動(dòng)物繁殖學(xué)：干細(xì)胞、克隆與轉(zhuǎn)基因技術(shù)

第一講胚胎移植技術(shù)（一）第二講胚胎移植技術(shù)（二）第三講胚胎體外生產(chǎn)、性控與保存技術(shù)第四講干細(xì)胞、克隆與轉(zhuǎn)基因技術(shù)第十單元配子與胚胎生物工程技術(shù)第四講干細(xì)胞、克隆與轉(zhuǎn)基因技術(shù)干細(xì)胞概念及分類(lèi)胚胎干細(xì)胞的特性胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用胚胎干細(xì)胞技術(shù)存在的主要問(wèn)題誘導(dǎo)多能干細(xì)胞動(dòng)物胚胎干細(xì)胞技術(shù)一、干細(xì)胞（Stemcell）的概念及分類(lèi)具有不斷增殖和分化的能力，在一定條件下可形成不同的細(xì)胞、組織、器官和系統(tǒng)。

根據(jù)細(xì)胞來(lái)源分類(lèi)：胚胎---胚胎干細(xì)胞ESC（EmbryonicStemCell）成體---成體組織來(lái)源的干細(xì)胞ASC（Adult-derivedStemCell）根據(jù)發(fā)育潛能分類(lèi)：當(dāng)受精卵分裂發(fā)育成囊胚時(shí)，內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞即為胚胎干細(xì)胞。是一種高度未分化細(xì)胞,具有發(fā)育的全能性，能分化出成體動(dòng)物的所有組織和器官，包括生殖細(xì)胞。全能干細(xì)胞：

具有形成完整個(gè)體的分化潛能。如受精卵，胚胎干細(xì)胞。多能干細(xì)胞：

具有分化出多種組織細(xì)胞的潛能，但不能發(fā)育成完整個(gè)體。專(zhuān)能干細(xì)胞：

只能向一種類(lèi)型或密切相關(guān)的兩種類(lèi)型的細(xì)胞分化。二、胚胎干細(xì)胞的特性?xún)?nèi)細(xì)胞團(tuán)原始生殖細(xì)胞胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcells,ESC)是一種從早期胚胎

內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始生殖細(xì)胞經(jīng)分離、體外培養(yǎng)、克隆等得到的具有發(fā)育全能性的細(xì)胞。具有胚胎細(xì)胞的特征形態(tài)：體積小、核大、核仁突出；呈克隆狀生長(zhǎng)；功能：在解除分化抑制的條件下能參與包括生殖腺在內(nèi)的各種組織的發(fā)育潛力，即發(fā)育成完整動(dòng)物體的能力。具有細(xì)胞系的特征在飼養(yǎng)層上能維持未分化狀態(tài)并實(shí)現(xiàn)自我更新?？蔁o(wú)限增殖，也可冷凍保存。

ES細(xì)胞的形態(tài)特征三、胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用在基礎(chǔ)生物學(xué)方面，利用ES細(xì)胞研究細(xì)胞分化和個(gè)體發(fā)育的機(jī)理。在醫(yī)學(xué)方面，用于修復(fù)或替換功能喪失的組織或器官，是再生醫(yī)學(xué)的重要種子細(xì)胞；也可用于新藥的研制和開(kāi)發(fā)。在動(dòng)物生產(chǎn)方面，可用于生產(chǎn)克隆和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，加快良種家畜繁育。外胚層中胚層內(nèi)胚層生殖細(xì)胞1、分離培養(yǎng)系統(tǒng)問(wèn)題目前ES細(xì)胞的分離培養(yǎng)體系仍沿襲傳統(tǒng)的方法，分離成功率很低，需要建立新的或者完善已有的ES細(xì)胞分離和培養(yǎng)系統(tǒng)。

