化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則 第7部分：生物富集試驗(yàn) 征求意見稿

4化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第7部分：生物富集試驗(yàn)本文件規(guī)定了采用水體暴露法進(jìn)行生物富集試驗(yàn)和采用攝食暴露法進(jìn)行生物放大試驗(yàn)的條件、試劑或材料、儀器設(shè)備、樣品、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理、質(zhì)量控制以及試驗(yàn)報(bào)告等下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修NY/T4195.3農(nóng)藥登記環(huán)境影響試驗(yàn)生物試材培養(yǎng)第生物通過攝取含某個(gè)（些）物質(zhì)的食物，導(dǎo)致其在體內(nèi)的濃度高于在食物中的濃度。生物放5試驗(yàn)期間每間隔一定時(shí)間（如24h）更換一次藥液的染毒生物富集系數(shù)bioconcentrationFactor,BCF穩(wěn)態(tài)生物富集系數(shù)steady-statebioconcen動(dòng)力學(xué)生物富集系數(shù)kineticbioconcentrationfactor，BCFK生物放大系數(shù)biomagnificationfactor，BMF4.1水體暴露法吸收階段結(jié)束后，將受試魚從試驗(yàn)藥液轉(zhuǎn)移至不含被試物的水體中。定期取樣，分別檢測(cè)水體中和魚體（或其特定組織）內(nèi)的被試物濃度，計(jì)算生物富集系數(shù)（BCF）及其置信區(qū)間，如可能，分別計(jì)算穩(wěn)態(tài)生物富集系數(shù)（BCFSS）和動(dòng)力學(xué)生物富集系數(shù)（BCFK），并視需要根據(jù)魚的體重6或器官（如肌肉、內(nèi)臟）分別計(jì)算BCF。4.2攝食暴露法清除階段飼喂空白餌料。試驗(yàn)期間定期取樣，檢測(cè)魚體內(nèi)（或其特定組織中）的被試物濃度?；隰~體內(nèi)總濃度計(jì)算清除速率常數(shù)（k2）、清除半衰期（t1/2）、同化效率(α),求出動(dòng)力學(xué)生物如可能，計(jì)算穩(wěn)態(tài)生物放大系數(shù)（BMFSS）。必要時(shí)，針對(duì)魚的可食用部分和不可食用部分以及特定的組織或器官（如肌肉、內(nèi)臟）分別計(jì)算BMF。適用于不同種類供試魚的水溫條件參見附錄A。馴養(yǎng)期間和試驗(yàn)期間水6.1.1供試魚種類及其體長見附錄A。斑馬魚的培養(yǎng)按NY/T4195.3的要求馴養(yǎng)至少2周。馴養(yǎng)期馴養(yǎng)條件（水、飼料和環(huán)境條件）應(yīng)與試且試驗(yàn)前2周內(nèi)未經(jīng)過任何藥物治療。不應(yīng)使用產(chǎn)卵期或剛剛7（地表水或地下水），確保飼養(yǎng)期、馴養(yǎng)期以及試驗(yàn)期間（對(duì)照組）魚的存活、生長和繁殖不受影響，且無其他任何異常外觀或行為。必要時(shí)，可對(duì)試驗(yàn)用水進(jìn)行過濾階段可根據(jù)受試魚的生長情況選擇不同粒徑7.10離心機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀及燒瓶等7.11氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用用軟塑料管，并應(yīng)避免使用可能溶解、吸附或滲出對(duì)魚類產(chǎn)生不利影響的材料。容器的尺寸應(yīng)滿8被試物為農(nóng)藥原（母）藥、純品或其放射性同位素標(biāo)記物等。試驗(yàn)前應(yīng)收集被試物的基本信d)被試物在水中的穩(wěn)定性或土壤吸附系數(shù)（Koc）等；）；h)代謝物信息：結(jié)構(gòu)、logKow、轉(zhuǎn)化率和穩(wěn)定性；j)被試物及其代謝物（如有）在魚體組織、水或餌料中的濃度檢測(cè)方法；k)魚類尤其是受試魚的毒性試驗(yàn)結(jié)果，例如96h-LC50和慢性NOEC等。