【超聲波輔助熱水浸提法進(jìn)行綠茶茶多糖的提取實(shí)驗(yàn)探究9100字（論文）】

茶茶葉最早發(fā)源于中國(guó)，到現(xiàn)在已經(jīng)有著六千多年的歷史。但是把茶作為飲料來飲用是在西漢后期到三國(guó)時(shí)代，茶才成為宮廷的高級(jí)飲料，而作為普通飲料是在西晉到隋朝時(shí)期[1]。在此之前，茶葉都是當(dāng)做祭品或菜來使用。到現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展為世界三大飲料之一。根據(jù)茶的品種以及發(fā)酵程度的不同，茶分為六大茶系，包含綠茶、白茶、黃茶、烏龍茶、紅茶、黑茶；用毛茶或精制茶再次加工而成的茶稱為再加工茶，包括花茶、果味茶、藥用保健茶、含茶飲料等[2]。茶葉有著很好的醫(yī)療效用，在唐代就有“茶藥”一詞，而宋代林洪撰寫的《山家清供》中，也有“茶，即藥也”的描述[3]。經(jīng)過現(xiàn)代科學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，茶有著抗癌、抗菌、預(yù)防蛀牙與食物中毒、降低血糖與高血壓的療效。隴南綠茶原料采用單芽或一芽一、二葉，產(chǎn)品具有芽葉重實(shí)、內(nèi)含豐富、高香耐泡等獨(dú)特品質(zhì)[4]。外形以扁形和卷曲形為主；扁形茶芽葉扁平，挺直光滑，呈翠綠色或黃綠色，湯色綠亮或黃綠明亮，栗香或嫩香、清香，滋味鮮爽濃醇，葉底黃綠成朵。茶葉外形緊結(jié)卷曲，色澤綠潤(rùn)，湯色嫩綠明亮，香氣高長(zhǎng)，栗香或清香，個(gè)別有天然花香，滋味爽醇，葉底黃綠柔軟[4]。隴南茶園以小葉群體種為主，由于產(chǎn)茶區(qū)緯度高、海拔高、環(huán)境清潔度高，決定了隴南茶園休養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、采摘輪次少，所產(chǎn)綠茶芽頭重實(shí)、茶多酚含量高、香高耐泡[4]。

2茶多糖及提取方法2.1茶多糖茶多糖是茶葉中具有生理活性的天然大分子物質(zhì)，茶多糖是一種酸性糖蛋白，并結(jié)合有大量的礦質(zhì)元素，稱為茶葉多糖復(fù)合物，簡(jiǎn)稱為茶葉多糖或茶多糖（TeaPolysaccharide）[5]。其中蛋白部分主要由約20種常見的氨基酸組成，糖的部分主要由阿拉伯糖、木糖、巖藻糖、葡萄糖、半乳糖等，礦質(zhì)元素主要由鈣、鎂、鐵、錳等及少量的微量元素組成[6]。茶多糖作為天然活性物質(zhì),一直是研究的重點(diǎn)。通過對(duì)茶多糖進(jìn)行的大量實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，茶多糖對(duì)于人體來說，有著多種作用，比如：降低血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗凝血、抑菌、抗氧化等。此外茶葉多糖還對(duì)心血管健康有一定作用。2.2茶多糖的提取方法2.2.1酶法提取在茶葉多糖的提取過程中由于酶的加入破壞了組織的細(xì)胞壁，能夠有效的使細(xì)胞中的多糖類物質(zhì)流出，以此來提高效率。當(dāng)前，對(duì)于茶葉多糖的提取主要的是胰蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、水解酶以及復(fù)合酶[7-12]。酶法提取的方式目前主要有如下4種，如圖2.1所示：圖2.1茶多糖酶法提取工藝酶作為具有催化作用的生物高分子物質(zhì)，容易被多種因素影響，如溫度、濃度以及pH值等。但是相較于其他的提取方法酶法提取反應(yīng)條件溫和，選擇性較強(qiáng)，有著較高的浸出率。研究發(fā)現(xiàn)，酶法提取茶多糖的溫度約為40℃~55℃，pH為4.0~5.5,添加量為0.5%左右時(shí)最優(yōu)，而胰酶的反應(yīng)環(huán)境pH約為8.0左右，相對(duì)較高[7-12]。但是，由于酶種類和添加方式不同，就會(huì)導(dǎo)致茶多糖最終的提取率以及生理活性和組成等都不相同。對(duì)于不同酶的提取研究表明，茶多糖提取最多的是果膠酶，且糖醛酸含量最低[7]。