》（編號(hào)2004IK084）和《轉(zhuǎn)基因小麥的基因鑒別技術(shù)研究》（編號(hào)202DIA50034-03）。國(guó)家質(zhì)檢總局同時(shí)下達(dá)了檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，（編號(hào)B117-2003）。因此迫切需要盡快研究建立轉(zhuǎn)基因小麥的定性定量PCR檢測(cè)方法。本標(biāo)準(zhǔn)方法是建立在由黑龍江局承擔(dān)并完成了兩項(xiàng)（國(guó)家質(zhì)檢總局科技司2004年《轉(zhuǎn)基因小麥中定性定量PCR檢測(cè)方法研究》課題（編號(hào)2004IK084）和國(guó)家科技部2002年度社會(huì)公益研究專(zhuān)項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目《影響食物安全的生物種類(lèi)基因鑒別技術(shù)研究》中的2004年子課題《轉(zhuǎn)基因小麥的基因鑒別技術(shù)研究》（編號(hào)202DIA50034-03））科學(xué)研究的成果基礎(chǔ)上，同時(shí)完成了一項(xiàng)檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T1943-2007《小麥中轉(zhuǎn)基因成分PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法》的前提下完成制訂并起草的。該檢測(cè)方法除了我們建立的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)外，目前在國(guó)內(nèi)外一直是空白。因此急需建立我國(guó)轉(zhuǎn)基因小麥的PCR定性檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，以滿(mǎn)足我國(guó)進(jìn)出口小麥及其制品轉(zhuǎn)基因成分檢驗(yàn)需求。黑龍江局在標(biāo)準(zhǔn)的研究過(guò)程中，針對(duì)目前的轉(zhuǎn)基因作物中轉(zhuǎn)基因小麥的特殊性（六倍體作物），不僅在國(guó)內(nèi)外首次找到了小麥屬的內(nèi)源基因GAG56D，而且對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥的外源基因（nos（終止子），ubiquitin（啟動(dòng)子），bar，uidA）和Wx012內(nèi)源基因同時(shí)進(jìn)行了理論blast比對(duì)和普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。特別是針對(duì)目前檢驗(yàn)檢疫行業(yè)普遍使用的ABI和LighCycler等熒光PCR儀器進(jìn)行了PCR體系和擴(kuò)增條件的探索研究實(shí)驗(yàn)，同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥及其制品和設(shè)計(jì)的引物和探針的檢測(cè)特異性、靈敏度和檢測(cè)低線進(jìn)行了研究，并對(duì)所建立的該國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行了應(yīng)用研究，建立了可行、穩(wěn)定、特異、快速的PCR檢驗(yàn)方法。經(jīng)過(guò)了檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室和高等學(xué)校及科研單位等社會(huì)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證，結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定可靠。經(jīng)光盤(pán)文獻(xiàn)檢索,除了本制標(biāo)人制訂的檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T1943-2007《小麥中轉(zhuǎn)基因成分PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法》外，未查到國(guó)內(nèi)外相關(guān)的轉(zhuǎn)基因小麥PCR檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)的報(bào)道。三、建立本標(biāo)準(zhǔn)方法的實(shí)驗(yàn)研究1材料與方法1.1試驗(yàn)材料與來(lái)源1.1.1轉(zhuǎn)基因小麥材料：提高小麥面筋含量并改善面包的烘烤品質(zhì)的高分子量谷蛋白亞基B73-6-1（簡(jiǎn)寫(xiě)為B73），B72-8-11b（簡(jiǎn)寫(xiě)為B72）和B102-1-2（簡(jiǎn)寫(xiě)為B102）轉(zhuǎn)基因小麥品系（來(lái)源于華中科技大學(xué)）。