9.1水體暴露法9.1.1暴露方式9.1.2預(yù)試驗(yàn)通過預(yù)試驗(yàn)確定是否需要開展正式試驗(yàn)，以及正式試驗(yàn)的試驗(yàn)濃度、暴露階段和清除階段的9.1.3正式試驗(yàn)9b)溶解度極限：試驗(yàn)濃度確需接近溶解度極限的，應(yīng)至少設(shè)置2個(gè)處理組，涵蓋實(shí)際環(huán)境濃c)設(shè)置2個(gè)處理組時(shí)，高、低濃度宜相差10倍，但受限于毒性水平和檢測(cè)方法定量限時(shí)也可9.1.3.2.1宜將被試物直接加入水中混合或攪拌均勻制備藥液，也可采用以下方b)用丙酮、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺和三甘醇等有機(jī)和聚氧乙烯40氫化蓖麻油（HCO-40）等分散劑助溶。所用助劑應(yīng)對(duì)且其添加量應(yīng)≤100mg/L或0.1mL/L，處理組和導(dǎo)致的有機(jī)碳濃度，且有機(jī)溶劑或乳化劑導(dǎo)致的TOC濃度應(yīng)≤10mg/L(±20%）。向每個(gè)處理組和對(duì)照組（即每容器）中隨機(jī)投放一定數(shù)量的受試魚，投放數(shù)量度檢測(cè)的需要，每次取樣可取至少4尾魚。承載b)魚體吸收被試物較為緩慢的，連續(xù)采樣的間隔時(shí)間宜調(diào)整為79.1.3.4.3根據(jù)受試魚種類和飼料熱量每天定時(shí)定量飼喂1次~2次，如虹鱒每日飼喂量約為體重的試魚能盡快吃完為宜。每次喂食30min~60min后，吸收階段結(jié)束后，將受試魚轉(zhuǎn)移至不含被試物的清潔水中。清除階段應(yīng)持續(xù)到魚體內(nèi)的被試型的，清除階段的時(shí)長設(shè)置需綜合考慮藥代動(dòng)力學(xué)等情況。對(duì)于在魚體內(nèi)清除較為緩慢、清除達(dá)定期檢測(cè)水體中的被試物濃度，定期抽樣檢測(cè)受試魚樣本的體長、體重、脂肪含量，及其體31270.12進(jìn)行，脂肪含量的測(cè)定宜樣品，宜采樣后立即檢測(cè)，否則應(yīng)開展相應(yīng)保存條件（冷凍或冷藏）下的穩(wěn)定性試驗(yàn)，確保儲(chǔ)存被試物，除非有充分理由或合理性驗(yàn)證數(shù)據(jù)，樣品前處理不應(yīng)采取離心或疏水性被試物，樣品前處理宜采用固相微萃對(duì)每次采集的魚活體樣本立即實(shí)施安樂死，用水沖洗整尾魚并吸干后，稱重、測(cè)量全長。選擇合理的前處理方法，盡可能減少污染和損失。如可能，在進(jìn)行濃度檢測(cè)前分離樣品中的脂肪，分別檢測(cè)脂肪含量和被試物含量。無法分離且無法直接檢測(cè)樣品中的脂肪含量時(shí)，應(yīng)額外采集活體樣本。根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康?，可選用體型較大的受試魚種類，對(duì)魚體的可食用部分（魚肉）和不可食用部分（內(nèi)臟）分別進(jìn)行檢測(cè)，或檢測(cè)魚體的特定組織或器官(如肝臟分析方法的準(zhǔn)確度、精密度和再現(xiàn)性，以及水樣、魚樣的回收率應(yīng)滿足濃度檢測(cè)需要。試驗(yàn)開始前檢測(cè)試驗(yàn)用水中的被試物本底值。必要時(shí)，采用對(duì)照組樣品的背景值對(duì)處理組魚樣和水樣如使用放射性標(biāo)記被試物，檢測(cè)水和魚體組織中母體濃度的同時(shí)宜對(duì)主要代謝物進(jìn)定量分析（尤其是母體在整魚中的BCF≥500時(shí)）。僅關(guān)注母體b)在兩個(gè)連續(xù)的采樣時(shí)間點(diǎn)≥5%；應(yīng)關(guān)注被試物的生物富集性是否存在濃度依賴性，并進(jìn)行詳細(xì)9.2攝食暴露法基于農(nóng)藥登記目的而開展的生物富集（蓄積）性試驗(yàn)，應(yīng)首選水體暴露法獲得BCF可采用放射性同位素標(biāo)記的被試物進(jìn)行試驗(yàn)。當(dāng)被試物的水溶解度極低、吸附性極強(qiáng)無法開展水度仍難以達(dá)到一定的富集水平）時(shí)，可選用攝食暴露法進(jìn)行試驗(yàn)，但應(yīng)考慮試驗(yàn)結(jié)果是否能滿足成染毒餌料?？