2.2.2超聲波提取法超聲波能夠產(chǎn)生空化效應(yīng)、擾動(dòng)效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、擊碎、攪拌、乳化、分散等多種效應(yīng)，不單可以增大物質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)頻率和速度，還可以增大溶劑的穿透力，以此來加速茶多糖進(jìn)入溶劑的過程，提高提取率。超聲波提取有著效率高、操作方便、耗時(shí)短、溫度低等優(yōu)點(diǎn)，但是一定程度上會(huì)降低茶多糖的分子量變小，生物活性有所改變[13-16]。2.2.3微波提取法微波提取又稱為微波萃取，微波在加熱的過程中，微波會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的水分吸收，從而產(chǎn)生熱量。致使細(xì)胞因被加熱膨脹而破裂，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)流出。同時(shí)，還可以加速溶媒分子的滲透速度并促進(jìn)提取目的成分的溶解，從而可以極大縮短提取所需時(shí)間，提高提取的效率。受益于微波提取溫度均勻且相對(duì)較低，避免了高溫引起的有效成分的分解，而大量應(yīng)用于天然成分的提取[17]。但是和超聲波提取相似的是，微波提取中茶多糖的生物活性也會(huì)有所改變[18-19]。2.2.4乙醇浸提法高濃度的乙醇不僅可以使得茶葉中的茶多糖析出沉淀，還可以使茶多酚、鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)析出沉淀。且在不同濃度乙醇時(shí)可以對(duì)不同物質(zhì)進(jìn)行分級(jí)沉淀[20-22]。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)浸提效果最好、提取率最高時(shí)的乙醇濃度為70%，并且蛋白含量少[22]。所以，對(duì)于茶多糖的提取可以先用高濃度乙醇進(jìn)行提取茶葉中的各種大分子物質(zhì)，然后再通過熱水浸提富集茶多糖。2.2.5超臨界流體萃取作為一種新型萃取分離技術(shù)，是在上世紀(jì)六十年代左右發(fā)展起來的。流體溶劑常采用二氧化碳。采用響應(yīng)面法萃取茶籽多糖最優(yōu)參數(shù)為：時(shí)間150min、壓力45MPa、溫度60℃、夾帶劑濃度為65%[23]，在該條件下茶多糖的收率為13.23%。該方法具有低能耗、高效率、條件溫和以及污染小等優(yōu)勢(shì)，但是也有著設(shè)備昂貴和提取時(shí)間長(zhǎng)等缺陷，當(dāng)前只是用于貴重植物的有效成分的提取和制備。2.2.6反膠束萃取反膠束技術(shù)，有著操作方法簡(jiǎn)單、選擇性高、可以進(jìn)行大規(guī)模萃取的優(yōu)點(diǎn)。反膠束即極性基團(tuán)位于膠束的內(nèi)部，而非極性基團(tuán)位于膠束的外部的膠束。反膠束萃取就是利用表面活性劑在溶液中形成反膠束，從而使得蛋白以及親水性的其他物質(zhì)能夠溶解于反膠束的內(nèi)部，并且由于周圍基團(tuán)的保護(hù)可以使得內(nèi)部溶解的蛋白不會(huì)失活。具有很好的應(yīng)用前景。且已有相關(guān)學(xué)者進(jìn)行了研究，茶多糖的萃取率均較為良好[24]。這為反膠束萃取技術(shù)的大規(guī)模應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的根底。2.2.7協(xié)同浸提酶法提取、超臨界流體萃取、反膠束萃取、超聲波提取法、微波提取法等新技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，相互之間配合提取就可以充分利用超聲波的空化效應(yīng)、酶的選擇性以及微波的內(nèi)加熱特性，就能夠充分提高茶葉多糖的提取效率。而且具備條件溫和、環(huán)保、提取率高的優(yōu)勢(shì)，具有良好的應(yīng)用前景。