GB-T 39914-2021 主要農作物品種真實性和純度SSR分子標記檢測 玉米

主要農作物品種真實性和純度SSR分子標記檢測玉米國家市場監(jiān)督管理總局國家標準化管理委員會I Ⅲ 12規(guī)范性引用文件 1 1 13.2縮略語 2 2 2 2 35.3檢測平臺 3 35.5檢測條件 46儀器設備、試劑和溶液配制 46.1儀器設備 4 56.3溶液配制 5 57.1引物合成 5 8 8 97.5數(shù)據(jù)分析 8品種純度檢測程序 8.2引物篩選和合成 8.4擴增產物分離 8.5數(shù)據(jù)分析 9結果計算與表示 9.1真實性鑒定 9.2純度測定 10結果報告 ⅡGB/T39914—2021 附錄A(規(guī)范性附錄)溶液配制 附錄B(資料性附錄)等位基因擴增片段信息 表1真實性鑒定引物 表2PCR擴增反應體系 表3純度測定候選引物 表B.1已知品種主要等位基因擴增片段信息 Ⅲ1GB/T3543.1農作物種子檢驗規(guī)程總則GB/T3543.2農作物種子檢驗規(guī)程扦樣GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格品種真實性驗證varietyve2一條互補結合在模板DNA鏈上的短單鏈，能提供3'-OH末端作為DNA合成的起始點，延伸合能夠組合在一起電泳的，具有不同顏色或相同顏色而擴增產物片段大小不同的熒光標記的一組CTAB:cetyltrimethylammoniumbrodNTPs:deoxyribonucleSDS:sodiumdodecylsu玉米的不同品種，其基因組存在著能夠世代穩(wěn)定遺傳的簡單序列重復(SSR)345編號引物名稱引物序列(5′—3)熒光6編號引物名稱染色體引物序列(5'—3)熒光反向：GGAACTGAAGAACAGAA反向：GGCCATGATACAGCAAG反向：GTTTCCTATGGTACAG7表1(續(xù))編號引物名稱染色體引物序列(5′—3)熒光正向：TGATAGGTAGTTAGCA反向：GAGCATAGAAAAAGTTGAGGT正向：CACTCTCCCTCTAAAA反向：CTGTGCTCGTGCTTCT反向：TGCACAGAATAAACATAGG反向：CTTCGTACCATCTTCCC8原濃度10×緩沖液29表2(續(xù))原濃度2Taq酶引物2#每一種類的濃度。7.4.2.3.1在電泳正極槽(下槽)加入1×TBE緩沖液600mL,負極槽(上槽)加入經65℃預熱的1×TBE緩沖液600mL,拔出樣品梳，7.4.2.3.2電泳的適宜時間，參考二甲苯青指示帶移動的位置和擴增產物預期片段大小范圍(參見表B.1)加以確定。二甲苯青指示帶在4.5%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，所移動的位置與150bp擴增入顯影液中，輕輕晃動待條帶清晰后取出，再迅速放入固定液中定影5min取出，在雙蒸水中漂洗a)對于連帶(pull-up)峰，即因某一位置某一顏色熒光的峰值較高而引起同一位置其他顏色熒光7.5.1.4采用混合樣檢測，選擇少量的對照),校準不同電泳板間的數(shù)據(jù)偏差后再讀取擴增片段大小。甄別后純合位點數(shù)據(jù)記錄為X/X,雜合位點數(shù)據(jù)記錄為X/Y(其中X、Y分別為該位點兩個等位基因擴增片a)讀取擴增產物片段大小數(shù)據(jù)的，檢測樣品與參照樣品(附錄B)同時在同一電泳板上電泳；8.1DNA提取8.2引物篩選和合成——對于鑒定自交個體，識別特征為該等位基因具有母本而父本缺失，篩選1對能檢測雜合位點——對于鑒定異交個體，識別特征為該等位基因具有母本而父本錯誤，在具備父母本對照或其8.2.2本標準推薦了8對品種純度測定引物(見表3),作為優(yōu)先篩選的候選引物。篩選時，可用至少含20粒的小樣品進行試驗，依據(jù)5.2.2的要求，確定適宜的引物或引物組合。效果的，可選擇表1另外32對引物或其他引物進行篩選。