浙大生物化學(xué)課件15：DNA的生物合成

生物化學(xué)浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院江輝第十五章DNA的生物合成第一節(jié)半保留復(fù)制第二節(jié)DNA復(fù)制的酶學(xué)第三節(jié)DNA生物合成過(guò)程第四節(jié)DNA的損傷修復(fù)第五節(jié)逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象和逆轉(zhuǎn)錄酶有關(guān)DNA的兩個(gè)問(wèn)題為什么大腸桿菌20分鐘就可以繁殖一代，而生長(zhǎng)最快的動(dòng)物小母家鼠生長(zhǎng)40天才成熟？為什么可通過(guò)DNA測(cè)序進(jìn)行親子鑒定？中心法則基因：是為生物活性產(chǎn)物編碼的DNA功能片段，這些產(chǎn)物主要是蛋白質(zhì)或是各種RNA。DNA的生物合成（復(fù)制）復(fù)制的要點(diǎn)半保留復(fù)制有起始點(diǎn)、終止點(diǎn)和方向

半不連續(xù)復(fù)制第一節(jié)半保留復(fù)制當(dāng)細(xì)胞分裂，DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而成為單鏈，用于合成新的互補(bǔ)鏈。子代細(xì)胞出現(xiàn)新的DNA雙鏈，其中一股單鏈?zhǔn)菑挠H代完整地接受過(guò)來(lái)的舊鏈；另一股單鏈?zhǔn)峭耆匦潞铣傻男骆?，且按堿基配對(duì)原則與舊鏈互補(bǔ)。1、Watson和Crick的半保留復(fù)制模型DNA雙螺旋的兩條鏈堿基通過(guò)A-T、G-C之間的氫鍵聯(lián)結(jié)，并且兩條鏈互補(bǔ)。因此，Watson和Crick提出DNA的半保留復(fù)制模型。雙螺旋揭開，每條鏈作為模板，以四種脫氧核苷三磷酸（dNTP）為底物，在依賴于DNA的DNA聚合酶催化下，按照A-T、G-C配對(duì)方式，合成與兩條模板鏈脫氧核苷酸對(duì)應(yīng)的兩條新鏈，然后以一新一舊脫氧多核苷酸組成的雙鏈分別進(jìn)入子細(xì)胞。2、模型的試驗(yàn)證明1958年Meselson和Stahl用密度梯度離心法結(jié)合同位素標(biāo)記法進(jìn)行證明試驗(yàn)：1）將大腸桿菌在含標(biāo)記的15NH4Cl的培養(yǎng)基內(nèi)，繁殖12代，保證DNA上的N都是15N；2）將上述培養(yǎng)好的細(xì)菌轉(zhuǎn)入到含14NH4Cl的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，并在細(xì)菌剛轉(zhuǎn)入14NH4Cl中（0代）以及在此培養(yǎng)基中分裂1、2、3、4代時(shí)分別取樣分析；3）DNA用密度梯度平衡離心法進(jìn)行高速長(zhǎng)時(shí)間離心，由于15N-DNA的比重大于14N-DNA，在氯化銫溶液中離心時(shí)分別處在不同密度的層次中（重在下，輕在上）。DNA半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)證據(jù)0代：兩條單鏈全為重的（處于下層）；1代：全部為一輕一重的雜合分子（處于上層和下層之間）；2代：一種是15N-14N，與第1代的一樣；另一種是全部輕的14N-14N。兩者比為1∶1；3代：仍有兩種分子，但14N-14N增多，兩者比為1∶3；4代：兩者比為1∶7。3、半保留復(fù)制意義DNA在代謝上的穩(wěn)定保證了遺傳信息的穩(wěn)定性。

