蛋白質(zhì)與酶工程

關于蛋白質(zhì)與酶工程第一節(jié)酶的固定化方法一、固定化酶的優(yōu)缺點

1、優(yōu)點

①酶與底物、產(chǎn)物易分開，簡化了提純工藝；②可反復使用，利于連續(xù)化、管道化；③反應過程可控，利于自動化；④提高了酶的穩(wěn)定性（絕大多數(shù)情況）；⑤酶的使用效率高、產(chǎn)率高、產(chǎn)品質(zhì)量高、成本低。

2、缺點

①損失酶活力2）②不適應非水溶性底物和大分子底物③不適于多酶反應第2頁,共49頁，星期六，2024年，5月二、酶的固定化方法

吸附法、共價結合法、交聯(lián)法、包埋法第3頁,共49頁，星期六，2024年，5月

1、吸附法吸附法分為物理吸附法和離子交換吸附法。

①物理吸附法通過氫鍵、疏水作用和、π電子親和力等物理作用，將酶固定于水不溶載體上，從而制成固定化酶。常用的載體有：有機載體：纖維素(玻璃紙或膠棉膜)、淀粉等，吸附量大無機載體：氧化鉛、皂土、多孔玻璃等，吸附量小，易脫落第4頁,共49頁，星期六，2024年，5月②離子交換吸附法

將酶與含有離子交換基的水不溶載體相結合而達到固定化。陰離子交換劑：二乙基氨基乙基（DEAE）-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠

DEAE-SephadexA25固定氨基?；福喝苊?，然后用0.5mol/LNaOH和水洗滌，加酶混勻，于低溫下攪拌過夜，吸去上清液，再用蒸餾水和0.15mol／L醋酸鈉水溶液洗滌固定化酶，置4℃?zhèn)溆?。陽離子交換劑：羧甲基（CM）-纖維素第5頁,共49頁，星期六，2024年，5月

吸附法的優(yōu)點：a、操作簡單；b、載體選擇范圍廣；c、吸附過程可以同時純化酶；d、固定化酶在使用過程失活后可重新活化；e、載體可以回收再利用。

吸附法的缺點：a、由于有些機理不十分明了，在給酶量、吸附程度與固定化酶活力回收的關系不可預見性大。b、由于吸附法制備的固定化酶酶易脫落，影響產(chǎn)物純度和酶的操作穩(wěn)定性。第6頁,共49頁，星期六，2024年，5月2、包理法

包埋法是將載體聚合物的單體與酶溶液混合，再借助于聚合助進劑（包括交聯(lián)劑）的作用進行單體聚合，酶被包埋在載體聚合物中以達到固定化。分為凝膠包理法和微囊包埋法

①凝膠包理法凝膠包埋法（基質(zhì)包埋法）是將酶分子包埋在凝膠網(wǎng)絡的格子中。

海藻酸鈣凝膠（海藻酸鈉）、聚丙烯酰胺凝膠、淀粉凝膠、卡拉膠第7頁,共49頁，星期六，2024年，5月②微囊包埋法微囊包埋法是將酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊內(nèi)。此法在醫(yī)療上極為有用

人造細胞、紅血球包埋法、脂質(zhì)體包埋法……

包埋法是目前應用最多的一種較理想的方法。

優(yōu)點：①操作簡單，條件溫和；②無反應，不改變酶的空間結構，固定化酶的活力高；③適用性廣。

缺點：①只適宜于小分子底物，對大分子底物不適宜；②凝膠網(wǎng)絡對物質(zhì)擴散的阻力導致固定化酶動力學行為的變化。第8頁,共49頁，星期六，2024年，5月

3、共價結合法（共價偶聯(lián)法）就是酶蛋白的側鏈基團和載體表面上的功能基團之間形成共價鍵而固定的方法。

優(yōu)點：酶與載體結合牢固，酶不易脫落。

缺點：但反應條件較激烈，酶易失活，同時，制作手續(xù)亦較繁瑣。

①酶分子和載體連接的功能基團

酶分子：-NH3、-COOH、苯環(huán)基、-OH、-SH、咪唑基、吲哚基載體：芳香氨基，羧基，羧甲基等第9頁,共49頁，星期六，2024年，5月

②載體的選擇載體直接關系到固定化酶的性質(zhì)和形成。對載體的一般要求是：

a、一般親水載體都優(yōu)于疏水載體（結合量、活力、穩(wěn)定性）；

b、載體結構疏松，表面積大，有一定的機械強度；

c、載體必須帶有在溫和條件與酶共價結合的功能基團；

d、載體沒有或很少有非專一性吸附；

e、載體來源容易，便宜，并能反復使用。第10頁,共49頁，星期六，2024年，5月

如:天然高分子衍生物:

纖維素葡聚糖凝膠親和性好，機械性能差瓊脂糖合成聚合物：聚丙烯酰胺 聚苯乙烯性能好，但有疏水結構尼龍第11頁,共49頁，星期六，2024年，5月③偶聯(lián)反應

有13類反應，但必須考慮偶聯(lián)效率，固定化酶總活力，操作簡便以及成本等因素。

常用的偶聯(lián)反應：重氮化法、疊氮法、溴化氰法、芳香烴化法等。

a、重氮法是將帶芳香族氨基的載體，先用NaNO2和稀鹽酸酸處理成重氮鹽衍生物，再在偏堿(pH8-9)條件下與酶蛋白的氨基、酚基、咪唑基發(fā)生偶聯(lián)反應，得到固定化酶。第12頁,共49頁，星期六，2024年，5月第13頁,共49頁，星期六，2024年，5月多糖類的芳香族氨基衍生物載體（對-β-硫酸脂乙砜基胺多糖）第14頁,共49頁，星期六，2024年，5月氨基酸共聚體如L-Leu和對氨基-DL-苯丙氨酸共聚物第15頁,共49頁，星期六，2024年，5月聚丙烯酰胺衍生物第16頁,共49頁，星期六，2024年，5月苯乙酰樹脂第17頁,共49頁，星期六，2024年，5月多孔玻璃的氨基硅烷衍生物Y-氨基丙基三氧乙烷硅第一步：第18頁,共49頁，星期六，2024年，5月第二步：對硝基苯酚氯第19頁,共49頁，星期六，2024年，5月

b、疊氮法將帶有羧基或羥基、羧甲基等的載體在酸性條件下用甲醇處理使之酯化，再用水合肼處理形成酰肼，最后在HNO3作用下轉變成疊氮衍生物。在低溫下可與酶蛋白的氨基、羥基、酚基、巰基等反應羧甲基纖維素、CM—Sephadex第20頁,共49頁，星期六，2024年，5月

c、溴化氰法

含有羥基的載體（如纖維素、葡聚糖、瓊脂等）在堿性條件下，載體的羥基與CNBr反應，生成活潑的亞胺碳酸鹽，在弱堿條件下，可與酶分子的氨基偶聯(lián)，產(chǎn)生固定化酶。第21頁,共49頁，星期六，2024年，5月d、芳香烴化法具有羥基的載體可以通過烷基化、芳香基化引入活潑的鹵素基后，在堿性條件下，與酶分子上的氨基、酚基、巰基等反應。纖維素載體均三氯三嗪3-F-4，6-二硝基苯第22頁,共49頁，星期六，2024年，5月4、交聯(lián)法利用雙功能或多功能試劑在酶分子間或酶與惰性蛋白間進行交聯(lián)反應制備固定化酶。最常用的交聯(lián)試劑是戊二醛，其他如苯基二異硫氰、雙重氮聯(lián)苯胺-2，2’-二磺酸、1，5-二氟-2，4-二硝苯、己二酰二胺二甲脂等。

戊二醛有兩個醛基，均可與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基反應，使酶蛋白交聯(lián)。第23頁,共49頁，星期六，2024年，5月

缺點：①反應條件激烈，酶分子的多個基團被交聯(lián)，酶活力損失大。

②制備的固定化酶顆粒較小，給使用帶來不便。第24頁,共49頁，星期六，2024年，5月各種固定化方法的比較交聯(lián)法常與吸附法、包埋法結合使用。第25頁,共49頁，星期六，2024年，5月第二節(jié)固定化酶的性質(zhì)

由于固定的方法不同，固定化酶的活力和性質(zhì)也有所不同。

一、固定化酶的活力下降

原因：①酶的結構或構象發(fā)生變化(特別是酶活性中心)；②酶與底物間的相互作用受到空間位阻(屏蔽效應)；③微環(huán)境影響；④底物、產(chǎn)物的分配不均效應；⑤底物、產(chǎn)物的擴散限制效應

活力測定、偶聯(lián)效率、活力回收、相對活力

第26頁,共49頁，星期六，2024年，5月二、固定化酶的穩(wěn)定性提高

原因：①固定化增加了酶活性構象的牢固程度，可防止酶分子伸展變形；②抑制蛋白酶降解；③固定化部分阻擋了外界不利因素對酶的侵襲。

但如果固定化觸及到酶穩(wěn)定性區(qū)域，也可能導致酶穩(wěn)定性下降。

1、熱穩(wěn)定性提高氨基?；福喝芤好冈?5℃保溫15min，活力為0；DEAE-Sephadex固定化酶在同樣條件下仍有80％；DEAE-纖維素固定化酶在同樣條件下還有60％活力。