1.1.2特異性試驗(yàn)的非轉(zhuǎn)基因作物材料：冬小麥京花1號(hào)；春小麥（簡(jiǎn)寫(xiě)為Mck）等品系；普通小麥樣品（簡(jiǎn)寫(xiě)為M1，M2）一粒小麥,二粒小麥，硬粒麥，斯卑爾脫小麥，山羊草，大麥，蕎麥，燕麥，谷子，水稻（白米，黑米），大豆，玉米，油菜，亞麻等分別來(lái)源于北京農(nóng)林科學(xué)院，中國(guó)農(nóng)業(yè)科院品種資源所，黑龍江農(nóng)業(yè)科院小麥所，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)。1.1.3實(shí)驗(yàn)樣品的制備A．實(shí)驗(yàn)樣品：A1.轉(zhuǎn)基因小麥和制品的陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)材料：轉(zhuǎn)基因小麥B73和非轉(zhuǎn)基因小麥京花1號(hào)分別稱(chēng)重后，用105℃水分測(cè)定法烘至水分一致后，分別用液氮冷凍研磨機(jī)充分研磨成粉末狀，然后將B73和京花1號(hào)樣品按重量比，分別配制成含有1%，0.5%，0.1%，0.05%轉(zhuǎn)基因小麥B73成分樣品用于做小麥外源基因檢測(cè)靈敏度。再用1%B73轉(zhuǎn)基因小麥樣品分別按照制作油條和面包簡(jiǎn)單工藝加工制作成1%B73轉(zhuǎn)基因小麥油條和1%B73轉(zhuǎn)基因小麥面包A2.非轉(zhuǎn)基因小麥樣品：非轉(zhuǎn)基因小麥京花1號(hào)小麥和非轉(zhuǎn)基因大米分別稱(chēng)重后，用105℃水分測(cè)定法烘至水分一致后，分別用液氮冷凍研磨機(jī)充分研磨成粉末狀，然后將京花1號(hào)和大米樣品按重量比，分別配制成含有0.5%，0.1%，0.05%京花1號(hào)小麥成分樣品用于做內(nèi)源基因靈敏度檢測(cè)A3.其它樣品材料：米粉,豆粉，大米、餅干、嬰兒麥粉、方便面、燕麥片均來(lái)自實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)樣品。1.1.3試劑、儀器、引物探針、PCR反應(yīng)體系和條件等均按照該轉(zhuǎn)基因小麥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定進(jìn)行操作。2、轉(zhuǎn)基因小麥普通定性PCR檢測(cè)方法的建立2.1小麥屬GAG56D內(nèi)源基因特異性的檢測(cè)通過(guò)genebank中編號(hào)為10638295搜索和比對(duì)分析找出了小麥內(nèi)參照γ-麥谷醇溶蛋白基因GAG56D（genebank號(hào)為GI：10638295），并用設(shè)計(jì)并合成的擴(kuò)增該基因的引物對(duì)實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小麥和非轉(zhuǎn)基因小麥樣品,二粒小麥，硬粒麥，山羊草，斯卑爾脫小麥均被擴(kuò)增出328bp的PCR產(chǎn)物，空白對(duì)照和其它作物中沒(méi)有擴(kuò)增出目的片斷（圖1）。說(shuō)明γ-麥谷醇溶蛋白內(nèi)源參照基因只是小麥屬中特有的內(nèi)參照基因。同時(shí)我們用熒光定量PCR也進(jìn)一步驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖1GAG56D基因PCR擴(kuò)增結(jié)果1：DL2000，2：B73，3：京花1號(hào)小麥，4：硬粒麥，5：油菜籽，6：亞麻，7：二粒小麥，8：山羊草，9：斯卑爾脫小麥圖1GAG56D基因PCR擴(kuò)增結(jié)果1：DL2000，2：B73，3：京花1號(hào)小麥，4：硬粒麥，5：油菜籽，6：亞麻，7：二粒小麥，8：山羊草，9：斯卑爾脫小麥，10：蕎麥，11：大豆，12：玉米粉，13：大米粉，14：黑米，15：小米，16：空白對(duì)照。擴(kuò)增片段328bp。12345678910111213141516250bp250bp500bp2.2小麥內(nèi)源Wx012基因特異性的檢測(cè)通過(guò)大量文獻(xiàn)查詢(xún)，我們選擇了Wx012基因作為小麥物種特異內(nèi)參照基因，該基因是被實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了的單拷貝或低拷貝內(nèi)源參照基因[1]。文獻(xiàn)作者針對(duì)Wx012基因設(shè)計(jì)了多組引物，對(duì)黑麥，山羊草，意大利小米，普通小米，大豆，小麥，水稻，玉米，芝麻，硬粒麥，油菜籽，芝麻等作物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終選擇了一對(duì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為102bp的引物，該基因除小麥外，在其它作物中都沒(méi)有擴(kuò)增。