2、分化與臨床應(yīng)用問(wèn)題目前還無(wú)法對(duì)ES細(xì)胞實(shí)施專(zhuān)一性的誘導(dǎo)分化，無(wú)法在體外分化發(fā)育成一完整的器官，而且可用于誘導(dǎo)分化的化學(xué)物質(zhì)種類(lèi)有限。

3、倫理道德問(wèn)題ES細(xì)胞的研究和應(yīng)用一直牽涉到許多法律、宗教和倫理學(xué)問(wèn)題。四、胚胎干細(xì)胞存在的問(wèn)題那么是否可以用另外的方法，避開(kāi)倫理學(xué)的限制，獲得具有多能性的細(xì)胞呢？

2006年,日本Yamanaka(山中伸彌)研究小組通過(guò)將逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的Oct-4,Sox2,Klf4及c-Myc四個(gè)基因轉(zhuǎn)入鼠成纖維母細(xì)胞，將成體細(xì)胞重編程為具有多分化潛能的干細(xì)胞。Yamanaka也因此而獲得了2009年度美國(guó)拉斯克醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。五、胚胎干細(xì)胞的新來(lái)源-誘導(dǎo)多能干細(xì)胞通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將某些轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入動(dòng)物或人的體細(xì)胞，使體細(xì)胞直接重構(gòu)成為胚胎干細(xì)胞細(xì)胞樣的多潛能細(xì)胞。稱(chēng)之為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞即iPS細(xì)胞（inducedpluripotentstemcells,iPSC）

iPS細(xì)胞與傳統(tǒng)胚胎干細(xì)胞的區(qū)別iPS細(xì)胞雖然成功避開(kāi)倫理之爭(zhēng)，但是用于疾病的干細(xì)胞治療還有相當(dāng)長(zhǎng)的路要走，還有一系列的科學(xué)和技術(shù)問(wèn)題有待深入系統(tǒng)地研究，如成熟體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為類(lèi)胚胎干細(xì)胞的效率還很低，重編程分子機(jī)制還不清楚，所用的轉(zhuǎn)染病毒隨機(jī)整合到細(xì)胞的基因組中具有誘發(fā)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變的風(fēng)險(xiǎn)等。iPS細(xì)胞所提供的新思路、新技術(shù)和新方法有重大理論意義和實(shí)用價(jià)值，并將成為今后獲得患者自身遺傳背景的胚胎干細(xì)胞重要途徑之一。第四講干細(xì)胞、克隆與轉(zhuǎn)基因技術(shù)概述胚胎細(xì)胞克隆技術(shù)概況體細(xì)胞克隆技術(shù)定義體細(xì)胞克隆技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)影響核移植效果的主要因素核移植技術(shù)的應(yīng)用前景核移植技術(shù)存在的問(wèn)題動(dòng)物克隆技術(shù)克隆（cloning）源于希臘文klon，原意是樹(shù)木的枝條繁育。在生物學(xué)上是指由一個(gè)細(xì)胞或個(gè)體以無(wú)性繁殖方式產(chǎn)生遺傳物質(zhì)完全相同的一群細(xì)胞或一群個(gè)體。在動(dòng)物學(xué)上是指不經(jīng)過(guò)有性生殖的方式，直接獲得與親本具有相同遺傳物質(zhì)后代的過(guò)程。

