豬鏈球菌病診斷技術(shù) 編制說明

1鏈球菌病相關(guān)國(guó)標(biāo)和行標(biāo)（GB/T1試驗(yàn)操作規(guī)程；GB/T19915.2－2005豬鏈球菌2型分離鑒定操作規(guī)程；GB/T-2005豬鏈球菌2型熒光PCR檢測(cè)方法；GB/T19915.8－2005豬鏈球菌2型的《豬鏈球菌病診斷技術(shù)》標(biāo)準(zhǔn)。為此，由南2341、標(biāo)準(zhǔn)編制遵循“先進(jìn)性、實(shí)用性、統(tǒng)一性、規(guī)范性”的原則，注重2、標(biāo)準(zhǔn)編制格式符合GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)3、本次標(biāo)準(zhǔn)的修訂主要以原國(guó)家《GB/T19試管凝集試驗(yàn)操作規(guī)程》、《GB/T19915.2－2005豬鏈球菌2型分離鑒定操作規(guī)程》、《GB/T19915.3－2005豬鏈球菌2型PCR定型檢測(cè)技術(shù)》、《GB/T19915.4-2005豬鏈球菌2型三重PCR檢測(cè)方法》、《GB/T19915.5－2005豬鏈球菌2型多5保存與運(yùn)輸，馬鏈球菌獸疫亞種、豬鏈球菌等主要致病菌普通和熒光PCR方法、主要內(nèi)容包括技術(shù)指標(biāo)、參數(shù)、公式、性能要求、試驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則等。要求，之前的規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)已不能適應(yīng)新形勢(shì)球菌獸疫亞種的檢測(cè)，除了PCR方法，還增加了敏感性控技術(shù)研究與示范》（200803016）和《豬鏈球菌病防控技術(shù)研究與示范》（201303041）項(xiàng)目，圍繞豬鏈球菌病應(yīng)急防控、流行病學(xué)調(diào)查、致病機(jī)制、檢學(xué)技術(shù)二等獎(jiǎng)，山東省農(nóng)牧漁業(yè)豐收獎(jiǎng)成果獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)、四川省科學(xué)技術(shù)三等獎(jiǎng)，6——增加了豬鏈球菌通用PCR試驗(yàn)（見5——增加了豬鏈球菌7型PCR試驗(yàn)（見6——增加了豬鏈球菌9型PCR試驗(yàn)（見6——增加了豬鏈球菌通用熒光PCR試驗(yàn)（見5——增加了豬鏈球菌2型熒光PCR試驗(yàn)（見6——增加了豬鏈球菌7型熒光PCR試驗(yàn)（見6——增加了豬鏈球菌9型熒光PCR試驗(yàn)（見6——增加了馬鏈球菌獸疫亞種PCR試驗(yàn)（見6——增加了馬鏈球菌獸疫亞種熒光PCR試驗(yàn)（見57Diseasesofswine,2019:934-950.）等文獻(xiàn)方法，同時(shí)依據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《豬鏈球菌病監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范》（NY/T《豬2型鏈球菌病防治技術(shù)規(guī)范》（DB51/T1103—2018）等標(biāo)準(zhǔn)中的相關(guān)描述，Streptococcosis[J].Diseasesofswine,2019:934-950.）等文獻(xiàn)方法，同時(shí)參考發(fā)現(xiàn)疑似鏈球菌病病例時(shí)，應(yīng)在同一豬群的不同個(gè)體或同一個(gè)體不同組織中分離；因該菌在健康豬肺中存在，故患敗血癥的病豬應(yīng)優(yōu)先從采取肺臟以外的其它組織進(jìn)行分離；患有腦膜炎病豬，應(yīng)采取腦脊液進(jìn)行分離培養(yǎng)。8（1）采樣前的準(zhǔn)備。采樣人員應(yīng)具備相應(yīng)的專業(yè)知識(shí)和采樣的基本技能；Streptococcosis[J].Diseasesofswine,2019:934-950.