GBT 35939-2018 腦心肌炎病毒間接ELISA抗體檢測方法

GB/T35939—2018腦心肌炎病毒間接ELISA抗體檢測方法中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局GB/T35939—2018本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國動(dòng)物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC181)歸口。1GB/T35939—2018腦心肌炎病毒間接ELISA抗體檢測方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了腦心肌炎病毒間接ELISA抗體的檢測方法。下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求SN/T2984檢驗(yàn)檢疫動(dòng)物病原微生物實(shí)驗(yàn)活動(dòng)生物安全要求細(xì)則3縮略語BSA:牛血清白蛋白(Bovineserumalbumin)ELISA:酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linkedimmunosorbentassay)EMCV:腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditisvirus)HRP-SPA:辣根過氧化物酶標(biāo)記的葡萄球菌A蛋白(HorseradishperoxidaselabeledstaphylococcalproteinA)TMB:四甲基聯(lián)苯胺(Tetramethylbenzidine)VP1:病毒結(jié)構(gòu)蛋白1(Viralprotein1)2GB/T35939—20184.3.1重組EMCVVP1抗原(制備方法見附錄B中的B.1)。4.3.2EMCV陽性血清和EMCV陰性血清(制備方法見附錄B.2)。4.3.3HRP-SPA。4.3.4TMB(見附錄C)。4.3.5商品化EMCV抗體檢測試劑盒。5EMCV間接ELISA抗體檢測方法c)封閉：加入含5%脫脂乳粉的PBST,200μL/孔，置37℃下封閉2h;作1:50倍稀釋?；靹蚝蠓謩e取100μL依次加入間接ELISA板反應(yīng)孔中，每份血清加兩個(gè)孔。每塊5.2.4加酶標(biāo)記抗體和孵育：加入PBST稀釋工作濃度的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體(HRP-SPA)3GB/T35939—2018(1:3000稀釋),100pL/孔，37℃孵育0.5h。5.2.5洗滌同5.2.1b)。5.2.6加底物緩沖液和孵育：每孔加新配制的底物溶液(見C.6)100μL,37℃避光孵育5min～15min(參見附錄D)。5.2.7終止反應(yīng)見陽性對照血清孔呈鮮明的藍(lán)色，陰性對照血清孔無色或基本無色，加入2mol/LH?SO?溶液(見C.7),50μL/孔，終止反應(yīng)。5.2.8酶標(biāo)反應(yīng)板在波長為450nm的酶聯(lián)免疫吸附儀下讀取各孔的OD值，15min內(nèi)完成。5.3結(jié)果判定5.3.1結(jié)果計(jì)算P/N計(jì)算，P/N=被檢血清的兩孔平均OD?50值/陰性對照血清的兩孔平均OD??0值。陽性對照血清平均OD?50值≥0.5,陰性血清兩孔平均OD?50值≤0.2,判定試驗(yàn)條件成立。當(dāng)P/N≥2.1,判為陽性，P/N<2.1則判為陰性?；蚴褂蒙唐坊疎MCV抗體檢測試劑盒，其操作和判定按其說明書進(jìn)行。4GB/T35939—2018(資料性附錄)腦心肌炎是由腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditisvirus,EMCV)引起的多種脊椎動(dòng)物共患的傳染病，以腦炎、心肌炎以及心肌周圍炎為主要特征。豬和鼠是受感染最普遍的動(dòng)物。臨床上可引起仔豬急性致死性心肌炎和腦炎及母豬繁殖障礙等疾病。人可呈現(xiàn)輕度腦炎臨診癥狀。1960年巴拿馬首次比利時(shí)和塞浦路斯多次暴發(fā)流行，引起嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。我國于2007年在發(fā)病豬群中也發(fā)現(xiàn)腦心肌炎病例，并分離到病毒，但常表現(xiàn)為亞臨床感染。本病實(shí)驗(yàn)室診斷方法有小鼠感染試驗(yàn)、病毒分離鑒定、RT-PCR方法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、血清中和試驗(yàn)和間接免疫熒光試驗(yàn)等。