本研究在以上文獻(xiàn)的研究基礎(chǔ)上進(jìn)行了補(bǔ)充研究，對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥（B73）,京花1號(hào)，蕎麥，燕麥片進(jìn)行了PCR擴(kuò)增,發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因小麥和京花1號(hào)中出現(xiàn)102bp擴(kuò)增片段，在蕎麥和燕麥片中沒(méi)有（圖2）。123456123456250bp100bp250bp100bp500bp圖2Wx012基因特異性PCR檢測(cè)結(jié)果1：水空白對(duì)照；2：京花1號(hào)小麥；3：蕎麥；4：燕麥片；5：B73；6：DL2000；擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度102bp。2.3小麥及其制品外源NOS基因（終止子）的檢測(cè)采用歐盟推薦的NOS基因引物（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度180bp），以含有NOS終止子的B73為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)0.1%轉(zhuǎn)基因小麥粉，1%轉(zhuǎn)基因油條，1%轉(zhuǎn)基因面包和非轉(zhuǎn)基因小麥京花1號(hào)和市售方便面的總DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到預(yù)期的180bp的PCR擴(kuò)增片段（圖3），用實(shí)時(shí)熒光PCR驗(yàn)證出現(xiàn)預(yù)期的擴(kuò)增曲線。圖3NOS基因PCR檢測(cè)結(jié)果1：100bpDNAladdermarker；2：B73；3：水空白對(duì)照；4：圖3NOS基因PCR檢測(cè)結(jié)果1：100bpDNAladdermarker；2：B73；3：水空白對(duì)照；4：1%轉(zhuǎn)基因面包；5：1%轉(zhuǎn)基因油條；6：0.1%轉(zhuǎn)基因小麥粉；7：京花1號(hào)小麥；8：市售方便面。擴(kuò)增目的片斷大小180bp。12345678100bp100bp500bp2.4小麥及其制品外源ubiquitin基因（啟動(dòng)子）的檢測(cè)及特異性的鑒定2.4.1針對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥genbank中編號(hào)為AY572837.1GI:45862532的ubiquitin啟動(dòng)子的序列設(shè)計(jì)了一對(duì)擴(kuò)增長(zhǎng)度為314bp的引物，對(duì)0.1%轉(zhuǎn)基因小麥粉，1%轉(zhuǎn)基因油條、1%轉(zhuǎn)基因面包和非轉(zhuǎn)基因小麥京花1號(hào)和市售方便面的總DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增，得到預(yù)期的片段（圖4）。用實(shí)時(shí)熒光PCR驗(yàn)證，出現(xiàn)預(yù)期擴(kuò)增曲線。12345671234567500bp100bp500bp100bp圖4Ubiquitin基因PCR檢測(cè)結(jié)果1：100bpDNAladdermarker；2：水空白對(duì)照；3：0.1%轉(zhuǎn)基因小麥粉；4：1%轉(zhuǎn)基因油條；5：1%轉(zhuǎn)基因面包；6：京花1號(hào)小麥；7：市售方便面。擴(kuò)增目的片斷大小314bp。2.4.2Ubiquitin基因特異性的鑒定：因?yàn)閡biquitin基因是玉米泛素內(nèi)源基因，為了進(jìn)一步確定ubiquitin基因特異性，針對(duì)非轉(zhuǎn)基因小麥京花1號(hào)、轉(zhuǎn)基因小麥B73、大麥、蕎麥、燕麥片、米粉、豆粉、黃玉米、粘玉米、亞麻作物我們進(jìn)行了PCR特異性實(shí)驗(yàn)。凝膠電泳分析結(jié)果表明，除了轉(zhuǎn)基因小麥（B73），黃玉米和粘玉米出現(xiàn)目的基因擴(kuò)增外（314bp），其它作物和空白對(duì)照中沒(méi)有擴(kuò)增出目的片斷（圖5）。123456789101112123456789101112圖5UbiquitinPCR擴(kuò)增結(jié)果：1:水空白對(duì)照,2:大麥,3:蕎麥,4:燕麥片,5:京花1號(hào)小麥,6:B73,7:米粉,8:豆粉,9:黃玉迷,10;粘玉米,11;亞麻,12;DL2000。擴(kuò)增目的片斷大小314bp。圖5UbiquitinPCR擴(kuò)增結(jié)果：1:水空白對(duì)照,2:大麥,3:蕎麥,4:燕麥片,5:京花1號(hào)小麥,6:B73,7:米粉,8:豆粉,9:黃玉迷,10;粘玉米,11;亞麻,12;DL2000。擴(kuò)增目的片斷大小314bp。