第27頁,共49頁，星期六，2024年，5月

2、對蛋白酶的抵抗力提高氨基?；福涸谝鹊鞍酌缸饔孟禄盍H存20％，而將其固定于DEAE－纖維素上在同樣條件下仍有80％的活力。

3、對變性劑、抑制劑的抵抗能力提高氨基酰化酶：溶液酶在6mol、2mol弧、1％SDS和4mmol丙酮溶液中相對活力分別為9％、49％、1％和55％，而后者在相應溶液中相對活力則分別為146%、117%、35%和138%。第28頁,共49頁，星期六，2024年，5月

4、操作穩(wěn)定性提高固定化酶在操作中可以長期使用，半衰期較長。

青霉素?；福?7℃催化77天，活力仍為100%5、貯藏穩(wěn)定性提高

木瓜蛋白酶：在4℃下，120天溶液酶活力只保留有70%，而固定化酶（瓊脂）活力無變化。三、固定化酶的催化特性改變

1、最適溫度固定化酶反應的溫度一般較溶液酶的高，如用CM-纖維素固定的胰蛋白酶和糜蛋白酶的最適溫度比溶液酶高5~15℃。（但也有例外）第29頁,共49頁，星期六，2024年，5月

2、最適pH

最適pH的變動依據(jù)載體的電荷性質(zhì)而定。帶負電荷載體：最適pH向堿性偏移。帶正電荷載體：最適pH向酸性偏移。

DEAE-纖維素或DEAE-葡聚糖固定化氨基?；概c其游離酶比較，低0.5個pH而偏向酸性方向。CM-纖維素固定化的胰蛋白酶、糜蛋白酶的最適pH與游離酶比較，向堿性方向偏移0.5~1個pH單位。

第30頁,共49頁，星期六，2024年，5月

3、Km（反應動力學）多數(shù)固定化酶的Km有一定變化，與活性中心的構象改變及載體的電荷性質(zhì)有關。載體與底物電荷相反，固定化酶的Km值降低。載體與底物電荷相同，固定化酶的Km值顯著增加。

4、專一性

大多數(shù)固定化酶的專一性與溶液酶相同，但也有例外。第31頁,共49頁，星期六，2024年，5月第六章酶(蛋白質(zhì))分子的化學修飾（蛋白質(zhì)水平的分子改造）

酶分子的化學修飾就是在體外通過人工的方法將酶分子與一些化學基團或化學物質(zhì)(修飾試劑)進行共價連接從而改變酶的結構和性質(zhì)。

基礎研究：①探測酶活性必需氨基酸的性質(zhì)和數(shù)目；②探測酶蛋白的結構變化與功能的關系；③測定酶蛋白部分區(qū)域的構象狀態(tài)；④探索酶的作用機理和催化反應歷程；⑤研究酶的固定化技術。

應用研究：①提高酶的穩(wěn)定性；②改善酶的催化特性；③提高蛋白藥物在體內(nèi)不穩(wěn)性、消除免疫原性及靶向性（病灶細胞）。第32頁,共49頁，星期六，2024年，5月第一節(jié)酶化學修飾的基本條件必須對被修飾酶的性質(zhì)、修飾原理、修飾劑和反應條件等方面有足夠的了解一、被修飾酶的性質(zhì)

1、基本性質(zhì)熱、酸堿穩(wěn)定性，最適溫度、pH，pI，抑制劑，蛋白酶水解部位等。

2、酶活性中心氨基酸殘基數(shù)目、性質(zhì)及其地位、有無輔助因子及種類。第33頁,共49頁，星期六，2024年，5月

3、被修飾氨基酸側鏈基團的性質(zhì)及反應性常被修飾的側鏈基團：巰基、氨基、羧基、咪唑基、羥基、酚基、胍基、吲哚基、硫醚基及二硫鍵等①巰基的修飾試劑烷基化試劑：碘乙酸、碘乙酸胺、巰基乙醇、谷胱甘肽

汞試劑：HgCl2、對氯汞苯甲酸、2-氯汞硝基苯酚

Ellman試劑：5，5’-二硫-二-2-硝基苯甲酸

第34頁,共49頁，星期六，2024年，5月②氨基的修飾試劑

乙酸酐、2，4，6-三硝基苯磺酸、2，4-二硝基氟苯、苯異硫氰酸酯、碘乙酸

③羧基的修飾試劑甲醇、硼氟化三甲鋅鹽（-COOCH3）

④咪唑基的修飾試劑碘乙酸、碘乙酸胺

⑤吲哚基的修飾試劑光敏試劑（打開吲哚環(huán)）、4-硝基苯硫氯第35頁,共49頁，星期六，2024年，5月⑥甲硫氨酸側鏈基團的修飾試劑碘代乙酰胺、H2O2或光敏試劑(E-S-CH3的硫氧化)

