化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則 第14部分：藻類生長抑制試驗 征求意見稿

化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則第14部分：藻類生長抑制試驗本文件規(guī)定了化學農(nóng)藥藻類生長抑制試驗的試驗條件、試劑或材料、儀器設(shè)備、樣品、試驗步驟、試驗數(shù)據(jù)處理、質(zhì)量控制以及試驗報告等本文件適用于為化學農(nóng)藥登記而進行的藻類生長抑下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修NY/T3273難處理農(nóng)藥水生生物毒性試驗指南NY/T4195.6農(nóng)藥登記環(huán)境影響試驗生物試材培養(yǎng)第6半效應(yīng)濃度medianeffective試物濃度，用EC50表示。在本文件中，通過藻類平均生長速率averagegrowthrate（averagespecificg特定暴露時段內(nèi)的平均生長速率，即暴露結(jié)束與暴露開始時受試藻生物量之差除以時長（如3d），用μ表示。特定暴露時段內(nèi)的生物量增長量，即暴露結(jié)束時的生物量減去暴露開始時的生物量，用Y表用被試物及藻類培養(yǎng)基配制一系列不同濃度的試驗藥液，將試驗藥液與藻液混合后，連續(xù)染毒72h。試驗期間觀察受試藻的生長抑制情況，求出半效應(yīng)濃度72h-EC50（EyC50、Era)環(huán)境溫度21℃~24℃,但單次試驗應(yīng)控制在±1℃;），），6.1.3丙酮（C3H6O，CAS——近頭狀尖胞藻（RaphidocelissubcaNY/T4195.6培養(yǎng)；——近具棘鏈帶藻（Desmodesmussubspicatus）。——舟形藻（Naviculapelliculosa）。——水華魚腥藻（Anabaenaflos-aquae）；試驗容器及任何可能接觸到試驗藥液的器件均應(yīng)由玻璃或其他化學惰性材料制成。不應(yīng)使用硅膠管、硅膠密封圈等吸附性較強的材料，確需使用時，相關(guān)器件不能重復利用，試驗后立即作試驗容器應(yīng)與試驗藥液體積相匹配，常見配b)250mL三角瓶，盛裝試驗藥液體積宜為（70～100）mL。c)500mL三角瓶，盛裝試驗藥液體積宜為（100～1試驗容器應(yīng)配備便于CO2傳遞的透氣塞，所有器具均應(yīng)在試驗前進行徹底清洗和6.4.1近具棘鏈帶藻宜使用水生4號培養(yǎng)基或OECD藻類培養(yǎng)養(yǎng)基或OECD藻類培養(yǎng)基，硅藻和藍藻宜使若使用其他培養(yǎng)基應(yīng)同時提供培養(yǎng)基名稱和配6.4.2若使用其他藻種，應(yīng)選擇適宜的培養(yǎng)基，并同時提供培養(yǎng)基名稱和配方6.4.3當被試物具有金屬螯合作用或在其他特定pH條件下開展試驗需調(diào)整培養(yǎng)基配方時，應(yīng)詳細7.8顯微鏡與血球計數(shù)板、分光光度計、流式細胞儀、電子顆粒計數(shù)儀等藻細胞計數(shù)設(shè)7.10氣相色譜儀、高效液相色譜儀、質(zhì)譜儀、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、高效液相色譜-質(zhì)農(nóng)藥原（母）藥、制劑或純品。試驗開始前，收集被試物以下a)劑型，以及有效成分結(jié)構(gòu)式、分子量、純度/含量等基本b)在水中和有機溶劑中的溶解度；c)在水中的穩(wěn)定性和光解穩(wěn)定性，光吸h)作用方式；i)用于定量檢測試驗藥液中被試物濃度的分按正式試驗的條件，以較大的間距設(shè)置若干組濃度，為正式試驗濃度設(shè)置提供藥液用于被試物濃度檢測，但也應(yīng)接種同等生物量的藻細胞并在置于相同試驗條用培養(yǎng)基將被試物或由被試物制備而成的儲備液稀釋成試驗藥液混合均勻。