第二節(jié)DNA復(fù)制的酶學(xué)底物：dNTP（dATP，dGTP，dCTP，dTTP）聚合酶：DNA依賴的DNA聚合酶（DNA-polymerase）模板：?jiǎn)捂湹腄NA母鏈引物：寡核苷酸引物（RNA）其他酶和蛋白質(zhì)因子：拓?fù)洚悩?gòu)酶、解螺旋酶、單鏈結(jié)合蛋白、DNA連接酶DNA聚合酶的活性5′至3′的聚合活性5′→3′方向核酸外切酶活性5′→3′外切酶活性3′→5′外切酶活性一、復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)5′至3′的聚合活性（5′→3′）核酸外切酶活性3′→5′外切酶活性5′→3′外切酶活性聚合反應(yīng)在DNA聚合酶催化下，四種脫氧核糖核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）被加到DNA鏈的3′末端，同時(shí)釋放出無(wú)機(jī)焦磷酸。1、DNA鏈的游離3′-羥基對(duì)進(jìn)入的dNTP磷原子發(fā)生親核攻擊，形成3′,5′-磷酸二酯鍵，并脫下焦磷酸。2、形成磷酸二酯鍵的能量來(lái)自α-與β-磷酸基之間高能鍵的裂解。3、聚合反應(yīng)可逆，但隨焦磷酸的水解可推動(dòng)反應(yīng)的完成。4、DNA鏈由5′向3′方向延長(zhǎng)。5、需要有游離的3′-羥基，即需要引物鏈。DNA聚合反應(yīng)特點(diǎn)DNA聚合酶模板鏈合成的新鏈模板鏈二、DNA聚合酶1、原核生物：DNA聚合酶I（polI）：與校對(duì)、修復(fù)有關(guān)A、DNA聚合酶活力：通過(guò)核苷酸聚合反應(yīng)使DNA鏈沿5′→3′方向延長(zhǎng)；B、3′→5′核酸外切酶活力：由3′端水解DNA鏈。在正常情況下該活力受抑制，一旦出現(xiàn)錯(cuò)配堿基時(shí)，聚合反應(yīng)停止，該活力會(huì)切去錯(cuò)配堿基，起校對(duì)作用；C、5′→3′核酸外切酶活力：由5′端水解DNA鏈。切除嘧啶二聚體和RNA引物。polI切除岡崎片段5′端RNA引物5′→3′核酸外切酶活力DNA聚合酶活力polI的結(jié)構(gòu)單鏈多肽，用枯草桿菌蛋白酶進(jìn)行有限水解，可得兩個(gè)大小不同的片段。小片段：5′→3′核酸外切酶活性；

大片段（Klenow片段）：聚合活性、3′→5′外切活性（常用工具酶）DNA聚合酶II（polII）：可能在DNA修復(fù)中起作用以帶有缺口的雙鏈DNA為模板和引物，從5′→3′方向合成DNA，同時(shí)具有3′→5′外切酶活力。多亞基聚合酶含有DNA聚合酶活性和3′→5′核酸外切酶活性不具有5′→3′核酸外切酶活性反應(yīng)需要NH4+