250bp500bp2.5小麥及其制品外源bar基因的檢測(cè)針對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥中bar基因的序列設(shè)計(jì)了175bp長(zhǎng)度的一對(duì)引物，對(duì)0.1%轉(zhuǎn)基因小麥粉、1%轉(zhuǎn)基因油條、1%轉(zhuǎn)基因面包和非轉(zhuǎn)基因小麥京花1號(hào)的總DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到預(yù)期的的結(jié)果（圖6），并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR得到相同結(jié)果的擴(kuò)增曲線。123456123456圖6bar基因PCR檢測(cè)結(jié)果1：DL2000；2：1%轉(zhuǎn)基因面包圖6bar基因PCR檢測(cè)結(jié)果1：DL2000；2：1%轉(zhuǎn)基因面包；3：1%轉(zhuǎn)基因油條；4：0.1%轉(zhuǎn)基因小麥粉；；5：京花1號(hào)小麥；6：水空白對(duì)照。擴(kuò)增目的片斷大小175bp。100bp250bp2.6小麥及其制品外源uidA基因的檢測(cè)針對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥中uidA基因的序列設(shè)計(jì)了371bp一對(duì)引物對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥B7、，B102、0.1%轉(zhuǎn)基因小麥粉、1%轉(zhuǎn)基因油條、1%轉(zhuǎn)基因面包和非轉(zhuǎn)基因小麥京花1號(hào)的總DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果是B72、B73、0.1%B73、1%轉(zhuǎn)基因面包和1%轉(zhuǎn)基因油條均得到預(yù)期的371bp的PCR擴(kuò)增片段（圖7）。123456789123456789250bp500250bp500bp圖7uidA基因PCR檢測(cè)結(jié)果1，9：DL2000；2：0.1%轉(zhuǎn)基因面粉；3：1%轉(zhuǎn)基因油條；4：1%轉(zhuǎn)基因面包；5：B73；6：B72；7：京花1號(hào)小麥；8：水空白對(duì)照。擴(kuò)增目的片斷大小371bp。2.7普通PCR定性方法檢測(cè)低限的確定2.7.1bar基因檢測(cè)低限對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥和非轉(zhuǎn)基因小麥進(jìn)行不同重量百分比配比，提取總DNA，對(duì)bar基因（擴(kuò)增目的片斷大小445bp）進(jìn)行了PCR擴(kuò)增及凝膠電泳分析（見(jiàn)圖8）。結(jié)果表明，最低可以檢測(cè)出0.1%的轉(zhuǎn)基因小麥成分，說(shuō)明該基因檢測(cè)低限為0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。1234567812345678圖8bar基因的最低檢測(cè)限1：1%B73，2：0.5%B73，3：0.1%B73，4:0.05%B73,5:0.05%B73圖8bar基因的最低檢測(cè)限1：1%B73，2：0.5%B73，3：0.1%B73，4:0.05%B73,5:0.05%B73,6:ck,7:100%B73，8:100bpDNAladdermarker。擴(kuò)增目的片斷大小445bp。100bp500bp2.7.2NOS基因檢測(cè)低對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥和非轉(zhuǎn)基因小麥進(jìn)行不同重量百分比配比，提取總DNA，對(duì)NOS基因（擴(kuò)增目的片斷大小180bp）進(jìn)行了PCR擴(kuò)增及凝膠電泳分析（見(jiàn)圖9）。結(jié)果表明，最低可以檢測(cè)出0.1%的轉(zhuǎn)基因小麥成分，說(shuō)明該基因檢測(cè)低限為0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。123456123456圖9圖9NOS基因的最低檢測(cè)限1：DL2000；2：1%B73，3：0.1%B73;4：0.05%B73，5：京花1號(hào)小麥6：水空白對(duì)照；擴(kuò)增目的片斷大小180bp。100100bp250bp2.7.3ubiquitin基因檢測(cè)低限對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥和非轉(zhuǎn)基因小麥進(jìn)行不同重量百分比配比，提取總DNA，對(duì)ubiquitin基因（擴(kuò)增目的片斷大小314bp）進(jìn)行了PCR擴(kuò)增及凝膠電泳分析（見(jiàn)圖10）。結(jié)果表明，最低可以檢測(cè)出0.1%的轉(zhuǎn)基因小麥成分，說(shuō)明該基因檢測(cè)低限為0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。