應(yīng)觀察并記錄試驗藥液的顏色和狀態(tài)（例如是否澄清、是否為均勻分散的懸浮液或乳被試物揮發(fā)性強、吸附性強、在測試條件下不穩(wěn)定或難溶于水而難度，或?qū)е略囼炈幰河蓄伾珪r，按照NY/T3273規(guī)定的程序開展試驗。試驗藥液短暫靜置后出現(xiàn)沉淀時，可采用虹吸管、離心、過濾膜等應(yīng)改變被試物特性。例如，對于農(nóng)藥混配制劑，試驗藥液中有效成分的比例不應(yīng)與其產(chǎn)品配比發(fā)按一定比例將藻液接種到試驗藥液中。所有處理組包括對照組應(yīng)含有相同濃度的培養(yǎng)基和初藻初始藻細胞濃度為5.0×103個/mL～5.0染毒后，用透氣塞蓋上試驗容器，搖勻，在培養(yǎng)設(shè)備中隨機擺放。通過持續(xù)振蕩或保藻細胞保持懸浮狀態(tài)。當pH波動＞1.5，可增大振蕩、攪拌頻率，或減少a)血球計數(shù)板法：在顯微鏡下準確計數(shù)，同一樣品至少計數(shù)2次，如48h、72h計數(shù)結(jié)果相b)其他檢測方法，例如分光光度法等，應(yīng)確保選用的方法與血球計數(shù)法具有足夠的相關(guān)性。水中溶解度時，在對水樣進行提取等化學分析前處理操作之前，應(yīng)進行離心或過a)離心法：在（100000～400000當被試物不穩(wěn)定時，對采集的樣品應(yīng)立即進行檢測，否則應(yīng)驗證儲存驗藥液制備、染毒、培養(yǎng)、觀察與測定，以及濃度檢測均與正式試驗相同。當與對照組相比，處理組未對藻類生長產(chǎn)生顯著影響（例如t檢驗結(jié)果顯示P>0.05），無需開展正式試驗。處理組濃9.5參比物試驗以表格形式總結(jié)數(shù)據(jù)，給出每個觀察時間，每個處理組和對照組（包括溶復的藻細胞計數(shù)或測定結(jié)果、異常外觀等，并繪制生長曲線圖。在藻細胞指數(shù)生長期，通過對其數(shù)量進行對數(shù)轉(zhuǎn)換，生長曲線能擬合成1條直線，其斜率即代表藻細基于藻類生物量增長計算的處理組受抑制率按公式（1）Iy=×100…………………（1）cIy——基于生物量增長計算的處理組受抑制率（%YY基于藻類平均生長速率計算的處理組受抑制率按公式（×100…………………（2）Ir——基于平均生長速率計算的處理組受抑制率（%μc——對照組平均生長速率；其中μ按公式（3）計算：Xj——在時間點j時的藻類生物量，用細胞數(shù)表示時單位為個/mL。10.4.1繪制濃度-效應(yīng)曲線圖。選擇適宜的統(tǒng)計方法（如概率單位法、二項式法）和統(tǒng)計軟件，分別以設(shè)定濃度和實測濃度估算EC50b)初始藻細胞濃度滿足要求：近具棘鏈帶藻濃度在2.0×103個/mL～5.0×103個/mL，近頭狀尖胞藻在5.0×103個/mL～5.0×104g)參比物3,5-二氯苯酚對近具棘鏈帶藻和近頭狀尖胞藻的7mg/L～0.96mg/L和0.92mg/L～1.h)對試驗中偏離試驗準則的情形均進行了描述和評估。2)有效成分結(jié)構(gòu)式、分子量、CAS號，以及基本理化性質(zhì)如水溶解度、穩(wěn)定性等信息；3)培養(yǎng)基，以及在實驗室內(nèi)的保種與——每個處理組初始測定濃度與設(shè)定濃度的百分比，試驗結(jié)束與試驗開始的測定濃度百10）試驗過程中發(fā)生的可能影響結(jié)果的事件，偏離試驗準則的情況、后果及相關(guān)12過磷酸鈣飽和液（[Ca(H2PO4)2?H2O?（C34567在水浴中沸水加熱3h，冷卻，沉淀24h，此過程連續(xù)進行3次，然后過濾，取上清液，于高），123456789將以上各成分配制成相應(yīng)母液濃度，并按照標明順序依次將相應(yīng)母液用量轉(zhuǎn)移至），），B.1對照組各時段（0h～24h、24h～48h、48h～72h）平均平均生長速率(μ)（d-1）48h～72h123456B.2對照組試驗期間平均生長速率變異系數(shù)計算示例見表B.2。0h~