飼料中玉米赤霉烯酮的測定 編制說明

《飼料中玉米赤霉烯酮的測定》編制說明（公開征求意見稿）一、工作簡況 （一）任務來源 （二）標準修訂背景 （三）工作過程 3二、國家標準編制原則和主要技術內容確定的依據(jù) 6（一）標準編制原則 6（二）標準主要技術內容的確定 71標準修訂的目的和方法研制中必用的基礎信息 72液相色譜-串聯(lián)質譜法的建立 82.1質譜條件的確定 2.2液相色譜條件的確定 2.3氮吹溫度的考察與確認 152.4樣品提取與凈化條件的確定 152.5標準溶液的穩(wěn)定性 2.6基質效應評價 2.7方法性能考察 203免疫親和柱凈化-高效液相色譜法的驗證 323.1樣品的提取與凈化 323.2液相色譜參考條件 323.3標準曲線線性范圍 323.4檢出限和定量限 333.5準確度和精密度 354本標準方法適用性考察 36三、標準復核驗證情況，技術經(jīng)濟論證，預期經(jīng)濟效果 38四、與國際、國外同類標準技術內容的對比情況 38五、采標情況，以及是否合規(guī)引用或采用國際國外標準 39六、與有關法律、法規(guī)的關系 39七、重大分歧意見的處理經(jīng)過和依據(jù) 40八、涉及專利的有關說明 40九、貫徹國家標準的要求，以及組織措施、技術措施、過渡期和實施日期的建議等措施建議.40十、其他應予說明的事項 40參考文獻 411一、工作簡況根據(jù)下達的2023年飼料工業(yè)國家標準復審修訂計劃項目，本標準修訂項目的編號為20233890-T-469，項目名稱為《飼定》，項目承擔單位為上海市農(nóng)業(yè)科學院和上海市獸藥飼料檢測所，本標（二）標準修訂背景飼料是人類的間接食品，飼料質量的好壞以及是否安全，直接影響了畜禽的正常發(fā)育和健康成長，以及生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展和人類健康。當前飼料安全及畜產(chǎn)品安全問題已經(jīng)引起全社會的關注。而飼料中存在的真菌毒素是飼料安全的最大隱患之一。玉米赤霉烯酮是一種重要真菌毒素，主要污染玉米、小麥等飼料原料及產(chǎn)品，其具有類雌激素作用，主要作用引起動物繁殖機能異常甚至死亡。目前我國已在國家標準GB13078-2017《飼料衛(wèi)生標準》中規(guī)定了飼料中玉米赤霉烯酮的限量標準，系統(tǒng)制定飼料中玉米赤霉烯酮的國標檢測方法，為飼料中玉米赤霉烯酮的用了液相色譜串聯(lián)質譜法精確測定玉米赤霉烯酮。而目前國標方法GB/T2料，缺乏部分飼料原料以及精料補充料。因此需要進一步制定完善液相色譜串聯(lián)質譜法檢測玉米赤霉烯酮的國家標準。國外，有關飼料中玉米赤霉烯酮的測定方法標準詳見表2。國際標準方面，其中ISO的兩個標準分別為提高飼料中玉米赤霉烯酮檢測效率，滿足我國飼料行業(yè)及企業(yè)的檢測需要，亟需對現(xiàn)行國家標準《飼料中玉米赤霉烯酮的測定》（GB/T薄層色譜法和酶聯(lián)免疫吸附法，以此修訂形成新的國家標準，進一步規(guī)范飼料中玉米赤霉烯酮的測定方法標準，提升檢測效率，為飼料原料的開發(fā)123NY/T2071-201134567法8912法3456781成立標準編制工作組42標準修訂進展資料，同時調研國內主要飼料質檢機構、飼料生產(chǎn)企業(yè)等標準方法的采用有關專家、主要起草人員召開標準修訂項目啟動會，確定標準修訂的主要 高效液相色譜法，針對飼料中玉米赤霉烯酮的液質方法和儀器條件進行優(yōu)化、并對所建立方法的線性、靈敏度、回收率和精密度等進行驗證，建立了不同飼料基質中玉米赤霉烯酮的精準檢測技術，并應用于實際樣品的檢意見稿，發(fā)省部級飼料質檢機構、大中型飼料企業(yè)實驗室、全國飼料工業(yè)條。同時邀請農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食品質量監(jiān)督檢驗測試中心（上海）、上海海關6動植物與食品檢驗檢疫技術中心、江蘇省畜產(chǎn)品質量檢驗測試中心三家單化工作組組織專家對上海市農(nóng)業(yè)科學院和上海市獸藥飼料檢測所起草的國家標準《飼料中玉米赤霉烯酮的測定》（預審稿）進行了認真審查。