類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎分期診斷和TGF-β1分子表達(dá)的相關(guān)性研究

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎分期診斷和TGF-β1分子表達(dá)的相關(guān)性研究

[摘要]目的：探究轉(zhuǎn)化生長因子β1（TransformingGrowthFactor-Beta1，TGF-β1）分子表達(dá)與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RheumatoidArthritis，RA）分期診斷的相關(guān)性，為早期RA分期診斷提供新的診斷指標(biāo)和理論依據(jù)。方法：收集2018年01月至2018年12月在成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院就診的RA患者樣品60例以及同期正常樣品20例，根據(jù)臨床診斷打分和實(shí)驗(yàn)診斷結(jié)果對(duì)RA患者樣品60例分活動(dòng)Ⅰ期14例，活動(dòng)Ⅱ期18例，活動(dòng)Ⅲ期28例。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）、反轉(zhuǎn)錄-熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-Q-PCR）方法、酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）方法對(duì)所有樣本Th17細(xì)胞亞型，血液TGF-β1mRNA，血清TGF-β1蛋白進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果：研究表明，RA樣本和正常樣品相比，TGF-β1表達(dá)具有顯著差異（P<0.05）。Th17細(xì)胞亞型，TGF-β1蛋白，TGF-β1mRNA結(jié)果與RADAS28活動(dòng)分期的相關(guān)性分別為r=0.482，r=-0.256，r=0.490。結(jié)論：通過血液樣本對(duì)TGF-β1分子表達(dá)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其與RA分期診斷具有相關(guān)性。且TGF-β1mRNA比Th17細(xì)胞亞型和TGF-β1蛋白結(jié)果更具有參考性，TGF-β1mRNA分子表達(dá)檢測(cè)可以作為RA早期分期診斷指標(biāo)，為臨床RA早診斷早治療提供理論依據(jù)。[關(guān)鍵詞]類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；分期診斷；TGF-β1；分子表達(dá)[通信作者]王近吳，女，碩士生，基礎(chǔ)研究，E-mail：jinwuwang95@163.com；TelorrelationbetweenstagingdiagnosisandTGF-β1expressioninrheumatoidarthritisWang-Jinwu1,Zhang-Xinmao1（ChengduMedicalCollege,Chengdu,Sichuan,610500,P.R.China）【Abstract】Objective:Toinvestigatethecorrelationbetweentheexpressionoftransforminggrowthfactor-β1(TGF-β1)andthediagnosisofrheumatoidarthritis(RA),andtoprovidenewdiagnosticindicatorsandtheoreticalbasisfortheearlystagediagnosisofRA.Methods:WeCollected60RApatientsand20normalsamplesfromthesameperiodintheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollegefromJanuary2018toDecember2018.Accordingtoclinicaldiagnosisscoresandexperimentaldiagnosisresults,60patientswerepidedintodeseaseactivities.Therewere14casesinstageI,18casesinstageII,and28casesinstageIII.WehaddetectedTcellsubtypes,TGF-β1proteinandTGF-β1mRNAexperessionlevelforallsamplesbyFlowcytometry(FCM),enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA),fluorescencequantitativepolymerasechainreaction(RT-Q-PCR)methods.Results:StudiesshowthatthereisasignificantdifferenceintheexpressionofTGF-β1proteinandTGF-β1mRNAbetweenRAsamplesandnormalsamples(P<0.05).ThecorrelationofTh17cellsubtype,TGF-β1protein,mRNAandRADAS28activitystagewasr=0.482,r=-0.256,r=0.490.Conclusion:WefoundthattheexpressionofTGF-β1moleculehasacorrelationwiththediagnosisofRAstaging.Moreover,TGF-β1mRNAisbetterthanproteinresults.TGF-β1moleculeexpressioncanbeusedasanearlydiagnosticmarkerforRAanditprovideatheoreticalbasisforearlydiagnosisandearlytreatmentofRA.