SN∕T 4848.6-2017 出口蜂蜜中常見(jiàn)蜜源植物成分的檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法 第6部分：龍眼

中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)出口蜂蜜中常見(jiàn)蜜源植物成分的檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法第6部分：龍眼I 第5部分：椴樹(shù)： 第8部分：紫云英。本部分為SN/T4848的第6部分。1出口蜂蜜中常見(jiàn)蜜源植物成分的檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法第6部分：龍眼SN/T4848的本部分規(guī)定了出口蜂蜜中龍眼成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。本部分適用于出口蜂蜜中龍眼成分的定性檢測(cè)。本部分所規(guī)定方法的最低檢出限(LOD)為0.5%2規(guī)范性引用文件GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格GB14963—2011食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)蜂蜜GB/T27403—2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)DNA:脫氧核糖核酸(deoxyribonule2UNG:尿嘧啶N-糖基化酶(uracilN-glycosylase)BHQ1:黑洞猝滅基團(tuán)1(Blackholeq引物/探針序列(5'→3')長(zhǎng)度靶基因內(nèi)參照F:GCTGAAGCAGCTACTTTCGAR:AGGAGCCGTGTGAGATGAP:FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGA龍眼P:FAM-CTTCATTGAAAGAAAGGCATAACTA36.4體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇。8.1.1.5轉(zhuǎn)移上層清液至2mL離心管中；加入0.7倍體積的三氯甲烷，劇烈震蕩混勻，室溫下8.1.1.8加入0.8倍體積的異丙醇混勻，-20℃放置0.548.1.1.9棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀一次，12000r/min轉(zhuǎn)速下4℃離心10min。8.1.2蜂蜜上清DNA提取將上清分裝到2個(gè)50mL離心管中，每管20mL,參照附錄B步驟進(jìn)行核酸DNA提取，DNA存放8.2DNA濃度和純度的測(cè)定使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè)260nm和280nm處的吸光值A(chǔ)?go和A?80。DNA的濃度按照式(1)計(jì)算：c——DNA濃度，單位為微克每微升(pg/pL);A——260nm處的吸光值；N——核酸稀釋倍數(shù)。8.3實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增8.3.1實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系的反應(yīng)條件見(jiàn)表2。內(nèi)參照DNA模板(10ng/μL～200ng/μL)無(wú)菌ddH?O8.3.2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)程序內(nèi)參照基因：50℃2min;95℃預(yù)變性10min;95℃15s,60℃1min,40個(gè)循環(huán)。龍眼FSDlb基因：50℃2min;95℃預(yù)變性10min;95℃15s,60℃1min,50個(gè)循環(huán)。9質(zhì)量控制以下條件有一條不滿足時(shí)，實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效：a)空白對(duì)照：無(wú)熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，相應(yīng)的Ct值>50.0。b)陰性對(duì)照：無(wú)熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，相應(yīng)的Ct值>50.0。5c)45<Ct值<50,則重復(fù)實(shí)驗(yàn)一次。再次擴(kuò)增后Ct值<50,則判定為陽(yáng)性；Ct值≥50,則判定為6CCCAAGCTTCCTGATTGGGTAAGTTAGCTTCATTGAAAGAAAGTTATCCATTACCCTTTAATCTTTTTTAATTTTTCAGAAGC沉淀溶液