2.3茶多糖的精制經(jīng)過以上提取方法提取得到的茶葉粗多糖，還會(huì)存在有一些小分子化合物、單糖、寡糖、無機(jī)鹽、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，必需對(duì)粗多糖進(jìn)行提純,除去非多糖類雜質(zhì)之后，才能再進(jìn)行多糖的純化。2.3.1有機(jī)溶劑除雜質(zhì)常用有機(jī)溶劑沉淀法來對(duì)粗多糖進(jìn)行精制，作為最常用的方法它采用的是多糖在有機(jī)溶劑中難以溶解的特性，多次使用乙醇或丙酮溶液進(jìn)行沉淀、洗滌，就可以除去雜質(zhì)。采用乙醇進(jìn)行沉淀，濃度大多為采用80%，靜止醇析后，絕大部分的多糖都能夠被沉淀析出，大多需要多次進(jìn)行有機(jī)溶劑沉淀后，才能夠去除大部分雜質(zhì)。也可以在進(jìn)行熱水提取之前，先采用石油醚、乙醚等溶劑進(jìn)行回流浸提，再將藥渣干燥后用水或者含水乙醇對(duì)多糖進(jìn)行提取。但后一種方法相對(duì)前者來說，耗費(fèi)更多的溶劑和時(shí)間，所以多采用第一種方法，先對(duì)樣品提取之后，再用有機(jī)溶劑對(duì)多糖溶液進(jìn)行沉淀，對(duì)多糖進(jìn)行精制[17]。2.3.2透析法除雜質(zhì)透析法主要是去除粗多糖中的小分子量以及無機(jī)鹽等水溶性物質(zhì)，而多糖等大分子物質(zhì)由于分子量或溶解性等因素?zé)o法通過透析袋，所以不會(huì)被去除。透析袋的選擇通常是根據(jù)分離目的產(chǎn)物的分子量大小決定的。對(duì)于多糖來說，通常選用3000~10000Da的透析袋。在使用前，先將透析袋高溫處理2～3小時(shí)，除去其中可能含有的雜質(zhì)，再將多糖溶液放置于透析袋內(nèi)，采用水溶液進(jìn)行透析。若操作時(shí)間長(zhǎng)，且溫度適宜，則應(yīng)當(dāng)注意防腐，以免霉菌生長(zhǎng)影響實(shí)驗(yàn)。對(duì)于處理多糖中的小分子量物質(zhì)以及無機(jī)鹽等水溶性物質(zhì)來說，這是一種較好的方法。2.3.3除蛋白由于蛋白質(zhì)與多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)相似，同樣都是強(qiáng)極性生物大分子物質(zhì)，所以，粗多糖中含有蛋白質(zhì)是無法避免的，因此，在多糖的提純過程中，蛋白質(zhì)必須要去除。主要的方法有：Sevage法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法、酶法等。Sevage法是利用有機(jī)溶劑可以使蛋白質(zhì)變性的特點(diǎn)。有機(jī)溶劑一般采用氯仿和丁醇。在多糖水溶液中按順序加入氯仿、丁醇，其體積比為25:5:1?；旌虾髣×覔u勻，然后離心，而變性蛋白就處于上下兩層交界處。該方法條件簡(jiǎn)單，多糖性質(zhì)穩(wěn)定。但是單次去除率不高，需要多處理幾次，就導(dǎo)致該方法復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、樣品提取率也不高，主要由于損耗高導(dǎo)致。在三氟三氯乙烷法的操作中，V(三氟三氯乙烷):V(多糖溶液)=1:1，混合后攪拌均勻,靜置沉淀，然后進(jìn)行離心操作。蛋白質(zhì)就會(huì)處于溶劑層，而多糖處于水層。由于三氟三氯乙烷有著易揮發(fā)的缺點(diǎn)，所以不適合于大規(guī)模使用，但是該方法有著效率高的優(yōu)點(diǎn)。三氯乙酸法是利用了蛋白質(zhì)能夠被三氯乙酸沉淀析出的原理。在實(shí)際操作中，采用的是5%～30%的三氯乙酸。往多糖溶液中加入等量的三氯乙酸溶液，在低溫下混合，攪拌均勻，靜置沉淀，然后進(jìn)行離心處理，以除去蛋白質(zhì)的膠狀沉淀。但是該方法反應(yīng)較為劇烈，對(duì)于部分多糖有著分解的作用，所以，不適合使用。但是該方法工藝簡(jiǎn)單、效率高。酶法除蛋白是運(yùn)用了酶對(duì)于蛋白質(zhì)能夠降解的性質(zhì)，就可以除去粗多糖中的絕大部分的蛋白質(zhì)。