【Keywords】RheumatoidArthritis；stagingdiagnosis；transforminggrowthfactor-beta1；molecularexpression類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（（RheumatoidArthritis，RA）是一種常見的骨關(guān)節(jié)滑膜炎系統(tǒng)性自身免疫性疾病，多見于女性[1，2,3]，多見于女性，全球患病率達(dá)到1%[4]。其主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥、增生形成血管翳，侵犯關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨、韌帶和肌腱等[1，5-9]，是一種對(duì)稱性、慢性、進(jìn)行性多關(guān)節(jié)炎。RA造成關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失，對(duì)患者生活自理能力產(chǎn)生嚴(yán)重影響，給國家醫(yī)療造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)?，F(xiàn)行研究RA發(fā)病機(jī)制除與遺傳和環(huán)境相關(guān)外，涉及復(fù)雜的細(xì)胞免疫及體液免疫反應(yīng)，具體致病機(jī)制不清楚[10]。多項(xiàng)研究表明RA患者外周血Th1、Th2、Treg和Th17亞細(xì)胞群間存在的動(dòng)態(tài)平衡及交互抑制作用被打破，RA的早期發(fā)生與Th1/Th2細(xì)胞的失衡有關(guān)，后期發(fā)展與Th17/Treg細(xì)胞的失衡有關(guān)系[11-13]。我們推測(cè)機(jī)體處于Th1/Th2/Treg/Th17其中一種或幾種細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)的漂移現(xiàn)象，這可能是導(dǎo)致RA全身及關(guān)節(jié)局部炎癥持續(xù)的原因之一。臨床主要通過定量的實(shí)驗(yàn)診斷結(jié)果和定性的患者病理情況對(duì)RA患者進(jìn)行診斷和分期，由于RA活動(dòng)期癥狀和靜止期不同，且表現(xiàn)多樣，實(shí)驗(yàn)診斷和病理情況不能很好地對(duì)處于活動(dòng)期的RA進(jìn)行分期診斷。免疫初始T細(xì)胞分化不平衡與參與RA致病過程的眾多關(guān)鍵細(xì)胞因子分泌紊亂有關(guān)，前人研究表明參與RA致病過程的關(guān)鍵細(xì)胞因子很多，包括了多種白介素（如IL-1β，IL-4，IL-6，IL-10，IL-17，IL-21，IL-23）、干擾素（Interferon，IFN）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TransformingGrowthFactor-Beta1，TGF-β1）和腫瘤壞死因子（TumorNecrosisFactor，TNF）等[14,15]。其中轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）的表達(dá)異常與Th1/Th17和Th17/Treg細(xì)胞的分化失衡密切相關(guān)[10,16]。轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）是一種對(duì)細(xì)胞成熟、增值，分化具有雙重調(diào)節(jié)作用的多功能因子[17]。TGF-β1通過smads蛋白傳遞信號(hào)，它的表達(dá)幾乎關(guān)系到RA病情發(fā)生、發(fā)展、治療、預(yù)后及轉(zhuǎn)歸的全過程，其作用復(fù)雜多樣。所以TGF-β1基因的表達(dá)與RA患者的免疫狀態(tài)息息相關(guān)，并影響RA的病程[18,19]。1資料與方法1.1一般資料收集成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院RA病人60例(全部為女性，平均年43±8.7)，健康人群20例（全部為女性，年齡在40±7.6歲之間）清晨空腹靜脈血2ml左右兩管，活動(dòng)期必須同時(shí)滿足下列條件：（1）4個(gè)或以上的關(guān)節(jié)腫脹；（2）6個(gè)或以上的關(guān)節(jié)觸痛；（3）符合下面兩條標(biāo)準(zhǔn)中任意1條：隨訪當(dāng)日晨僵持續(xù)時(shí)間≥45min，血沉（魏氏法）≥28mm/h，C反應(yīng)蛋白（C-Reactiveprotein，CRP）>10mg/L[20,21]。所有病人均符合2010年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)的RA分類標(biāo)準(zhǔn)[22]；排除非RA標(biāo)準(zhǔn)：無其他嚴(yán)重病史者；3個(gè)月以內(nèi)未接受過生物制劑或關(guān)節(jié)皮質(zhì)類固醇治療。臨床評(píng)估包括壓痛和腫脹關(guān)節(jié)數(shù)，DAS28評(píng)分和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)紅細(xì)胞沉降率（ErythrocyteSedimentationRate，ESR）[6]、CRP、類風(fēng)濕因子（RF）、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（AntiCyclicCitrullinatedPeptideAutoantibody,ACPA）。RA組與健康對(duì)照組兩組間的性別以及年齡比均衡性檢驗(yàn)皆顯示無差異[20]。1.2方法分別對(duì)血液樣本進(jìn)行了T細(xì)胞亞型FCM分析、TGF-β1蛋白ELISA檢測(cè)和mRNA熒光定量PCR檢測(cè)。1.3相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用GraphPadPrism7.0軟件分析和作圖。