哺乳動(dòng)物的克隆可通過(guò)胚胎分割和細(xì)胞核移植技術(shù)實(shí)現(xiàn)，理論上通過(guò)孤雌生殖也能實(shí)現(xiàn)動(dòng)物克隆，但迄今為止尚無(wú)成功的報(bào)道。一般情況下，哺乳動(dòng)物的克隆僅指細(xì)胞核移植技術(shù)，它包括胚胎細(xì)胞核移植和體細(xì)胞核移植技術(shù)。概述胚胎分割（embryosplitting）是運(yùn)用顯微手術(shù)的方法，將哺乳動(dòng)物附植前的胚胎均等地分成若干份，并使之繼續(xù)發(fā)育成完整個(gè)體的生物技術(shù)。在畜牧生產(chǎn)上，運(yùn)用胚胎分割可獲得同卵雙生或同卵多生，有利于擴(kuò)大優(yōu)良家畜的規(guī)模；在實(shí)驗(yàn)生物學(xué)或醫(yī)學(xué)中，運(yùn)用同卵孿生后代作實(shí)驗(yàn)材料，可消除遺傳差異，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。1235687哺乳動(dòng)物胚胎分割示意圖哺乳動(dòng)物的胚胎分割技術(shù)在近二十年取得了較大進(jìn)展，主要表現(xiàn)為操作方法越來(lái)越簡(jiǎn)單。在胚胎分割中，技術(shù)人員可不借助顯微操作儀，徒手分割。從目前的研究來(lái)看，由一枚胚胎通過(guò)胚胎分割方式獲得的后代數(shù)量有限，最好的結(jié)果是由一枚胚胎獲得3頭犢牛，這說(shuō)明用胚胎分割的方法克隆動(dòng)物的潛力很有限。因此，想要大量生產(chǎn)克隆動(dòng)物必須利用細(xì)胞核移植方法。胚胎細(xì)胞克隆又稱(chēng)為胚胎細(xì)胞核移植，是通過(guò)顯微操作將早期胚胎的單個(gè)細(xì)胞核移植到去核卵母細(xì)胞中構(gòu)建新合子的生物技術(shù)。核移植中，通常把提供細(xì)胞核的細(xì)胞稱(chēng)核供體，接受細(xì)胞核的去核卵子稱(chēng)核受體（受體卵子），由核供體和核受體構(gòu)建的胚胎稱(chēng)重構(gòu)胚。由于哺乳動(dòng)物的遺傳性狀主要由細(xì)胞核的遺傳物質(zhì)決定，所以用同一枚胚胎卵裂球獲得的核移植后代，因其基因型幾乎一致，故稱(chēng)為克隆動(dòng)物。

一、胚胎細(xì)胞克隆技術(shù)概況胚胎克隆的理論基礎(chǔ)：早期胚胎細(xì)胞具有發(fā)育全能性或多能性，即這些細(xì)胞核被移入到成熟的去核卵母細(xì)胞后，在胞質(zhì)內(nèi)特殊因子的作用下，使植入核的基因表達(dá)被重編程

（reprogramming），將“發(fā)育鐘”撥回到受精時(shí)的狀態(tài)，恢復(fù)全能性，猶如受精卵的基因組啟動(dòng)個(gè)體發(fā)育一樣。511423876910121311

哺乳動(dòng)物細(xì)胞核移植示意圖1.供體2.MⅡ期卵子3.去核4.核供體胚胎5.體細(xì)胞傳代培養(yǎng)6.分離的卵裂球7.G0/G1期體細(xì)胞

8.去核的卵子

9.胞質(zhì)-核供體復(fù)合體10.平行電極細(xì)胞融合11.針式電極細(xì)胞融合12.重構(gòu)胚13.囊胚獲得克隆動(dòng)物必須具備的條件：