在操作中常用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等。在操作中，先往粗多糖溶液中加入相適宜的酶，然后調(diào)節(jié)溶液的溫度以及Ph值的方式，使其處于酶解的最佳條件下，以此來去除大部分的蛋白質(zhì)。但是，使用該方法應(yīng)當(dāng)注意的是原溶液中蛋白質(zhì)的初始含量，若初始含量高，則使用該方法較為合適，但如果初始含量較低，則相當(dāng)于加入了新的雜質(zhì)蛋白質(zhì)。所以，該方法不能夠徹底的去除蛋白質(zhì)。綜上所述，Sevage法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法、酶法等各種方法各有利弊。所以在實(shí)際使用時(shí)，可以使用多種方式協(xié)同使用，就可以高效的把粗多糖中的蛋白質(zhì)除去。2.3.4脫色由于色素在粗多糖提純過程中有著很大的影響，所以色素的去除是很有必要的。對(duì)于粗多糖中色素的去除方法也有很多，比如：氧化法、吸附法、離子交換法。采用氧化法時(shí)常用氧化劑為H2O2，使用H2O2時(shí)，pH需要保持在弱堿性，若堿性過高則對(duì)于多糖的結(jié)構(gòu)會(huì)有破壞，且溶液溫度要保持在低溫狀態(tài)，否則高溫會(huì)引起多糖的分解。吸附法也是一種常用的除色素方法，吸附劑常用活性炭、硅藻土、吸附樹脂等具有吸附作用的材料，使其吸附雜質(zhì)色素從而達(dá)到對(duì)產(chǎn)品提純的要求。一般廣泛使用最多的吸附劑是活性炭和吸附樹脂，在使用中應(yīng)當(dāng)對(duì)溫度、時(shí)間、用量等影響因素進(jìn)行嚴(yán)格把控。離子交換法不僅可以除去色素，還可以利用不同離子的強(qiáng)度不同這一特性對(duì)其進(jìn)行分離，這使得離子交換法成為了一種最為常用的方法。王松柏等通過研究不同樹脂對(duì)防風(fēng)粗多糖的脫色效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明陰離子大孔交換樹脂D280和D390的效果最佳，其脫色率分別達(dá)到了84.3%和76.4%[25]。除去以上幾種方法外，對(duì)粗多糖進(jìn)行脫色處理還有金屬配合法、金屬絡(luò)合物法、聚酰胺柱色譜等方法，在具體應(yīng)用時(shí)應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況需求來選擇最適宜的脫色方法。2.4茶多糖的純化2.4.1膜分離技術(shù)膜分離是1960年發(fā)展起來的，作為一種分離的新技術(shù)，它可以對(duì)不同產(chǎn)品中不同組分的氣相或液相進(jìn)行分離或者富集，而它的推動(dòng)力來源則是外界的能量或者溶液本身的化學(xué)位差。有著效率高、能耗低、方法簡(jiǎn)單、污染低且不會(huì)使目標(biāo)產(chǎn)物發(fā)生相變等優(yōu)勢(shì)。在環(huán)境保護(hù)以及水處理等相關(guān)領(lǐng)域得到了普遍的使用，已經(jīng)成為了現(xiàn)今分離學(xué)科中最為重要的辦法之一。采用膜分離技術(shù)進(jìn)行分離或者富集，沒有有機(jī)溶劑的污染、能耗低、方法簡(jiǎn)單，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。2.4.2吸附樹脂技術(shù)吸附樹脂法是以大孔吸附樹脂等不同樹脂或聚合物作為載體，對(duì)產(chǎn)品中的不同組分分別吸附，并且進(jìn)行一定的篩選。以此來對(duì)植物中的天然成分進(jìn)行分離以及提純。有著低能耗、可再生、無污染等優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)如今已普遍應(yīng)用于環(huán)保、合成化學(xué)、生物醫(yī)藥等相關(guān)領(lǐng)域。與傳統(tǒng)方式的脫色脫蛋白辦法相比，吸附樹脂技術(shù)對(duì)于去除粗茶多糖中的色素和蛋白質(zhì)有著很大的優(yōu)勢(shì)，并且吸附樹脂法的工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)周期短，還能夠保留多糖的生理活性，合乎綠色化學(xué)的要求。