5GB/T35939—2018(規(guī)范性附錄)抗原抗體的制備B.1重組EMCVVP1抗原制備B.1.1菌種表達(dá)EMCVVP1抗原蛋白的菌種為BL21-VP1,由EMCVVP1基因原核表達(dá)質(zhì)粒pET-VP1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)獲得。B.1.2菌液培養(yǎng)取BL21-VP1種子液按培養(yǎng)基體積1%量接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，200r/min,37℃搖床振蕩培養(yǎng)1.5h～2h,菌液濃度ODsoonm值達(dá)到1時(shí)，加入終濃度為0.7mmol/L的IPTG,37℃振蕩培養(yǎng)8h。B.1.3重組蛋白的表達(dá)及純化統(tǒng)試劑盒說明書，在變性條件下純化重組融合蛋白EMCvVP1。B.1.3.2重組菌裂解液的制備具體制備過程如下：a)將胍鹽細(xì)胞裂解緩沖液的pH調(diào)至7.8,并于37℃預(yù)熱；b)100mLLB液體培養(yǎng)基表達(dá)的重組菌液，7000r/min離心10min,收集菌體沉淀；c)用8mL胍鹽細(xì)胞裂解緩沖液，pH7.8條件下重懸上述菌體，室溫下震搖5min~10min,使菌體充分裂解；d)在功率200W的條件下超聲波裂解細(xì)菌，超聲裂解5s,停頓5s,直至菌液變得清澈，在冰盒上操作；e)將上述裂解物4℃8000r/min離心10min,沉淀菌體碎片，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。B.1.3.3親和層析柱的準(zhǔn)備具體準(zhǔn)備過程如下：a)檢查柱子下端的帽子完好無破損；b)從4℃冰箱取出樹脂小瓶，顛倒重懸樹脂使均勻；d)加入6mL無菌去離子水，上下顛倒使樹脂重懸、再自然下沉后緩緩吸出上清；f)重復(fù)d)～e)2次。具體純化方法如下：6GB/T35939—2018c)加入4mL結(jié)合緩沖液(pH7.8)重懸樹脂，充分震搖2min,使樹脂自然下沉，緩緩吸出上清，重復(fù)本步驟2次；d)加入4mL洗滌緩沖液(pH6.0)重懸樹脂，充分震搖2min,使樹脂自然下沉，緩緩吸出上清，重復(fù)本步驟1次～2次；e)加入4mL洗脫緩沖液(pH5.3)重懸樹脂，充分震搖2min,使樹脂自然下沉，緩緩吸出上清，重復(fù)本步驟1次～2次；10管收集洗脫的蛋白。紫外分光光度計(jì)測蛋白濃度。100℃煮沸5min,立即置冰上1min～2min,上樣前瞬時(shí)離心，吸取上清，用12%的丙烯酰胺SDS-度，純度不低于90%。B.1.4.2蛋白抗原性鑒定：上述恒壓下，轉(zhuǎn)印45min,使目的條帶轉(zhuǎn)印至NC膜上。用PBST配制的5%的脫脂乳封閉2h,PBST洗滌洗滌，再加1:20000稀釋的羊抗鼠IgGB.1.4.3蛋白濃度的測定：用紫外分光光度計(jì)分別測定包被抗原在280nm和260nm波長時(shí)的光吸收B.1.4.4蛋白免疫學(xué)活性鑒定：采用ELISA方法對抗原的免疫學(xué)活性進(jìn)行鑒定。用抗原包被液將純化B.1.5分裝及保存將合格的蛋白分裝到1.5mL微量離心管中，分裝量為1mL/管，置-70℃下保存，有效期為12個(gè)月。避免反復(fù)凍融和污染。B.2EMCV對照血清制備B.2.1.1血清來源動(dòng)物：4周齡～5周齡健康EMCV抗原和抗體雙陰性豬(ELISA檢測血清中EMCVEMCV抗體，中和抗體效價(jià)≥1:32時(shí)，即可用于采血并分離血清。7GB/T35939—2018B.2.2EMCV陰性對照血清稀釋液適量稀釋，用0.45μm濾膜過濾除菌，置一70℃以下保存，避免反復(fù)凍融和污染，有效期24個(gè)月。8GB/T35939—2018(規(guī)范性附錄)溶液的配制C.1抗原包被液(pH9.6,0.05moL/L)稱取Na?CO?1.59g、NaHCO?2.93g,加去離子水800mL,用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl調(diào)至pH9.6,加去離子水定容至1000mL。稱取BSA0.5g、蔗糖2g,加去離子水溶解并定容至100mL,0.22μm濾膜過濾，分裝后2℃~8℃?zhèn)溆?。C.4樣品稀釋液取NaCl8g、KH?PO?·2H?O0.2g、Na?HPO?·12H?O2.9g、KCl0.2g和Tween-200.5mL,溶瓶。2℃~8℃下保存。取NaCl80g、KH?PO?·2H?O2g、Na?HPO?·12H?O29g、KCl2g、Tween-205mL,加入瓶。2℃~8℃下保存。洗滌液配制：將10倍濃縮洗滌液恢復(fù)至室溫，并搖動(dòng)使沉淀溶解(或于37℃水浴鍋中加熱5min~10min),然后用去離子水作10倍稀釋，混勻，稀釋好的洗