供體細(xì)胞核受體卵母細(xì)胞胚胎移植的受體

（胚胎細(xì)胞或體細(xì)胞）體細(xì)胞克隆技術(shù)又稱(chēng)體細(xì)胞核移植技術(shù)，它是把高度分化的體細(xì)胞的細(xì)胞核移入去核卵母細(xì)胞中，使重構(gòu)胚發(fā)育成為與供體遺傳物質(zhì)完全相同個(gè)體的技術(shù)。二、體細(xì)胞克隆技術(shù)定義它與胚胎克隆技術(shù)相比，有兩大優(yōu)點(diǎn)：第一，同一遺傳性狀供體核的數(shù)量可無(wú)限獲得；第二，可通過(guò)對(duì)供體細(xì)胞的改造，加速家畜品種改良或生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。三、體細(xì)胞克隆技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)體細(xì)胞克隆的主要技術(shù)程序與胚胎細(xì)胞克隆基本相同，主要差別在供體細(xì)胞的選擇。供體細(xì)胞可通過(guò)血清饑餓或接觸抑制獲得（供體細(xì)胞要處于G0/G1期）。自然狀態(tài)的G0期細(xì)胞（如卵丘細(xì)胞）和G1期細(xì)胞（胎兒成纖維細(xì)胞），可直接移入去核卵母細(xì)胞中生產(chǎn)克隆胚胎。受體卵母細(xì)胞供體核細(xì)胞成熟卵母細(xì)胞去核細(xì)胞周期同期化細(xì)胞融合重構(gòu)胚激活重構(gòu)胚培養(yǎng)操作人員技術(shù)四、影響核移植效果的主要因素五、核移植技術(shù)應(yīng)用前景1．迅速擴(kuò)繁優(yōu)良畜種，加快育種進(jìn)展2．生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物核移植技術(shù)可以與轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合起來(lái)，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物。3．加深核質(zhì)互作關(guān)系的研究通過(guò)核移植技術(shù)，可以深入研究動(dòng)物個(gè)體發(fā)生的核質(zhì)互作關(guān)系。4．腫瘤和癌細(xì)胞基因活動(dòng)研究利用核移植技術(shù)先將腫瘤或癌細(xì)胞的核移入卵母細(xì)胞，再研究重構(gòu)胚的發(fā)育情況和基因調(diào)控規(guī)律，以便為腫瘤和癌癥的治療提供依據(jù)。

1．效率低

目前，胚胎克隆動(dòng)物成功率在5%~10%，體細(xì)胞克隆動(dòng)物在1%~6%。這是由于核移植的技術(shù)環(huán)節(jié)太多，每個(gè)環(huán)節(jié)都對(duì)核移植的效果產(chǎn)生直接的影響。目前基因組重編程的確切機(jī)制尚未闡明，配制的體外培養(yǎng)液和操作液不能完全滿(mǎn)足受體卵子、供體細(xì)胞及重構(gòu)胚的要求。六、核移植技術(shù)存在的問(wèn)題2．流產(chǎn)率、后代死亡率高

在克隆效率相對(duì)較高的克隆牛中流產(chǎn)率高達(dá)20%~50%。剖檢結(jié)果表明，部分犢牛胎盤(pán)功能不完善，其血液中含氧量及生長(zhǎng)因子的濃度都低于正常水平。另外，有些克隆牛犢脾臟、胸腺和淋巴結(jié)等未能正常發(fā)育，還有些牛犢右心室異常，這是導(dǎo)致克隆動(dòng)物流產(chǎn)和出生后死亡的一個(gè)重要原因。3．出生重過(guò)大造成難產(chǎn)

克隆動(dòng)物在妊娠期間體重及出生重遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)非克隆個(gè)體，這可能是由于克隆個(gè)體在胎兒階段發(fā)育失衡造成。對(duì)克隆牛出生10min內(nèi)測(cè)定的結(jié)果，血漿中甲狀腺素和3-碘化甲狀腺氨酸水平都明顯低于對(duì)照組，而胰島素水平卻明顯高于對(duì)照組，這也許是克隆牛犢出生重普遍偏高的原因之一。另外，由于培養(yǎng)基中血清的存在，導(dǎo)致早期胚胎基因表達(dá)發(fā)生改變，致使許多克隆動(dòng)物出生重增加。第四講干細(xì)胞、克隆與轉(zhuǎn)基因技術(shù)概述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究意義轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備的主要環(huán)節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究面臨的主要問(wèn)題動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，是指通過(guò)人為方法導(dǎo)入外源基因，在染色體基因組內(nèi)穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類(lèi)動(dòng)物。整合到動(dòng)物基因組上的外源結(jié)構(gòu)基因稱(chēng)為轉(zhuǎn)基因。在制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，外源基因可能只整合入動(dòng)物部分組織細(xì)胞的基因組，也可能整合進(jìn)動(dòng)物所有細(xì)胞的基因組中，因而其遺傳的穩(wěn)定性就會(huì)有所不同。概述超級(jí)鼠的誕生—?jiǎng)游镛D(zhuǎn)基因發(fā)展的里程碑動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為當(dāng)今生命科學(xué)中一個(gè)發(fā)展最快、最熱門(mén)的領(lǐng)域，相繼在兔、羊、豬、牛、雞、魚(yú)和貓等動(dòng)物獲得轉(zhuǎn)基因成功。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物正在改變著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、生物醫(yī)藥甚至是整個(gè)生命科學(xué)的研究與發(fā)展面貌。