2.4.3柱色譜法柱色譜法，又稱為柱層析法，不同組分上柱吸附后經(jīng)等度或梯度洗脫后，就可以得到純度較高的不同組分，柱填料與洗脫劑的選擇對(duì)于組分的分離有著很大的影響。對(duì)于茶多糖分離的柱填料國(guó)內(nèi)外主要是分配層析的纖維素和凝膠柱層析的Sephadex及Sepharose，然而受限于高額的成本和較低的提取率，該方法目前僅用在實(shí)驗(yàn)室來制備不同純度的茶多糖，用以對(duì)其結(jié)構(gòu)和生理活性的研究[26]。

3實(shí)驗(yàn)材料、方法及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3.1材料研究材料：市售隴南綠茶實(shí)驗(yàn)主要試劑：無水乙醇；5%苯酚溶液；濃硫酸。實(shí)驗(yàn)主要儀器：FA1004型電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；UCM-10型超聲波清洗機(jī)（上海皓莊儀器有限公司）；2L-ARE型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海皓莊儀器有限公司）；TDL80-2B臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠制造）；723N可見分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）。GZX-GF101-3-S電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1方法采用超聲波輔助熱水浸提法進(jìn)行茶多糖的提取，使用無水乙醇對(duì)茶多糖進(jìn)行析出沉淀。對(duì)提取率的測(cè)定采用苯酚-硫酸法進(jìn)行測(cè)定。3.2.2提取工藝流程茶葉→粉碎→超聲波輔助50℃溫水恒溫浸提→減壓濃縮→加入無水乙醇沉淀→離心分離得沉淀物→無水乙醇洗滌2次→取沉淀烘干→粗茶多糖提取物3.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3.3.1單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)取離心時(shí)間、超聲時(shí)間、沉淀劑用量三因素作為單因素設(shè)計(jì)變量，以茶多糖得率為指標(biāo)討論各因素對(duì)茶多糖提取率的影響。單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：離心時(shí)間對(duì)茶多糖提取率的影響：在其他條件相同的情況下，超聲時(shí)間設(shè)置為35min、沉淀劑用量設(shè)置為1:2，離心時(shí)間分別設(shè)置為3min、6min、10min，討論離心時(shí)間對(duì)茶多糖提取率的影響。設(shè)計(jì)結(jié)果匯總于表3.1。表3.1離心時(shí)間對(duì)茶多糖提取率的影響編號(hào)離心時(shí)間(A)/min超聲時(shí)間(B)/min沉淀劑用量(C)13351:226351:2310351:2超聲時(shí)間對(duì)茶多糖提取率的影響：其他條件相同，離心時(shí)間設(shè)置為6min、沉淀劑用量設(shè)置為1:2，超聲時(shí)間分別設(shè)置為35min，45min，55min，討論超聲時(shí)間對(duì)茶多糖提取率的影響。設(shè)計(jì)結(jié)果匯總于表3.2。表3.2超聲時(shí)間對(duì)茶多糖提取率的影響編號(hào)離心時(shí)間(A)/min超聲時(shí)間(B)/min沉淀劑用量(C)16351:226451:236551:2沉淀劑用量對(duì)茶多糖提取率的影響：其他條件相同，離心時(shí)間設(shè)置為6min、超聲時(shí)間設(shè)置為35min，沉淀劑用量分別設(shè)置為1:1、1:2、1:3，討論沉淀劑用量時(shí)間對(duì)茶多糖提取率的影響。