瞻尊D料配制方式與染毒餌料應(yīng)完全相同，僅不含mL)玉米油或魚油中，溶解后轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀燒瓶中，用少量玉米油或魚油潤洗，確保所有被試物均被轉(zhuǎn)移至燒瓶后，塞緊瓶塞，用微型攪拌器快速攪拌過夜。加入適量餌料，繼續(xù)攪拌至少30min（以攪拌過夜為宜）混合均勻。在混拌均勻的前提下，應(yīng)盡可能使用油脂含量低的餌料和拌幾次，待有機(jī)溶劑完全揮發(fā)后備用；也可在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀燒瓶中混合旋轉(zhuǎn)，并適當(dāng)通氣或氮吹，但應(yīng)避免溶劑蒸發(fā)過程中被試物出現(xiàn)結(jié)晶。對(duì)于疏水性被試物，必要時(shí)可在染毒餌料顆粒上裹上9.2.2.5染毒餌料和空白餌料應(yīng)在被試物能保持穩(wěn)定的條件下儲(chǔ)存（必要時(shí)，通過預(yù)試驗(yàn)確定正式試驗(yàn)的試驗(yàn)條件，如餌料與魚體中被試物的提取回收染毒濃度、餌料適口性、餌料中被試物的穩(wěn)定性、飼喂量、試驗(yàn)所需受試魚的數(shù)量、吸收階段和9.2.4正式試驗(yàn)在魚類食物中可能的濃度水平）、染毒餌料適口性等進(jìn)行設(shè)置，在不產(chǎn)生毒性的前提下，使被試9.2.4.1.2處理組和對(duì)照組隨機(jī)加入一定數(shù)量的受試魚，在相同條件下培養(yǎng)。根據(jù)濃度檢測(cè)和脂質(zhì)b)14d未能達(dá)到穩(wěn)態(tài)時(shí)，可采用動(dòng)力學(xué)方法計(jì)算BMFK或延長吸收階段；9.2.4.1.4清除階段為28d，處理組與對(duì)照組均飼喂空白餌料。以下特殊情形可進(jìn)行適b)生物蓄積性極強(qiáng)的被試物，清除階段可相應(yīng)延長；段時(shí)間不夠長、餌料適口性差受試魚不取食、分析方法靈敏度差等情況時(shí)，可結(jié)束試驗(yàn)，同時(shí)可根據(jù)受試魚種類和餌料熱量每天定時(shí)（清晨）、定量投喂，如虹鱒每日投喂量約為體重的1%~2%，避免其生長過快或脂肪含量過高。根），飼喂時(shí)間宜都在上午。喂食30min~定期檢測(cè)水體中的被試物濃度，定期抽樣檢測(cè)受試魚樣本的體長、體重、脂肪含量、體內(nèi)或特定魚體組織中的被試物濃度，以及餌料中的被試物濃度與脂肪含量，采集與測(cè)定要求見附錄對(duì)于水樣、魚體或其特定組織、餌料中被試物濃度檢測(cè)，其分析方法驗(yàn)證及主要代謝物的檢線達(dá)到平臺(tái)（即與時(shí)間軸接近平行）時(shí)的BCFsBCFSS——穩(wěn)態(tài)BCF，單位為L/kg；Cfss(mean)——達(dá)到穩(wěn)態(tài)時(shí)魚體內(nèi)的被試物濃度平均值，單位為mg/kg；Cwss(mean)——達(dá)到穩(wěn)態(tài)時(shí)水體中的被試物濃度平均值，單位為mg/L按公式（2）計(jì)算動(dòng)力學(xué)BCFK。BCFK——?jiǎng)恿W(xué)BCF，單位為L/kg；k1——吸收階段被試物被魚體吸收的一級(jí)動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)，單位為d-1；k2——清除階段被試物從魚體內(nèi)清除的一級(jí)動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)，單位為d-1。10.1.3對(duì)動(dòng)力學(xué)BCFKg進(jìn)行生長因子校正按公式（3）對(duì)k2進(jìn)行生長因子校正，按公式（4）計(jì)算BCFKg。kzg=kz-kg （3） （4）k2g——經(jīng)生長因子校正的清除速率常數(shù)，單位為d-1；BCFKg——經(jīng)生長因子校正的動(dòng)力學(xué)動(dòng)力學(xué)BCFK，單位為L/kg。得到BCFL。BCFL——經(jīng)脂肪含量校正的BCF，單位為L/kg；Ln——受試魚體內(nèi)脂肪含量，單位為%；0.05——魚類體內(nèi)脂肪含量默認(rèn)值，單被試物在魚體內(nèi)的清除符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型時(shí)，按公式（6）或其對(duì)數(shù)形式（7）計(jì)算清除速率常數(shù)，按公式（8）計(jì)算清除半衰期。 （6）lnct=lncp-k2xt lnct=lnc,-kzxtC0——清除階段魚體內(nèi)被試物的初始實(shí)測(cè)濃度，單位為mg/kg；t——清除時(shí)間，單位為d；coa=e C0,d——清除階段外推的魚體初始濃度，由清除階段實(shí)測(cè)濃度的自然對(duì)數(shù)與時(shí)間擬合的一級(jí)按公式（11）計(jì)算BMF。按公式（12）計(jì)算經(jīng)生長因子校正的生物放大系數(shù)BMFg。BMFg——經(jīng)生長因子校正的生物放大系數(shù)。按式（13）計(jì)算經(jīng)脂肪含量校正的生物放大系數(shù)BMFL。Lc——脂肪含量校正因子，Lc=L魚體/L餌料；L魚體——魚體脂肪平均含量，單位為%；L餌料——餌料脂肪平均含量，單位為%。當(dāng)基于試驗(yàn)數(shù)據(jù)可估算出吸收階段達(dá)到穩(wěn)態(tài)進(jìn)行脂肪含量校正，得到BMFSSL。a)水體中溶解氧含量≥試驗(yàn)溫度下空氣飽和值的60%；b)受試魚生長正常，死亡率或其他異常癥狀與疾病比例均≤）；c)處理組和對(duì)照組的生長速率常數(shù)或生長曲線無顯著差），g)攝食暴露法中，吸收階段開始時(shí)染毒餌料進(jìn)行的均一性檢測(cè)表明度、溶解性等信息；雜質(zhì)的化學(xué)特性；樣品批號(hào)、外觀、重量、生產(chǎn)日期、有效日期、來樣3）如進(jìn)行放射性標(biāo)記，描述標(biāo)記原子的精確位置以及放射化5）儲(chǔ)存條件及其穩(wěn)定性，以及攝食暴露試驗(yàn)中所需的在餌料）；數(shù)量、試驗(yàn)濃度設(shè)置、吸收階段和清除階段時(shí)長、魚和水樣品采6)試驗(yàn)容器內(nèi)水質(zhì)測(cè)定方法與結(jié)果，如pH，硬度，TOC含量，水溫和——餌料類型（營養(yǎng)成分、規(guī)格或質(zhì)量、生產(chǎn)廠家）、餌料飼喂量與飼喂頻率（包括）；），和標(biāo)準(zhǔn)差以及外推的生長速率常數(shù)；6）列表給出水、魚或餌料中被試物的設(shè)定濃度和實(shí)測(cè)濃度（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差7）列表給出所有采樣時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組和處理組水體中的被試物實(shí)測(cè)濃度（Cw，mg/L，含背——吸收和清除曲線：同時(shí)顯示數(shù)據(jù)值和擬合模型；攝食暴露試驗(yàn)中，僅清除曲線；——清除階段經(jīng)自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后的濃度（ln濃度）隨時(shí)間變化的曲線（包括吸收速率k2攝食法試驗(yàn)中還包括外推得到的魚體濃度C0,d；11）水體暴露試驗(yàn)中，BCFSS或BCFKBMFk、BMFKg、BMFKLg等；），——放射性標(biāo)記試驗(yàn)中的代謝物及其富集性——任何對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的后續(xù)研究計(jì)劃或建議；——相關(guān)原始數(shù)據(jù)和計(jì)算數(shù)據(jù)匯總表格，包括：水體暴露試驗(yàn)中的kg、k1、k2、kCfood、C0,m、C0,d、Ig、α、BMFSS-L、t1/2g及其標(biāo)準(zhǔn)偏差，以及I、LC、BMFKLg等。供試魚種及其體長、水溫條件見表A.1。如選用其它魚類作為供試生物，斑馬魚（Daniorerio）胖頭鱥（Pimephalespromelas）鋁砷鉻鈷銅鐵鉛鎳鋅鎘汞銀采用攝食暴露法開展試驗(yàn)時(shí)魚類飼料的主要營養(yǎng)成分——試驗(yàn)藥液自動(dòng)連續(xù)地流入試驗(yàn)容器——試驗(yàn)期間受試魚死亡率≤10%——試驗(yàn)期間每隔一段時(shí)間更換藥液——試驗(yàn)藥液濃度變化在±20%之內(nèi)——試驗(yàn)期