提高生長(zhǎng)速率異種器官移植

減少排污

生物反應(yīng)器

改善肉質(zhì)成份提高抗病能力醫(yī)學(xué)疾病模型

提高瘦肉率

生物材料生產(chǎn)改善奶品質(zhì)一、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究意義

1.改良動(dòng)物生產(chǎn)性能

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將所需的優(yōu)良基因直接轉(zhuǎn)入待改良群體中，增加新的遺傳品質(zhì)，形成優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因畜禽，從而改良畜禽生產(chǎn)性能，如生長(zhǎng)速度、繁殖率、瘦肉率、產(chǎn)毛量等，最終培育成滿(mǎn)足人們需要的、具有優(yōu)良品質(zhì)的畜禽及魚(yú)類(lèi)新品系。農(nóng)業(yè)領(lǐng)域

2.抗病育種

對(duì)一些種屬特異性疾病，可以從抗該病的動(dòng)物中克隆出目的基因，導(dǎo)入易感動(dòng)物品種的基因組。若該目的基因能夠在宿主基因中表達(dá)，那么轉(zhuǎn)基因動(dòng)物對(duì)該病毒具有一定的抵抗力，由此可培育出抗該病品系。1.用作生物反應(yīng)器生產(chǎn)昂貴藥物和保健產(chǎn)品

把藥用蛋白或營(yíng)養(yǎng)蛋白質(zhì)與組織特異性表達(dá)調(diào)控元件藕聯(lián)，運(yùn)用家畜的造血系統(tǒng)或泌乳蛋白生產(chǎn)藥用或營(yíng)養(yǎng)蛋白質(zhì)，提高畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。2.利用轉(zhuǎn)基因豬生產(chǎn)人類(lèi)所需要的器官

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)的發(fā)展可以將攜帶有人免疫系統(tǒng)基因的轉(zhuǎn)基因豬，為人的器官移植提供了有效的器官來(lái)源途徑。3.建立人類(lèi)疾病的動(dòng)物模型

通過(guò)精確地激活或增強(qiáng)某些基因的表達(dá)，制作各種人類(lèi)遺傳疾病的動(dòng)物模型，其研究結(jié)果具有較高的真實(shí)性，可用于診斷、治和新藥篩選。同時(shí)利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可建立敏感動(dòng)物品系及與人類(lèi)相同疾病的動(dòng)物模型，可用于藥物篩選。醫(yī)藥領(lǐng)域上游：基因改造與載體構(gòu)建二、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備的主要環(huán)節(jié)中游：基因?qū)?、胚胎移植與建系下游：基因整合、表達(dá)檢測(cè)與轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品純化與利用顯微注射病毒轉(zhuǎn)染法精子介導(dǎo)法胚胎干細(xì)胞方法體細(xì)胞核移植法基因同源重組法外源基因的導(dǎo)入1.顯微注射制備轉(zhuǎn)基因利用精細(xì)的顯微注射針將外源基因直接注入單細(xì)胞受精卵的原核中，使外源基因整合到動(dòng)物的基因組中。優(yōu)點(diǎn)整合效率高;效果穩(wěn)定;通常外源基因是