設(shè)計(jì)結(jié)果匯總于表3.3。表3.3沉淀劑用量對(duì)茶多糖提取率的影響編號(hào)離心時(shí)間(A)/min超聲時(shí)間(B)/min沉淀劑用量(C)16351:126351:236351:33.3.2正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，采用SPSS20.0軟件進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)條件見表3.2，設(shè)計(jì)結(jié)果見表3.3，以茶多糖的得率作為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，來確定茶多糖提取的最佳工藝條件。表3.4茶多糖提取正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)條件水平離心時(shí)間(A)/min超聲時(shí)間(B)/min沉淀劑用量(C)13351:126451:2310551:3表3.5茶多糖提取正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果編號(hào)實(shí)驗(yàn)因素離心時(shí)間(A)/min超聲時(shí)間(B)/min沉淀劑用量(C)1111212231334213522162327312832393314.茶多糖的制備4.1茶葉處理將茶葉放置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，定溫90℃，烘干后，粉碎待用。4.2茶多糖的制備單因素實(shí)驗(yàn)茶多糖的制備：取10g茶葉粉末，加入100ml蒸餾水，在超聲波中恒溫50℃進(jìn)行冷凝回流浸提，時(shí)間分別為35min、45min、55min。超聲功率固定為300W。使用濾布將茶葉與濾液分離，取濾液在80℃下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸餾至剩余10ml。取濃縮液并加入無水乙醇，進(jìn)行沉淀，無水乙醇分別為10ml、20ml、30ml。放置沉淀1-2小時(shí)后，進(jìn)行離心分離操作，離心轉(zhuǎn)速設(shè)置為固定轉(zhuǎn)速3000r/min，離心時(shí)間分別為3min、6min、10min。然后除去上層清液，將沉淀用無水乙醇進(jìn)行多次清洗，取沉淀物在36℃烘箱中烘干即為粗茶多糖提取物。正交實(shí)驗(yàn)茶多糖的制備：在各正交實(shí)驗(yàn)條件下，取10g茶葉粉末，加入100ml蒸餾水，在超聲波中恒溫50℃進(jìn)行冷凝回流浸提。超聲功率固定為300W。使用濾布將茶葉與濾液分離，取濾液在80℃下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸餾至剩余10ml。取濃縮液并加入無水乙醇，進(jìn)行沉淀。放置沉淀1-2小時(shí)后，進(jìn)行離心分離操作，離心轉(zhuǎn)速設(shè)置為固定轉(zhuǎn)速3000r/min。然后除去上層清液，將沉淀用無水乙醇進(jìn)行多次清洗，取沉淀物在36℃烘箱中烘干即為粗茶多糖提取物。4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.8ml分別于20ml試管中，各自加入蒸餾水至2.0ml，順序加入5％苯酚溶液1.0ml、濃硫酸5.0ml，靜置10min后搖勻，室溫放置20min后在490nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度(A值)[27]。以葡萄糖濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度(A值)為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=4.7550x-0.0295（R2=0.9904）[28]。