編號引物名稱染色體引物序列(5′—3)范圍/bp雜合度反向：GGAACTGAAGAACAGAA檢測結果用檢測樣品和標準樣品比較的位點差異數(shù)目表示，檢測結果的容許差距不能大于2個等b)通過對引物，采用通過對引物，采用電泳方法進行檢測，經與DNA指紋數(shù)據(jù)比對平臺篩查并鑒定，檢測樣品屬于XXX品種，或者屬于XXX、XXXX其中的一個。10.1.4屬于下列情形之一的，需在檢驗報告中注明：-—送驗樣品低于5.4.1.1規(guī)定數(shù)量的； 與DNA指紋數(shù)據(jù)比對平臺進行數(shù)據(jù)比對的：——檢測樣品遺傳不穩(wěn)定嚴重的位點(引物編號)清單；——檢測采用了其他SSR引物的名稱及序列。10.2.1按照GB/T3543.1的檢驗報告要求，可以選擇下列方式之一進行品種純度檢測結果的填報：a)通過編號為的引物，檢測了個個體，采用電泳方法，檢測出自交個b)通過編號為的引物，檢測了個個體，采用電泳方法，檢測出自交個體和其他類型雜株個體個，品種純度為%。10.2.2屬于下列情形之一的，需在檢驗報告中注明：——送驗樣品低于5.4.2.1規(guī)定數(shù)量的；——異常個體僅檢測自交個體的；——檢測樣品因遺傳不穩(wěn)定嚴重的位點(引物編號)清單；—-—檢測采用了其他SSR引物的名稱及序列。Na?EDTA·2H?O186.1g溶于800mL水中，加固體NaOH調pH至8.0,加水定容至1000mL,濃鹽酸(36%～38%)25mL,加水定容至500mL。A.1.4CTAB提取液至1000mL,4℃貯存。A.1.7TE緩沖液1A.1.8TE緩沖液2用TE緩沖液1分別配制正向引物、反向引物終濃度均為40μmol/L的儲存液，等體積混合成A.3.140%PAGE膠尿素450g、10×TBE緩沖液100mL和40%PAGE膠112.5mL,加水定容至1000mL。2%二甲基二氯硅烷。0.25g過硫酸銨溶于1mL超純水中。10×TBE緩沖液500mL,加水定容至5000mL。50×TAE緩沖液100mL,加水定容至5000mL。A.4銀染硝酸銀2g,加水定容至1000mL。固體NaOH30g和甲醛5mL,表B.1列出了40對引物在已知玉米品種中擴增的片段長度范圍、主要等位基因擴增片段大小與頻引物參照樣品綿單1號鄭單958農華101遼單527先玉335鄭單958蠡玉16綿單1號京玉7號鄭單958引物參照樣品正大619鄭單958先玉335鄭單958蠡玉16屯玉27正大619奧玉28正大619中科4號鄭單958先玉335鄭單958奧玉28京科968引物參照樣品鄭單958中科4號農華101綿單1號萬糯1號先玉335鄭單958萬糯1號鄭單958奧玉28正大619鄭單958鄭單958正大619正大619蠡玉16蠡玉16鄭單958鄭單958農華101蠡玉6號農華101引物參照樣品萬糯1號鄭單958鄭單958中科4號京科甜126先玉335中科4號鄭單958鄭單958正大619綿單1號農華101先玉335中科10農華101鄭單958遼單527先玉335引物參照樣品鄭單958資玉3號先玉335鄭單958正大619農華101鄭單958中科4號先玉335鄭單958先玉335鄭單958引物參照樣品先玉335鄭單958鄭單958鄭單958正大619鄭單958鄭單958中科4號先玉335鄭單958農華101鄭單958先玉335鄭單958正大619農華101農華101農華101鄭單958鄭單958奧玉28表B.1(續(xù))引物參照樣品先玉335先玉335先玉335先玉335中科4號鄭單958鄭單958中科10蠡玉6號先玉335蠡玉16農華101先玉335先玉335鄭單958鄭單958引物參照樣品鄭單958鄭單958先玉335正大619農華101遼單527農華101先玉335先玉335遼單527鄭單958先玉335中科4號先玉335鄭青貯1號鄭單958鄭單958農華101中科4號中科4號引物參照樣品先玉335鄭單958鄭單958先玉335鄭單958鄭單95