激活是一種主要起修復(fù)作用的酶。DNA聚合酶III（polIII）：真正起復(fù)制作用的酶由10種亞基組成的不對(duì)稱二聚體，α、ε、θ組成核心酶?；钚裕壕酆匣钚?、3′→5′外切活性。α+ε+θ→polIII（核心酶）polIII+τ→polIII′polIII′+γ+δ→polIII*（全酶）α具有聚合酶活力，ε具有校對(duì)功能，θ是組建核心酶因子，τ是二聚化因子，γ和δ是延長(zhǎng)因子，β識(shí)別引物并引導(dǎo)聚合酶結(jié)合，復(fù)制起始時(shí)被釋放。polIII只作用于有缺口的雙鏈DNA，polIII′可作用于有引物的長(zhǎng)單鏈DNA，polIII*是天然的聚合酶。polIII的結(jié)構(gòu)催化亞基3′5′核酸外切酶活性polIII-DNA結(jié)合示意圖大腸桿菌三種DNA聚合酶的比較DNA聚合酶IDNA聚合酶IIDNA聚合酶III結(jié)構(gòu)基因polApolBpolC,holE,dnaN,dnaX,dnaZ,dnaQ,holA亞基數(shù)目1≥7≥10分子量103,00088,000830,0005′→3′聚合作用+++3′→5′外切酶+++5′→3′外切酶+--聚合速度（核苷酸/min）1,0002,400≥15,000持續(xù)合成能力3~2001,500≥500,000功能切除引物，修復(fù)修復(fù)復(fù)制2、真核生物DNA聚合酶α：與隨從鏈的合成有關(guān)。需要以缺口雙鏈或帶引物的單鏈DNA為模板，引物是DNA或RNA短鏈，RNA引物由引物合成酶合成DNA聚合酶β：核酸外切酶活性，與修復(fù)有關(guān)DNA聚合酶γ：存在于線粒體。以RNA為模板，以DNA短鏈為引物DNA聚合酶δ：與領(lǐng)頭鏈的合成有關(guān)。具有3′→5′外切酶活力DNA聚合酶ε：與校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口有關(guān)3、復(fù)制的保真性核酸外切酶活性和即時(shí)校讀polI，polII，polIII的ε亞基的3′→5′外切酶活性復(fù)制的保真性和堿基選擇先形成氫鍵，再生成磷酸二酯鍵依賴三種機(jī)理遵守嚴(yán)格的堿基互補(bǔ)配對(duì)規(guī)律聚合酶在復(fù)制延長(zhǎng)中對(duì)堿基的選擇功能復(fù)制中出錯(cuò)時(shí)有即時(shí)校讀功能三、DNA拓?fù)鋵W(xué)變化中的酶1、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶類型I拓?fù)洚悩?gòu)酶：催化DNA雙鏈中的一條鏈的斷裂和再連接，反應(yīng)無(wú)需能量；類型II拓?fù)洚悩?gòu)酶：催化DNA雙鏈的斷裂和再連接，反應(yīng)需消耗ATP；原核生物中拓?fù)洚悩?gòu)酶只能消除負(fù)超螺旋，真核生物中能消除正、負(fù)超螺旋。2、解螺旋酶領(lǐng)頭鏈：rep蛋白沿模板鏈的3′→5′移動(dòng)隨從鏈：解螺旋酶Ⅱ、DnaB沿模板鏈的5′→3′移動(dòng)3、單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）維持模板處于單鏈狀態(tài)保護(hù)單鏈的完整四、引物酶和引發(fā)體引物酶：RNA聚合酶（DnaG）引發(fā)體：DnaA辨認(rèn)復(fù)制啟始點(diǎn)，再結(jié)合DnaB、DnaC及其他復(fù)制因子形成復(fù)合體、rep蛋白五、DNA連接酶（ligase）催化兩段DNA之間的連接NAD:煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NMN:煙酰胺單核苷酸聚合酶+AMP連接酶DNA連接酶催化雙鏈DNA切口處的5′-磷酸基和3′-羥基生成磷酸二酯鍵。1）形成酶-AMP復(fù)合物