1234512345圖圖10ubiquitin基因的最低檢測(cè)限1：DL2000；2：水空白對(duì)照;3：0.05%B73;4：1%B73;5：0.1%B73。擴(kuò)增目的片斷大小314bp。500bp500bp250bp2.7.4uidA基因檢測(cè)低對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥和非轉(zhuǎn)基因小麥進(jìn)行不同重量百分比配比，提取總DNA，對(duì)uidA基因（擴(kuò)增目的片斷大小371bp）進(jìn)行了PCR擴(kuò)增及凝膠電泳分析（見(jiàn)圖11）。結(jié)果表明，最低可以檢測(cè)出0.1%的轉(zhuǎn)基因小麥成分，說(shuō)明該基因檢測(cè)低限為0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。1234512345圖11圖11uidA基因的最低檢測(cè)限1：DL2000；2：水空白對(duì)照;3：0.05%B73;4：1%B73；5：0.1%B73；擴(kuò)增目的片斷大小371bp。500500bp25250bp2.7.5GAG56D內(nèi)源基因PCR對(duì)非轉(zhuǎn)基因小麥京花1號(hào)小麥和非轉(zhuǎn)基因大米進(jìn)行不同重量百分比配比，提取總DNA，對(duì)GAG56D基因（擴(kuò)增目的片斷大小328bp）進(jìn)行了PCR擴(kuò)增及凝膠電泳分析（見(jiàn)圖12）。結(jié)果表明，最低可以檢測(cè)出0.05%的轉(zhuǎn)基因小麥成分，說(shuō)明該基因檢測(cè)限低限為0.05%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。112345500bp250500bp250bp圖12GAG56D基因的最低檢測(cè)限1：水空白對(duì)照；2：1%京花1號(hào)小麥;3：0.1%京花1號(hào)小麥;4：0.05%京花1號(hào)小麥;5:DL2000。擴(kuò)增目的片斷大小328bp。2.7.6Wx012對(duì)非轉(zhuǎn)基因小麥京花1號(hào)小麥和非轉(zhuǎn)基因大米進(jìn)行不同重量百分比配比，提取總DNA，對(duì)Wx012基因（擴(kuò)增目的片斷大小102bp）進(jìn)行了PCR擴(kuò)增及凝膠電泳分析（見(jiàn)圖13）。結(jié)果表明，最低可以檢測(cè)出0.1%的轉(zhuǎn)基因小麥成分，說(shuō)明該基因檢測(cè)限低限為0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。11234100bp圖1100bp圖13Wx012基因的最低檢測(cè)限1：1%京花1號(hào)小麥;2：0.1%京花1號(hào)小麥3：水空白對(duì)照；4:DL2000。擴(kuò)增目的片斷大小102bp。250bp3轉(zhuǎn)基因小麥實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢測(cè)方法的建立3．1實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)將引物濃度從0.1umol/L至0.8umol/L以0.1umol/L梯度遞增，探針濃度從0.01umol/L至0.08umol/L以0.1umol/L梯度遞增，對(duì)引物和探針不同濃度的配比進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)；將鎂離子濃度從1.0mmol/L至2.5mmol/L以0.5umol/L梯度遞增；并對(duì)Taq酶和dNTP的量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。最后對(duì)所有反應(yīng)體系優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析比較后，最終確定實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系。3．2小麥屬內(nèi)源基因（GAG56D）實(shí)時(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并合成了GAG56D基因的探針和引物，對(duì)小麥屬中的栽培小麥（染色體組成AABBDD）（轉(zhuǎn)基因小麥B73，非轉(zhuǎn)基因小麥京花1號(hào)）；小麥進(jìn)化中的一粒麥（AA）、二粒麥（AABB）、硬粒麥（AABB）、粗山羊草（DD）、斯卑爾脫小麥（AABBDD）；同時(shí)對(duì)小麥屬以外的大麥，燕麥，蕎麥，大豆，玉米，水稻(白米，黑米)，谷子（小米），油菜，亞麻籽等樣品，用實(shí)時(shí)熒光PCR進(jìn)行了定性檢測(cè)（見(jiàn)圖14）。結(jié)果表明，所有小麥屬的品種（圖14中2-9）中都出現(xiàn)了擴(kuò)增曲線，而空白對(duì)照（圖14中1）和其它作物（圖14中10-18）中沒(méi)有擴(kuò)增曲線。