4.4茶多糖得率計(jì)算稱取粗茶多糖提取物1g，使用蒸餾水溶解并且定容至50ml，吸取1ml后加蒸餾水至2.0ml，依次加入5％苯酚溶液1.0ml、濃硫酸5.0ml，靜置10min后搖勻，室溫放置20min后在490nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度(A值)[27]，根據(jù)回歸方程求得茶多糖濃度。再以茶多糖濃度計(jì)算茶多糖得率，茶多糖得率計(jì)算公式如下[29]：(3.1)式中C為茶多糖提取物溶液中葡萄糖濃度(mg/ml)；V為茶多糖提取物溶液體積(ml)；W為茶葉的質(zhì)量(g)；f為換算因子[30]。5實(shí)驗(yàn)結(jié)果5.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果5.1.1離心時(shí)間對(duì)茶多糖提取率的影響圖5.1離心時(shí)間對(duì)茶多糖提取率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖5.1可知，在離心時(shí)間為6min時(shí)，茶多糖的沉淀最多，且沉淀量與離心時(shí)間成反比關(guān)系，時(shí)間越長(zhǎng)，沉淀量減少。所以，離心時(shí)間選取6min較為理想。5.1.2超聲時(shí)間對(duì)茶多糖提取率的影響圖5.2超聲時(shí)間對(duì)茶多糖提取率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖5.2可知，在超聲時(shí)間為55min時(shí)，茶多糖的沉淀最多，且沉淀量與超聲時(shí)間在該段時(shí)間里成正比關(guān)系，隨著時(shí)間的增加，沉淀量增加。所以，超聲時(shí)間在55min左右時(shí)較為良好。5.1.3沉淀劑用量對(duì)茶多糖提取率的影響圖5.3沉淀劑用量對(duì)茶多糖提取率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖5.3可知，在沉淀劑用量為1:3時(shí)，茶多糖的沉淀最多，且沉淀量與沉淀劑用量成正比關(guān)系，隨著沉淀劑用量的加大，沉淀的量也在加大。所以，沉淀劑用量選取1:3效果較好。5.2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表5.1L9(33)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果編號(hào)實(shí)驗(yàn)因素得率%離心時(shí)間(A)/min超聲時(shí)間(B)/min沉淀劑用量(C)11113.01421223.18631333.88942133.73052213.39462323.45673123.120續(xù)表5.1編號(hào)實(shí)驗(yàn)因素得率%離心時(shí)間(A)/min超聲時(shí)間(B)/min沉淀劑用量(C)83234.52993313.469K13.3633.2883.292K23.5263.7033.254K33.7063.6054.049R0.3430.4150.795由表可知，茶多糖提取率的影響因素比重順序?yàn)镃>B>A，即茶多糖提取率影響因素比重順序?yàn)槌恋韯┯昧?gt;超聲時(shí)間>離心時(shí)間。醇析水提法提取茶多糖的較優(yōu)提取工藝為A3B2C3，即離心時(shí)間為10min，超聲時(shí)間為45min，沉淀劑用量為1:3，在此實(shí)驗(yàn)條件下，茶多糖的提取率最高，為4.529%。

6結(jié)論與分析6.1實(shí)驗(yàn)結(jié)論以隴南綠茶為研究原料，采用醇析水提法以超聲波輔助進(jìn)行茶多糖的提取，以苯酚-硫酸法來測(cè)定提取液中茶多糖的含量。通過單因素實(shí)驗(yàn)研究了不同影響因素對(duì)茶多糖提取率的影響，在離心時(shí)間為6min時(shí)，茶多糖的沉淀量最多；在超聲時(shí)間為55min時(shí)，茶多糖的沉淀量最大；在沉淀劑用量為1:3時(shí)，茶多糖的沉淀量最高。再以正交實(shí)驗(yàn)得到茶多糖的最佳提取工藝為A3B2C3，即離心時(shí)間為10min，超聲時(shí)間為45min，沉淀劑用量為1:3，在此實(shí)驗(yàn)條件下，茶多糖的提取率最高，為4.529%。