NAD++連接酶→連接酶-AMP+NMN（細(xì)菌中）

ATP+連接酶→連接酶-AMP+PPi（動(dòng)物中）2）形成A-P-P-DNA

連接酶-AMP+5′-P-DNA→A-P-P-DNA+連接酶

形成了焦磷酸鍵3）生成3′,5′-磷酸二酯鍵

DNA-OH-3′+A-P-P-DNA→DNA-O-P-DNA+AMP

相鄰鏈3′-OH對(duì)活化的磷原子發(fā)生親核攻擊。第三節(jié)DNA生物合成過(guò)程一、復(fù)制的起始1、DNA解成單鏈：原核生物從一個(gè)固定的起始點(diǎn)開始，同時(shí)向兩個(gè)方向進(jìn)行的，稱為雙向復(fù)制——θ復(fù)制DNA復(fù)制叉的結(jié)構(gòu)示意圖真核細(xì)胞染色體比較復(fù)雜，可能有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，同時(shí)形成多個(gè)復(fù)制單位。復(fù)制叉：復(fù)制開始后由于DNA雙鏈解開，在兩股單鏈上進(jìn)行復(fù)制，形成在顯微鏡下可看到的叉狀結(jié)構(gòu)，稱為復(fù)制叉。E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriC跨度為245bp，包含有三組串聯(lián)重復(fù)序列和兩對(duì)反向重復(fù)序列。復(fù)制的起點(diǎn)單個(gè)固定的起點(diǎn)：原核生物的染色體和質(zhì)粒、真核生物的細(xì)胞器DNA都是環(huán)狀雙鏈分子，具有單個(gè)固定的起點(diǎn)；多個(gè)起點(diǎn)：真核生物染色體是線性雙鏈分子，含有許多起點(diǎn)多復(fù)制子。復(fù)制方向直線雙向式：?jiǎn)纹瘘c(diǎn)，雙方向，有對(duì)稱的和不對(duì)稱的；多起點(diǎn)雙向式：真核生物染色體DNA的復(fù)制；θ型雙、單向式：環(huán)狀DNA的復(fù)制。有雙向和單向（單向的形成一個(gè)復(fù)制叉，雙向的形成兩個(gè)復(fù)制叉），有對(duì)稱和不對(duì)稱（一個(gè)叉完成1/5，其余4/5由另一個(gè)叉完成）；D-環(huán)式：?jiǎn)蜗驈?fù)制。在固定點(diǎn)解開后一條鏈先復(fù)制，待復(fù)制到一定距離時(shí)，露出另一鏈的復(fù)制起點(diǎn)，才開始另一鏈的復(fù)制；滾動(dòng)環(huán)式：?jiǎn)蜗驈?fù)制。共價(jià)閉環(huán)雙鏈分子的正鏈由核酸內(nèi)切酶在一特定位點(diǎn)切開，游離出的5′-磷酸基末端固定在細(xì)胞膜上，然后以環(huán)狀負(fù)鏈為模板，從正鏈的3′-OH末端延長(zhǎng)形成正鏈。滾環(huán)復(fù)制低等生物如質(zhì)粒，復(fù)制時(shí)采用滾環(huán)復(fù)制。環(huán)狀DNA雙鏈一股先開一個(gè)缺口，5′端向外伸展。兩股鏈均直接作為模板，不需要另外合成引物。2、引發(fā)體的生成復(fù)制過(guò)程需要引物——短鏈RNA引物酶：合成RNA引物（十個(gè)nt左右），方向?yàn)?′→3′DnaA辨認(rèn)復(fù)制啟始點(diǎn)，然后引物酶進(jìn)入（DnaG蛋白），加上解螺旋酶、DnaB蛋白和DnaC蛋白等，與DNA的起始復(fù)制區(qū)域形成引發(fā)體。DNA聚合酶III：由其β亞基辨認(rèn)引物，新鏈的第一個(gè)脫氧核苷酸與引物的3′-OH形成磷酸二酯鍵，開始復(fù)制。拓?fù)洚悩?gòu)酶：松弛螺旋。復(fù)制過(guò)程中各酶和蛋白質(zhì)因子的作用二、復(fù)制的延長(zhǎng)原核生物為polIII真核生物為DNA聚合酶α和δ，其中α與隨從鏈的合成有關(guān)，δ與領(lǐng)頭鏈的合成有關(guān)1、復(fù)制延長(zhǎng)的生化過(guò)程原核生物復(fù)制延長(zhǎng)的速度很快真核生物復(fù)制有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)2、復(fù)制的半不連續(xù)性和岡崎片段領(lǐng)頭鏈?zhǔn)沁B續(xù)合成的，而隨從鏈則是不連續(xù)合成岡崎片段：岡崎用電子顯微鏡看到了DNA復(fù)制過(guò)程中出現(xiàn)一些不連續(xù)片段，這些不連續(xù)片段只存在于DNA復(fù)制叉上其中的一股。后來(lái)就把這些不連續(xù)的片段稱為岡崎片段。前導(dǎo)鏈的延伸DNA聚合酶單鏈結(jié)合蛋白解螺旋酶DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶三、復(fù)制的終止1、原核生物復(fù)制終止及不連續(xù)片段連接復(fù)制有終止點(diǎn)ter領(lǐng)頭鏈?zhǔn)遣婚g斷延長(zhǎng)的，隨從鏈?zhǔn)巧梢粋€(gè)個(gè)的岡崎片段，最后連接成一條完整的DNA鏈。polI5′→3′外切酶活性水解引物。polI聚合活性填補(bǔ)空隙。DNA連接酶連接缺口。滯后鏈RNA引物的切除:

DNA聚合酶Ⅰ的5′3′核酸外切酶活性滯后鏈的連接滯后鏈的連接：DNA連接酶DNA聚合酶Ⅰ2、真核生物的端粒和端粒酶端粒：是真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)

富含GC的重復(fù)序列人：(TTAGGG)n端粒酶：RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，既有模板，又有逆轉(zhuǎn)錄酶以自身的RNA為模板延長(zhǎng)DNA單鏈，然后反折為雙鏈，爬行模式。端粒酶與生物體的衰老、腫瘤的發(fā)生有關(guān)。真核DNA的復(fù)制過(guò)程特征真核生物染色體有核小體結(jié)構(gòu)；真核生物基因組龐大；真核細(xì)胞染色體比較復(fù)雜，可能有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，同時(shí)DNA上往往有多個(gè)復(fù)制子；真核生物有DNA聚合酶α和δ，其中α與滯后鏈的合成有關(guān)，δ與領(lǐng)頭鏈的合成有關(guān)；真核生物DNA的復(fù)制子在每個(gè)細(xì)胞周期僅起始復(fù)制一次。第四節(jié)DNA的損傷修復(fù)突變-----DNA分子上堿基的改變自發(fā)突變、人工誘變一、突變的意義突變是進(jìn)化、分化的分子基礎(chǔ)只有基因型改變的突變致死性的突變突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)二、引發(fā)突變的因素誘變因素

突變類型物理因素

紫外線照射形成胸腺嘧啶二聚體

離子輻射打斷DNA分子上的共價(jià)鍵化學(xué)因素5-溴尿嘧啶5-溴尿嘧啶（5-BU）取代A，并異構(gòu)成G，結(jié)果A-T配對(duì)變?yōu)镚-T配對(duì)，最后變?yōu)镚-C配對(duì)

羥胺轉(zhuǎn)換T為C，結(jié)果A-T配對(duì)變?yōu)镃-G配對(duì)

亞硝酸鹽使C脫氨成U，原G-C配對(duì)變?yōu)镚-U配對(duì)，最后變?yōu)锳-T配對(duì)

氮芥類

使G的N-7烷化后除去，成為無(wú)鳥嘌呤的鏈生物因素

腫瘤病毒插入宿主細(xì)胞基因組中，引起細(xì)胞癌變?nèi)⑼蛔兎肿痈淖兊念愋湾e(cuò)配（點(diǎn)突變）

一個(gè)堿基改變?nèi)笔?、插入和框移突?/p>

片段插入或缺失重排

較大片段重組或重排DNA損傷的化學(xué)及物理因素幾種化學(xué)誘變劑結(jié)構(gòu)圖四、損傷的修復(fù)損傷--復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的DNA突變光修復(fù)切除修復(fù)重組修復(fù)SOS修復(fù)1、光修復(fù)紫外光照射可使相鄰的兩個(gè)T形成二聚體（T^T）光修復(fù)酶可使二聚體解聚為單體狀態(tài)，DNA完全恢復(fù)正常。光修復(fù)酶的激活需300-600nm波長(zhǎng)的光。（T^T）2、切除修復(fù)參與的酶有核酸內(nèi)切酶，polI，DNA連接酶核酸內(nèi)切酶識(shí)別損傷部位→切開核酸單鏈→外切酶切除損傷部位→聚合酶修復(fù)→連接酶連接3、重組修復(fù)重組蛋白R(shí)ecA，polⅠ，連接酶參與。聚合酶在損傷部位跳過(guò)去，在下一個(gè)岡崎片段的起始位置或前導(dǎo)鏈的相應(yīng)位置上重新合成引物和DNA鏈，新鏈在損傷相對(duì)應(yīng)處留下缺口。然后完整的母鏈上相對(duì)應(yīng)于損傷部位的正確核苷酸序列片段移到有缺口的新鏈上，而母鏈上的空缺則通過(guò)聚合來(lái)補(bǔ)上。損傷鏈的損傷并未除去，但在后代中已被稀釋。4、錯(cuò)配修復(fù)甲基化指導(dǎo)的錯(cuò)配修復(fù)：修復(fù)在復(fù)制過(guò)程中錯(cuò)配且沒(méi)有被校正的單個(gè)