說(shuō)明在國(guó)內(nèi)外，我們首次篩選出了γ-麥谷醇溶蛋白內(nèi)源參照基因作為小麥屬特有的內(nèi)參照基因，特異性很好。同時(shí)也證明了轉(zhuǎn)基因小麥的DNA提取成功，防止了假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。圖圖14GAG56D基因的擴(kuò)增曲線3.3小麥及其制品內(nèi)源參照基因蠟質(zhì)Wx012基因?qū)崟r(shí)熒光PCR特異性檢測(cè)針對(duì)小麥中蠟質(zhì)內(nèi)源參照基因Wx012，對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥（B73，B72，B102，1%B73油條，1%B73面包，市售餅干，嬰兒麥粉，方便面，米粉，豆粉），用實(shí)時(shí)熒光PCR進(jìn)行了定性檢測(cè)。結(jié)果表明，所有含有小麥成分的小麥及其制品中都出現(xiàn)了擴(kuò)增曲線，而空白對(duì)照和米粉，豆粉中沒(méi)有擴(kuò)增曲線（見(jiàn)圖15）。結(jié)果表明了蠟質(zhì)內(nèi)源參照基因Wx012是小麥特有的內(nèi)參照基因。既證明了小麥的DNA提取成功，又防止了假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。圖15圖15Wx012基因的擴(kuò)增曲線基線上方為B73，B72，B102，1%B73油條，1%B73面包，市售餅干，嬰兒麥粉，方便面基線下方空白對(duì)照，米粉，豆粉3.4小麥及其制品外源NOS基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)用熒光PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥（B73，B72，B102，1%B73油條，1%B73面包，市售餅干，嬰兒麥粉，方便面）的外源NOS基因進(jìn)行定性檢測(cè)（見(jiàn)圖16），結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因小麥（B73，B72，B102，1%B73油條，1%B73面包）出現(xiàn)了外源NOS基因的擴(kuò)增曲線，而空白對(duì)照和市售餅干，嬰兒麥粉，方便面，沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。圖16圖16NOS基因的擴(kuò)增曲線基線上方為B73，B72和B102，1%B73油條，1%B73面包基線下方為市售餅干，嬰兒麥粉，方便面，空白對(duì)照3.5小麥及其制品外源ubiquitin基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)用熒光PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥（B73，B72，B102，1%B73油條，1%B73面包，市售餅干，嬰兒麥粉，方便面）外源Ubiquitin基因進(jìn)行定性檢測(cè)（見(jiàn)圖17），結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因小麥（B73，B72，B102，1%B73油條，1%B73面包）出現(xiàn)了外源Ubiquitin基因擴(kuò)增曲線，而空白對(duì)照和市售餅干，嬰兒麥粉，方便面沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。圖17圖17ubiquitin基因的擴(kuò)增曲線基線上方為B73，B72和B102，1%B73油條，1%B73面包基線下方為市售餅干，嬰兒麥粉，方便面，空白對(duì)照。3.6小麥及其制品外源bar基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)用熒光PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥（B73，B72，B102，1%B73油條，1%B73面包，市售餅干，嬰兒麥粉，方便面）品系外源bar基因進(jìn)行定性檢測(cè)（見(jiàn)圖18），結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因小麥（B73，B72，B102，1%B73油條，1%B73面包）出現(xiàn)了外源bar基因的擴(kuò)增曲線，而空白對(duì)照和和市售餅干，嬰兒麥粉，方便面沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。圖18圖18bar基因的擴(kuò)增曲線基線上方從左到右依次為B73，B72和B102，1%B73油條，1%B73面包基線下方為市售餅干，嬰兒麥粉，方便面，空白對(duì)照。