6.2數(shù)據(jù)分析實(shí)驗(yàn)中茶多糖的得率在3.014%-4.529%范圍內(nèi)，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[31]結(jié)論相似。但可能由于實(shí)驗(yàn)中操作水平以及實(shí)驗(yàn)條件的限制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能偏小。主要誤差操作存在于提取液的濃縮過程以及加入沉淀劑后沉淀時(shí)間的長(zhǎng)短不同造成。參考文獻(xiàn)[1]安徽農(nóng)學(xué)院主編.制茶學(xué).北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2010.9[2]郭亞東.西餐烹飪.北京：中國(guó)食品出版社，1988.3[3]鞏發(fā)永,齊桂年,李靜,花旭斌,史碧波.超聲波輔助提取邊茶中茶多糖工藝條件研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2006(05):139-140.[4]廖獻(xiàn)就,覃鳳英,蒙嫻,周海明,徐麗琳,黃鎖義.凌云白毫茶多糖的提取和含量測(cè)定[J].廣東化工,2016,43(24):33-34.[5]馮歡歡.機(jī)械化學(xué)法輔助提取茶末有效成分的工藝研究[D].長(zhǎng)江大學(xué),2015.[6]劉素強(qiáng),鐘應(yīng)富,吳全,等.茶多糖的研究及其利用[J].南方農(nóng)業(yè),2009(5):111-113.[7]周小玲,汪東風(fēng),李素臻,周恂,侯仰鋒,王遠(yuǎn)紅.不同酶法提取工藝對(duì)茶多糖組成的影響[J].茶葉科學(xué),2007(01):27-32.[8]張?jiān)?林強(qiáng),崔玉梅，等.烏龍茶多糖的酶法提取及降血糖活性初步研究[J]?中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2008，25(4)：286-288.[9]BaikJI，ShinKS，ParkY，elat.Biotransformationofcatechinandextractionofactivepolysaccharidefromgreentealeavesviasimultaneoustreatmentwithtannaseandpectinase[J].JournaloftheScienceofFoodandAgriculture,2015,95(11)：2337-2344.[10]王元鳳,金征宇.酶法提取茶多糖工藝的研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2005(03):122-124.[11]郭艷紅,魏新林,王元鳳,張嘉辰.酶法提取茶多糖工藝條件的研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊),2009(04):4-7.[12]何傳波,吳蘭蘭,湯鳳霞,熊何健.鐵觀音茶多糖的酶法提取及脫蛋白工藝研究[J].云南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2009,18(01):41-44.[13]黃永春,馬月飛,謝清若,等.超聲波輔助提取茶多糖及其分子量變化的研究[J].食品科學(xué),2007(7):170-173.[14]張忠,李靜,李正濤,鞏發(fā)永.超聲波輔助提取茶籽多糖工藝條件的研究[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2007(10):49-50+99.[15]李星科,劉芳麗，李素云，等.信陽紅茶多糖的超聲波提取工藝及抗氧化活性研究[J].食品工業(yè),2014，（12):162-164.[16]苗爰清，孫)世利，曾瓊，等.超聲波輔助提取綠茶多糖的體外抗氧化活性研究[J].廣東茶業(yè)，2010,(1):40-42.[17]屠鵬飛主編.天然糖化學(xué).北京：