《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)ManualofSystematicBacteriology,SecondEdition,VolumeThree,TheFirmicutes[M].Heidelberg:Springer.2009：655-710.《獸醫(yī)微生物學(xué)》第六版（陸承平，劉永杰.2021.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].第6版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版，9分離豬鏈球菌時(shí)采用THB選擇性增菌液培養(yǎng)基和THB綿羊血平板選擇性培養(yǎng)基。個(gè)卵圓形，在液體培養(yǎng)中才呈短鏈狀。馬鏈球菌獸疫亞種菌株大部分菌株形成左右，產(chǎn)生明顯的β溶血。革蘭氏染色均為陽性鏈狀球菌，固體培養(yǎng)基中呈短鏈排列，液體中細(xì)菌呈8~12節(jié)長(zhǎng)鏈狀排列。2014-2015年在廣州周邊地區(qū)共采集488份屠宰豬群扁桃體樣品和）；病的仔豬氣管中分離出1株豬鏈球菌強(qiáng)毒株，命名為SS2011GZ（畜牧與獸）；）；其分解或利用糖類等，建立其生化鑒定方法。方法建立的主要參考《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》，第二版，第三卷（2009年VosPD,GarrityGM.,JonesD.,etal.Bergey’sManualofSystematicBacteriology,SecondEdition,VolumeThree,TheFirmicutes[M].Heidelberg:Springer.2009：655-710.）；《獸醫(yī)微生物學(xué)》第六版（陸承平，劉永杰.2021.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].第6版.北京：中國(guó)生化反應(yīng)是定性反應(yīng)，結(jié)果以陽性（+陰性（-）和產(chǎn)氣（O）顯示。微量生化試驗(yàn)可用于鏈球菌的細(xì)菌鑒定，并己積累了大量的經(jīng)驗(yàn)，但鏈球菌生驗(yàn)最好還是與血清學(xué)、PCR等鑒定方法結(jié)合起來。大多豬鏈球菌菌株具有下述特性：在富含淀粉的培養(yǎng)基中能產(chǎn)生淀粉酶，VP反應(yīng)陰性，6.5%NaCl抑制其生長(zhǎng)，不能還原0.1%的美藍(lán)，能發(fā)酵菊粉和棉子糖，七葉苷水解陽性，粉的培養(yǎng)基中能產(chǎn)生淀粉酶，V-P反應(yīng)陰性，6.5%Nacl抑制其生長(zhǎng)，不見表4-1，目前已開發(fā)出商業(yè)化鑒定系統(tǒng)用于臨床鏈球菌分離株的鑒定，見表4-2。但由于鏈球菌生化特征變化較大，所以只能作菌種D--G--C--S.dysgalactiaessp.equis--C--S.equissp.zooepidemicusS.equissp.equisimilisC類豬鏈球菌S.ρorcinusD-----肺炎鏈球菌S.pneumoniae---化膿鏈球菌S.pyogenesA--R、S---+bioMerieuxbioMerieuxbioMerieux），條和全自動(dòng)生化分析儀對(duì)各代次之間進(jìn)行了比較鑒定，結(jié)果表明傳代穩(wěn)定性好）；）；GottschalkM.AnupdateonStreptococcussuisidentification[J].JournalofVeterinaryDInvestigation,1990,2(3):249-25作為抗原進(jìn)行多次重復(fù)免疫清潔級(jí)新西蘭白兔，可獲得豬鏈球菌2型、7型和9型參考菌株的高免血清（與濃度為4×109cfu/mL的參考菌株進(jìn)行試管凝集，效價(jià)應(yīng)清的制備及應(yīng)用》，應(yīng)用該特異性定型建立了豬鏈球菌2型、123456789NCTC10446NT77Pathogens2016,5(3).