GB∕T 34331-2017 黃瓜綠斑駁花葉病毒透射電子顯微鏡檢測(cè)方法

黃瓜綠斑駁花葉病毒透射電子顯微鏡TestmethodofCucumbergreenmottlemosaicvirus2017-10-14發(fā)布2018-09-01實(shí)施中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局GB/T34331—2017 I Ⅱ 1 1 26透射電子顯微鏡檢測(cè)步驟 47血清學(xué)和分子生物學(xué)驗(yàn)證 4 4 附錄A(資料性附錄)黃瓜綠斑駁花葉病毒相關(guān)資料 附錄B(資料性附錄)常用試劑的配方 附錄C(資料性附錄)黃瓜綠斑駁花葉病毒電鏡照片 IⅡ124.2試劑和材料4.2.2四氧化鋨(結(jié)晶體)。4.2.3丙酮(分析純)4.2.8磷鎢酸(分析純)。4.2.9亞甲基藍(lán)。超薄切片機(jī)：相對(duì)濕度小于60%,溫度(20±5)℃,電源電壓穩(wěn)定(220±22)V,滿(mǎn)足防震要求。透射電鏡：相對(duì)濕度小于60%溫度(20±5)℃,電源電壓穩(wěn)定(220±22)V,具備儀器專(zhuān)用地線(xiàn)，接5.1.3人工接種CGMMV的鑒別寄主和繁殖寄主植物。5.2.1進(jìn)出境植物檢疫的取樣按照SN/T2122—2015的規(guī)定執(zhí)行。5.2.2田間作物取樣及試樣處理按照SN/T2964—2011的規(guī)定執(zhí)行。35.4.2.1在培養(yǎng)皿內(nèi)鋪上Para酸緩沖液(pH值7.2)配制的2%～3%(v/v)戊二醛固定液進(jìn)行前固定，在4℃下固定2h。戊二醛固4鈾染色時(shí)間15min～30min,檸檬酸鉛染色時(shí)間5min～10min,干燥后待檢。染色液的配制參見(jiàn)附錄B。6.3推薦放大倍率范圍：4000倍～20000倍。6.4懸液病毒試樣的透射電鏡觀察：低倍率(4-000倍左右)下選擇負(fù)染色劑著色的電子密度較大斑點(diǎn)用CCD相機(jī)記錄并儲(chǔ)存(或者用電子底片進(jìn)行拍照)CGMMV粒子的典型形態(tài)參見(jiàn)附錄C。6.5超薄切片試樣的透射電鏡觀察，電鏡低信率模式倍~1000倍)尋找切片，切換到正常放大模式觀察病變的細(xì)胞。逐步提高放大倍率，仔細(xì)觀察細(xì)胞超散或聚集分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，病毒聚集體中的病毒粒子呈整化。CGMMV感染的細(xì)胞圖像精確聚焦后用CCD相機(jī)記錄并儲(chǔ)存(或者用電子底片進(jìn)行拍照)。CGMMV粒子在感病細(xì)胞超薄切片中的典型形態(tài)參見(jiàn)附錄C。8檢測(cè)結(jié)果發(fā)布b)試樣名稱(chēng)；f)檢測(cè)結(jié)果和必要的說(shuō)明；g)檢測(cè)人簽字；h)檢測(cè)報(bào)告負(fù)責(zé)人的簽字；i)檢測(cè)報(bào)告的頁(yè)碼；j)發(fā)布檢測(cè)報(bào)告的實(shí)驗(yàn)室名稱(chēng)和地址；5保存在4℃冰箱內(nèi)，葉片和果實(shí)試樣應(yīng)保存在-20℃以下冰箱或凍干保存三67蛋白。5'端和3'端分別含有一段非編碼區(qū)。A.7分類(lèi)地位(摘譯自：國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)ICTV第九次病毒分類(lèi)報(bào)告，2012)科(Family):植物桿狀病毒科Virgaviridae屬(Genus):煙草花葉病毒屬Tobamovirus種(Species):曼陀羅木輕癥斑駁病毒Brugmansiamildmottlevirus(BMMV)黃瓜果實(shí)斑駁花葉病毒Cucumberfruitmottlemosaicvirus(CFMMV)黃瓜綠斑駁花葉病毒Cucumbergreenmottlemosaicvirus(CGMMV)雞蛋花花葉病毒Frangipanimosaicvirus(FrMV)皮爾斯堡木槿潛隱病毒HibiscuslatentFortPiercevirus(HLFPV)新加坡木槿潛隱病毒HibiscuslatentSingaporevirus(HLSV)日本黃瓜綠斑駁花葉病毒Kyurigreenmotlemosaicvirus(KGMMV)老布達(dá)辣椒病毒Obudapeppervirus(ObPV)齒瓣蘭環(huán)斑病毒Odontoglossumringspotvirus(ORSV)甜椒輕癥斑駁病毒Paprikamildmottlevirus(PaMMV)辣椒輕癥斑駁病毒Peppermildmotlevirus(PMMoV)長(zhǎng)葉車(chē)前草花葉病毒Ribgrassmosai薩蒙氏仙人掌病毒Sanmon.Opuntiaarus(SOV)扭果苣營(yíng)花碎色病毒Streptocarpusflowerbreakoirus(SFBV)煙草潛隱病毒Tobacolatentuirus(TLV)煙草輕癥綠花葉病毒Pobadeomildgreenmosaictmrus(TMGMiv)煙草花葉病毒Tobaccomosaicvirus(TMV)番茄花葉病毒Tomatomosaicuirus(ToMV)蕪菁脈明病毒Turnipvein-clearingvirus(TVCV)塊根落葵輕癥斑駁病毒UllucusmildmottlevirusCUMMV)山崳菜斑駁病毒W(wǎng)asabimottlevirus(WMoV)油菜花葉病毒Youcaimosaicvirus(YoMV)小西葫蘆綠斑駁花葉病毒Zucchinigreenmott8或NaH?PO?·2H?O31.21gNa?HPO?·2H?O或Na?HPO?·12H?O4689取等量的0.2mol/L磷酸緩沖液(pH值7.2)與2%四氧化鋨貯存液混合，現(xiàn)配現(xiàn)環(huán)氧樹(shù)脂Spurr's低黏度包埋劑配制見(jiàn)表B.3。8888327B.3.2環(huán)氧樹(shù)脂Epon812包埋劑環(huán)氧樹(shù)脂Epon812包埋劑配制見(jiàn)表B.4。B.4染色液配方B.4.12%磷鎢酸負(fù)染色液稱(chēng)取1.0g磷鎢酸，用50mL雙蒸餾水配制成2%(w/v)的水溶液，用1mol/LNaOH調(diào)6.7～6.8,過(guò)濾后4℃下保存?zhèn)溆?。B.4.