結(jié)果數(shù)值用(x±s)表示，不同組間比較采用t檢驗(yàn)和方差分析，不同組間數(shù)據(jù)相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析[23]，最終統(tǒng)計(jì)結(jié)果以(P<0.05)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1樣本分類和實(shí)驗(yàn)診斷指標(biāo)結(jié)果收集成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院RA病人60例，健康人群20例血液樣本。對(duì)60例RA患者標(biāo)本應(yīng)用疾病活動(dòng)評(píng)分DAS28分成RA活動(dòng)期Ⅰ期（DAS28≤3.2），RA活動(dòng)期Ⅱ期（3.2<DAS28≤5.1）和（DAS28>5.1）。正常樣本和RA活動(dòng)期樣本之間，年齡，疾病持續(xù)時(shí)間并無統(tǒng)計(jì)差異，血沉ESR，類風(fēng)濕因子RF和抗環(huán)瓜氨酸肽自身抗體(ACPA）在RA活動(dòng)期Ⅱ期和Ⅲ期并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(見表2-1)表2-1樣本分類和實(shí)驗(yàn)診斷指標(biāo)正常樣品RA活動(dòng)Ⅰ期RA活動(dòng)Ⅱ期RA活動(dòng)Ⅲ期例數(shù)（例）20141828年齡（歲）37±5.236±3.538±4.742±4.1疾病持續(xù)時(shí)間（年）--3±1.23±1.44±1.1血沉(mm/h)--32±8.447±6.548.5±16.0內(nèi)風(fēng)濕因子（陽性率）--6/14(42.9%)14/18(77.8%)22/28(78.6%)抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（陽性率）--4/14(28.6%)8/18(44.4%)11/28(39.3%)DAS-28score--DAS28≤3.23.2<DAS28≤5.1DAS28>5.1注：數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用t-檢驗(yàn)方法,--表示無或未檢測(cè)到結(jié)果，?P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.2血液樣本T細(xì)胞亞型FCM處理結(jié)果收集成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院RA病人60例，健康人群20例血液樣本，通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)Th1，Th2,Th17和Treg細(xì)胞進(jìn)行分選和計(jì)數(shù)。以同型對(duì)照標(biāo)記為對(duì)比，計(jì)算各血液T細(xì)胞亞型相對(duì)頻率。Th1和Treg細(xì)胞亞型RA活動(dòng)Ⅲ期對(duì)正常樣本具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），Th2細(xì)胞亞型無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Th17細(xì)胞亞型RA活動(dòng)Ⅰ期，Ⅱ期，Ⅲ期對(duì)正常樣本都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。(見表2-2)表2-2血液樣本T細(xì)胞亞型相對(duì)頻率組別Th1cell(%)Th2cell(%)Th17cell(%)Tregcell(%)RA樣本7.2±4.8?1.6±0.81.2±0.9?1.9±1.1?RA活動(dòng)Ⅰ期6.1±3.71.9±0.50.9±0.5?2.6±0.6RA活動(dòng)Ⅱ期5.8±4.51.8±0.41.1±0.6?1.7±1.3RA活動(dòng)Ⅲ期6.9±4.8?1.8±1.01.3±1.0?1.5±1.1?正常樣品2.6±1.31.6±0.90.6±0.32.7±1.7注：數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用t-檢驗(yàn)方法,?P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.3血清樣本TGF-β1蛋白ELISA檢測(cè)結(jié)果對(duì)收集到RA病人60例，健康人群20例血清樣本ELISA檢測(cè)TGF-β1蛋白結(jié)果顯示，總體RA樣本TGF-β1蛋白濃度表達(dá)和健康對(duì)照組相比低40pg/ml，但P>0.05無統(tǒng)計(jì)差異。RA活動(dòng)Ⅰ期和Ⅲ期跟健康對(duì)照組相比也無差異，值得注意的是RA活動(dòng)Ⅱ期TGF-β1蛋白濃度表達(dá)較低，跟健康對(duì)照組相比，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(見表2-3)表2-3血清RA活動(dòng)組與健康對(duì)照組TGF-β1水平比較（x±S）組別例數(shù)TGF-β1（pg/ml）RA樣本60328.36±16.89RA活動(dòng)Ⅰ期14367.55±23.06RA活動(dòng)Ⅱ期18286.28±12.58?RA活動(dòng)Ⅲ期28321.24±14.20?健康對(duì)照組20368.36±15.45注：數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用t-檢驗(yàn)方法,?P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.4血液mRNA熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果對(duì)收集到的60例RA病人血樣和20例健康人群血樣，提取RNA,反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCRTGF-β1后，根據(jù)CFX96本身軟件采用2-??Ct的相對(duì)定量計(jì)算方法，結(jié)果表明RA樣本TGF-β1轉(zhuǎn)錄子相對(duì)表達(dá)量低于正常樣本組。而且根據(jù)RA活動(dòng)期加強(qiáng)，TGF-β1轉(zhuǎn)錄子相對(duì)表達(dá)量成負(fù)相關(guān)性，都差異低于正常樣本組，而且組間差異P<0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(見圖2-1)圖