編本試驗(yàn)對(duì)豬鏈球菌、馬鏈球菌獸疫亞種、無乳鏈球菌、多動(dòng)物鏈球菌、嗜（M：Trans2Kmark；1：豬鏈球菌；2：馬鏈球菌氣單胞菌；6：肺炎克雷伯菌；7：停乳鏈參考文獻(xiàn)（OkuraM,etal.,:GeneticanalysisofcapsularpolysaccharidesynthesisgeneclustersfromallserotypesofStreptococcusforgenerationofcapsularvariation.Appliedandenvironme因的479-483bp位置序列為5’-CCTGG-3’，可被限制性核酸內(nèi)切酶MvaI識(shí)別，進(jìn)行豬鏈球菌2型的鑒定，以cpsK基因片段的限制性核圖7-2豬鏈球菌2型cpsK片段經(jīng)酶切試驗(yàn) 對(duì)實(shí)驗(yàn)室收集的378份屠宰場(chǎng)健康豬扁桃體進(jìn)行豬鏈球菌的分離培養(yǎng)及血通過分子雜交技術(shù)對(duì)比豬鏈球菌不同血清型菌株莢膜多糖合成相關(guān)基因簇的GenBank公布的豬鏈球菌cps7H基因序列（JX986796.1設(shè)計(jì)了針對(duì)豬鏈球菌cps7H基因的特異性引物，并通過優(yōu)化引物濃度、退火溫度等反應(yīng)體系和條件，建立了cps7HPCR檢測(cè)方法，并對(duì)該方法的敏感性、特異性等性能菌、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌2型及豬鏈球菌9bp2000250bp另外實(shí)驗(yàn)室從廣州周邊地區(qū)健康豬群及屠宰豬群采集的共計(jì)體樣本中，共分離到豬鏈球菌222株，用建立的PCR方法鑒定bp2000750250通過分子雜交技術(shù)對(duì)比豬鏈球菌不同血清型菌株莢膜多糖合成相關(guān)基因簇公布的cps9H基因序列（JX986798.1設(shè)PCR檢測(cè)方法，并對(duì)該方法的敏感性、特異性等性能進(jìn)行了評(píng)估，可用于豬鏈bp2000250bp750500250另外實(shí)驗(yàn)室從廣州周邊地區(qū)健康豬群及屠宰豬群共計(jì)758中，分離到豬鏈球菌222株，用建立的PCR方法鑒定出豬鏈球bp2000250本方法以豬鏈球菌種屬特異性基因recN作為靶基因，可用于豬鏈球菌所有Pathogens2016,5(3).編recN熒光PCR檢測(cè)方法，并對(duì)該方法37(10).通過分子雜交技術(shù)對(duì)比豬鏈球菌不同血清型菌株莢膜多糖合成相關(guān)基火溫度等反應(yīng)體系和條件，建立了cps2J熒光PCR檢測(cè)方法，并對(duì)該方法的參考文獻(xiàn)（Smith,H.E.,etal.,RapidPCRtestforStreptococcussuisserotype7.型菌株莢膜多糖合成相關(guān)基因簇的基因序列，發(fā)現(xiàn)莢膜多糖合成相關(guān)基因簇的重復(fù)性好、操作便捷等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疫病診斷與監(jiān)測(cè)。本研究根據(jù)37(10).通過分子雜交技術(shù)對(duì)比豬鏈球菌不同血清型菌株莢膜多糖合成相關(guān)基參考馬清霞等.豬鏈球菌病雙重PCR診斷方法的建立[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2007,37(8):700-704.；DB3中是高度保守的，而且在馬鏈球菌獸疫亞種無gcagccctcttggttggtgtggcagctgtatcagcagattctgttgagtcagctaagcctgtagcagtttagatagtgaagccgcagctacaaaggcagaagctgatctagttgctgcaaaagcagacctagcagccaatcacagctgcaaaagctgaatttgacaccgctcaagcagacttagctaccgctgaagctactataaaaaatggctgagttagaaagcaaaattcaagaaaagcaaaaagagctagaggacatcattcgtaaaccatgcagctatcggtggtcgtaatggagacgctM、DL-2000Marker；1~13equiSubspecieszooepidemic列（CP002904.1設(shè)計(jì)了針對(duì)SzM基鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株有特異性擴(kuò)增曲構(gòu)建的含SzM基因目的片段的陽性質(zhì)粒，分光果顯示標(biāo)準(zhǔn)品起始模板濃度與Ct值呈現(xiàn)具有良好2型等主要致病菌是一種非常重要的人獸共患病原菌，對(duì)豬鏈球菌病的有效控制本標(biāo)準(zhǔn)將提高了我國(guó)豬鏈球菌病診斷能力，預(yù)期培訓(xùn)國(guó)內(nèi)外診斷技術(shù)人員10000余人次，提高豬鏈球菌病疫情研判效率，減少由豬鏈球菌病造成的生豬患上述標(biāo)準(zhǔn)中，主要涉及豬鏈球菌2型分離鑒定、血清抗體檢測(cè)、PCR檢測(cè)和節(jié)炎等為主要臨床癥狀的豬傳染性疾病，其主要病原是豬鏈球菌的某些血清型（主要為2、7和9型）和馬鏈球菌獸疫亞二是部分內(nèi)容填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的空白。本標(biāo)準(zhǔn)增鑒定”中馬鏈球菌獸疫亞種生化鑒定、“9豬鏈球菌通用PCR試驗(yàn)”、“11豬鏈球“15豬鏈球菌7型熒光PCR試驗(yàn)”、“16豬鏈球菌9型熒光PCR試驗(yàn)”、“17馬鏈球“6豬鏈球菌和馬鏈球菌獸疫亞種的分離培養(yǎng)”中的豬鏈球菌分離培養(yǎng)、“7生化鑒定”中豬鏈球菌生化鑒定、“8豬鏈球菌鏈球菌2型PCR試驗(yàn)”、“14豬鏈球菌2型熒光PCR試驗(yàn)”等6部分雖與上述7項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)相似，但具有明顯的先進(jìn)性，以下就每項(xiàng)內(nèi)容與國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)“4.4.2分離培養(yǎng)”中使用的普通瓊脂綿羊血平板，使豬鏈球菌的生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，本標(biāo)準(zhǔn)“6.3.2分離培養(yǎng)”中使用的THB綿羊血平板，可減少其本標(biāo)準(zhǔn)“6.3.2分離培養(yǎng)”中使用的THB綿羊血平板從血液、關(guān)節(jié)液、病料分離培化鑒定”中七葉苷發(fā)酵反應(yīng)不穩(wěn)定，假陽性率和假陰性率高，本標(biāo)準(zhǔn)“6.3.4豬鏈球菌生化鑒定”去除了七葉苷發(fā)酵反應(yīng)，避免錯(cuò)誤判定；國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)“4.4.6豬鏈球菌2型定型PCR檢測(cè)”僅能對(duì)2型進(jìn)行PCR鑒定，本標(biāo)準(zhǔn)“9豬鏈球菌種特異性PCR規(guī)程》，本標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)豬鏈球菌2型、7型和9型的菌株進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，而不是對(duì)對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)文件《GB/T19915.3－2005豬鏈球菌2型PCR定型檢測(cè)技術(shù)》、率；標(biāo)準(zhǔn)《GB/T19915.4－2005豬鏈球菌2型三重PCR檢測(cè)方法》將2型莢膜基因（cps2）、溶菌酶釋放蛋白基因（mrp）和orf2三個(gè)毒力基因作為致病菌株的對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)文件《GB/T19915.6－2005豬鏈球菌2型通用熒光PCR檢測(cè)方法》方法》（GB/T19915.6-2005）和《豬鏈球菌2型熒光PCR檢測(cè)方法》（GB/T19915.7-2005）建立過程中能夠參考的豬鏈球菌的靶標(biāo)基因序列為300而本標(biāo)準(zhǔn)參