⑦二硫鍵的修飾試劑

二硫蘇糖醇、2-巰基乙醇

⑧酚基的修飾試劑

N-乙酰咪唑、二異丙基氟磷酸

⑨胍基的修飾試劑

丁二酮、苯乙二醛（結合在胍基的兩個氨基上）第36頁,共49頁，星期六，2024年，5月二、修飾反應的條件酶穩(wěn)定、修飾率高、活力回收高(實驗探索確定)

1、pH與離子強度

①決定了側鏈基團的解離狀態(tài)和反應性能

②有些修飾試劑在不同pH條件下與同一基團可形成不同產(chǎn)物。

2、修飾反應的溫度與時間嚴格控制溫度和時間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應。

3、反應體系中酶與修飾劑的比例

第37頁,共49頁，星期六，2024年，5月第二節(jié)酶化學修飾的方法

酶表面修飾、酶內(nèi)部修飾

金屬離子置換修飾,大分子修飾(共價/非共價)側鏈基團修飾（小分子修飾）肽鏈有限水解修飾固定化修飾第38頁,共49頁，星期六，2024年，5月

1、金屬離子置換修飾把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法稱為金屬離子置換修飾。α-淀粉酶中的鈣離子（Ca2+），谷氨酸脫氫酶中的鋅離子(Zn2+)，過氧化氫酶分子中的鐵離子(Fe2+)，?；被崦阜肿又械匿\離子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的銅、鋅離子(Cu2+,Zn2+)若從酶分子中除去其所含的金屬離子，酶往往會喪失其催化活性。如果重新加入原有的金屬離子，酶的催化活性可以恢復或者部分恢復。若用另一種金屬離子進行置換，則可使酶呈現(xiàn)出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至喪失，有的卻可以使酶的活力提高或者增加酶的穩(wěn)定性。第39頁,共49頁，星期六，2024年，5月金屬離子置換修飾的過程

a.酶的分離純化：首先將欲進行修飾的酶經(jīng)過分離純化，除去雜質(zhì)，獲得具有一定純度的酶液。

b.除去原有的金屬離子：在經(jīng)過純化的酶液中加入一定量的金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金屬離子與EDTA等形成螯合物。通過透析、超濾、分子篩層析等方法，將EDTA-金屬螯合物從酶液中除去。此時，酶往往成為無活性狀態(tài)。

c.加入置換離子：于去離子的酶液中加入一定量的另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結合，除去多余的置換離子，就可以得到經(jīng)過金屬離子置換后的酶。金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結構中本來含有金屬離子的酶。用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價金屬離子。第40頁,共49頁，星期六，2024年，5月

2、大分子修飾

①大分子非共價修飾大分子物質(zhì)與酶非共價地相互作用，有效地保護酶的活力和穩(wěn)定性修飾試劑：聚乙二醇、多元醇、多糖、多聚氨基酸、蛋白質(zhì)等

②大分子共價修飾大分子物質(zhì)通過共價鍵連接于酶分子的表面形成一層覆蓋層有效地保護酶的活力和穩(wěn)定性。修飾試劑：聚乙二醇。右旋糖苷、肝素等第41頁,共49頁，星期六，2024年，5月大分子共價修飾的過程修飾劑的選擇：大分子結合修飾采用的修飾劑是水溶性大分子。例如，聚乙二醇、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、環(huán)狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等。要根據(jù)酶分子的結構和修飾劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。修飾劑的活化：作為修飾劑中含有的基團往往不能直接與酶分子的基團進行反應而結合在一起。在使用之前一般需要經(jīng)過活化，然后才可以與酶分子的某側鏈基團進行反應。修飾：將帶有活化基團的大分子修飾劑與經(jīng)過分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、pH值等條件下反應一段時間，使修飾劑的活化基團與酶分子的某側鏈基團以共價鍵結合，對酶分子進行修飾。分離：需要通過凝膠層析等方法進行分離，將具有不同修飾度的酶分子分開，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶。第42頁,共49頁，星期六，2024年，5月

3、側鏈基團修飾

利用一些適宜的小分子修飾劑通過化學法使酶蛋白表面的側鏈基團發(fā)生改變，從而改變酶分子的特性和功能的修飾方法。

非催化活性基團修飾：最主要的，側鏈基團一旦改變將引起酶蛋白空間構象的改變，從而改變酶的特性和功能。

催化活性基團修飾：氨基酸轉變(化學突變法)，例如Ser轉變?yōu)镃ys(-OH→-SH)?，F(xiàn)在已被蛋白工程所取代。操作過程繁瑣復雜，一般用于基礎研究，但也可提高酶的