3.7實(shí)時(shí)熒光PCR定性方法檢測(cè)低限的確定3.7.1bar基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)低限對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥和非轉(zhuǎn)基因小麥進(jìn)行不同重量百分比配比，提取總DNA，對(duì)bar基因進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增（見(jiàn)圖19）。結(jié)果表明，可以檢測(cè)出0.1%的轉(zhuǎn)基因小麥成分，說(shuō)明該基因的檢測(cè)低限為0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。圖19圖19bar基因質(zhì)量百分比實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)限擴(kuò)增曲線基線上方從左到右依次為0.5%B73,0.1%B73基線下方為0.05%B73，水空白對(duì)照3.7.2NOS基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)低對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥和非轉(zhuǎn)基因小麥進(jìn)行不同重量百分比配比，提取總DNA，對(duì)NOS基因進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增（見(jiàn)圖20）。結(jié)果表明，可以檢測(cè)出0.1%的轉(zhuǎn)基因小麥成分，說(shuō)明該基因的檢測(cè)低限為0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。圖20圖20NOS基因質(zhì)量百分比實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)限擴(kuò)增曲線基線上方從左到右依次為1%b73，0.5%B73，0.1%B73基線下方為水空白對(duì)照和0.05%B73。3.7.3Ubiquitin基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)低對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥和非轉(zhuǎn)基因小麥進(jìn)行不同重量百分比配比，提取總DNA，對(duì)Ubiquitin基因進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增（見(jiàn)圖21）。結(jié)果表明，可以檢測(cè)出0.1%的轉(zhuǎn)基因小麥成分，說(shuō)明該基因的檢測(cè)低限為0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。圖21圖21Ubiquitin基因質(zhì)量百分比實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)限擴(kuò)增曲線基線上方從左到右依次為0.5%B73，0.1%B73基線下方為水空白對(duì)照和0.05%B73。3.7.4GAG56D內(nèi)源基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)低限的確定對(duì)非轉(zhuǎn)基因小麥京花1號(hào)和非轉(zhuǎn)基因大米進(jìn)行不同重量百分比配比，提取總DNA，對(duì)GAG56D基因進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增（見(jiàn)圖22）。結(jié)果表明，可以檢測(cè)出0.05%的轉(zhuǎn)基因小麥成分，說(shuō)明該基因的檢測(cè)低限為0.05%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。圖22圖22GAG56D基因質(zhì)量百分比實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)限擴(kuò)增曲線基線上方從左到右依次為0.5%B73，0.1%B73，0.05%B73基線下方為水空白對(duì)照3.7.5Wx012內(nèi)源基因?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)低對(duì)非轉(zhuǎn)基因小麥京花1號(hào)和非轉(zhuǎn)基因大米進(jìn)行不同重量百分比配比，提取總DNA，對(duì)Wx012基因進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增（見(jiàn)圖23）。結(jié)果表明，可以檢測(cè)出0.1%的轉(zhuǎn)基因小麥成分，說(shuō)明該基因的檢測(cè)低限為0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。圖23圖23Wx012基因質(zhì)量百分比實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)限擴(kuò)