2-1：TGF-β1mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較注：control為正常對(duì)照組，RA1為RA活動(dòng)Ⅰ期，RA2為RA活動(dòng)Ⅱ期，RA3為RA活動(dòng)Ⅲ期，?P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.5散點(diǎn)圖相關(guān)性分析根據(jù)RA患者分期樣本和正常對(duì)照組樣本的流式結(jié)果（Th17），ELISA結(jié)果，熒光定量PCR結(jié)果，對(duì)應(yīng)DAS28分期樣本，運(yùn)用采用Spearman相關(guān)分析方法，進(jìn)行組間相關(guān)性分析。流式Th17細(xì)胞頻率結(jié)果顯示，和RA患者嚴(yán)重程度成正比，且各組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。ELISATGF-β1蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，RA活動(dòng)Ⅱ期、RA活動(dòng)Ⅲ期和正常對(duì)照組相比表達(dá)降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。熒光定量PCRTGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)結(jié)果顯示，和RA患者嚴(yán)重程度成正比，且各組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。熒光定量PCR結(jié)果與流式（Th17）結(jié)果相比，與DAS28分期的相關(guān)性要高（r=0.490VSr=0.482）。(見圖2-2)圖2-2：檢測(cè)結(jié)果與DAS28分期的相關(guān)性散點(diǎn)圖注：control為正常對(duì)照組，RA1為RA活動(dòng)Ⅰ期，RA2為RA活動(dòng)Ⅱ期，RA3為RA活動(dòng)Ⅲ期，?P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3討論類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種較為常見的系統(tǒng)性自身免疫病，全球流行，但具體致病機(jī)制尚不清楚[24-26]。目前RA的臨床診斷一般是通過定性的臨床病理分析和定量的檢驗(yàn)指標(biāo)。本文通過定性病理分析，對(duì)照樣本，比較了RA與正常人的組間差異和不同活動(dòng)期的相關(guān)性。TGF-β1低濃度時(shí)與IL-6聯(lián)合作用促進(jìn)分化為Th17細(xì)胞，單獨(dú)高濃度時(shí)促進(jìn)分化為Treg細(xì)胞，而Th17/Treg的平衡影響RA的病情進(jìn)程[27,28]。同時(shí)TGF-β1蛋白表達(dá)受TGF-β1基因和mRNA表達(dá)的影響，而且與轉(zhuǎn)錄后修飾和翻譯調(diào)控有關(guān)?；颊逺A和正常樣本血細(xì)胞TGF-β1蛋白表達(dá)水平在不同的研究中，結(jié)果有差異。RA患者血液中TGF-β的水平明顯低于正常人,因此RA患者下調(diào)免疫活動(dòng)的功能下降,自身免疫反應(yīng)異常,自身抗體及免疫球蛋白合成增多[29,30]。TGF-β1對(duì)RA患者起到很重要的保護(hù)作用,它的減少導(dǎo)致RA患者自身免疫紊亂[29]。正常人群各細(xì)胞因子和T亞群細(xì)胞正常分泌行使功能，而RA患者各細(xì)胞因子分泌紊亂，導(dǎo)致T亞群細(xì)胞分化失衡，分化失衡反過來也影響各細(xì)胞因子的分泌[31-34]。TGF-β1基因的表達(dá)與RA患者的免疫狀態(tài)息息相關(guān)。其作用形式多樣，生物功能復(fù)雜，單獨(dú)存在時(shí)和與其他細(xì)胞因子共同作用的時(shí)候，對(duì)人體免疫細(xì)胞的分化和發(fā)展影響完全不一樣。因此，TGF-β1的分子表達(dá)與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)系值得我們?nèi)パ芯?。分析TGF-β1檢測(cè)結(jié)果與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎不同活動(dòng)期的相關(guān)性，鑒定分析對(duì)于評(píng)價(jià)RA早期診斷分期具有臨床意義的分子表達(dá)指標(biāo)，有助于臨床早期診斷RA和其分析用藥，最終為探究RA的發(fā)生與發(fā)展關(guān)系，研究TGF-β1分子表達(dá)在RATh17/Treg細(xì)胞分化平衡中的作用機(jī)制，對(duì)早期診斷、評(píng)價(jià)病程發(fā)展提供借鑒，為治療RA提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。參考文獻(xiàn)[1]左進(jìn)紅.中成藥治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的網(wǎng)狀Meta分析[D].廣州中醫(yī)藥大學(xué),2018.[2]陳磊,汪元,潘惠,劉佳佳,梁紅.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎合并心血管疾病的危險(xiǎn)因素分析[J].中華中醫(yī)藥雜志,2019,34(01):328-331.[3]胡筱娟,程紅衛(wèi),秦艷,劉恬園,劉亞東,張冠杰.青白通痹膠囊聯(lián)合小劑量甲氨蝶呤治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的臨床效果[J].臨床醫(yī)學(xué)研究與實(shí)踐,2019,4(02):111-112+121.

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