專家組由楊曙明、曲志娜、張麗英、樊霞、李云、吳銀良、吳寧鵬和張鳳枰組與會專家一致同意標準起草單位按照上述意見修改形成公開征求意見二、國家標準編制原則和主要技術內容確定的依據(jù)（一）標準編制原則按照GB/T20000.2－2009《標準化工作指南第2部分采用國際標準》的規(guī)定和要求編寫標準全文。查閱了國內外相關標準，結合現(xiàn)行標準實施情況，以保證標準的先進性和銜接性。建立的飼料中玉米赤霉烯酮的（二）標準主要技術內容的確定1標準修訂的目的和方法研制中必用的基礎信息本次修訂擬結合國內外玉米赤霉烯酮檢測技術發(fā)展趨勢和我國飼料行業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀，開發(fā)應用水平高、穩(wěn)定性和重復性好的技術及方法，保證檢測數(shù)據(jù)準確、可靠，并提高檢測效率，全力滿足我國飼料中玉米赤霉烯酮的檢測需要。刪除GB/T19540-2收集查閱到的國內外關于玉米赤霉烯酮檢測相關的文獻，開發(fā)建立液相色譜串聯(lián)質譜檢測方法，開展多種飼料基質的方法學研究，考察方法的適用性和實際樣品測定的可操作性。本標準同時對GB/T28716-2012中的免疫玉米赤霉烯酮的化學結構、理化特性是在方法研究建立中必須考慮和應用的基礎信息，其基本信息、化學結構和理化性質見圖2和表4。8C18H22O5試樣的制備均按GB/T14699-2023抽取有代表性的飼料樣品，用四分法縮2液相色譜-串聯(lián)質譜法的建立質譜儀中進行一級質譜全掃描（圖3），在電離過程中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了一個明質譜氬氣，進行二級掃描，比較其提取離子色譜圖的響應和峰型（圖4進行多次二級掃描考察穩(wěn)定性，此兩個子離子的信號強度依舊較高，因此選擇[M-H]﹣m/z317.2>131.1作為玉米赤霉烯酮的定性離子對，[M-H]﹣m/z比，發(fā)現(xiàn)定量離子對的選擇基本一致，定性離子對的選擇與歐盟標準EN168772016相一致。依次優(yōu)化氣流速、輔助氣、吹掃氣、離子傳輸溫度和霧化器溫度，然后優(yōu)化碰撞電壓，當碰撞能達到24eV時，定量離子對）；），174.99131.01131.01187.00159.93146.99161.03112.96129.92173.89107.01103.00162.9895.00203.06213.06143.00135.04157.03149.00158.96187.99180.91189.01119.04219100110120130140150160170180190200210220最終確定質譜儀器的方法參數(shù)如下：電離方式為電噴霧電離，負離子*用于定量測定玉米赤霉烯酮極性較弱，根據(jù)其結構性質以及飼料復雜的基質情況，在方法研究過程中，試驗比較了WatersACQUITYUPLCBEHC18(100霉烯酮標準溶液（圖7）。結果表明，三種色譜柱的峰型和分離度均較好，目標物色譜峰附近無雜質干擾，進一步考察色譜峰面積（表6），發(fā)現(xiàn)使赤霉烯酮響應最低（峰面積值為125451使用WatersACQUITYUPLCBEHC18(100mm×3mm，2.5μm)色譜柱時玉米赤霉烯酮的響應有所提高（峰面積值為201254使用WatersACQU烯酮的色譜峰型最為尖銳，響應最高（峰面積值為211479因此選擇HSS（高強度二氧化硅）顆粒技術，能提供出色能耐受100%水相，且耐受壓力高達18000psi，它還能提高保留率，因此可作為開發(fā)極性和非極性化合物分離方法的理想化效率，從而影響靈敏度。本實驗分別考察了乙腈-水、乙腈-5mmol/L乙相比于乙腈-5mmol/L乙酸銨水溶液體系，0458根據(jù)玉米赤霉烯酮的理化性質，其具有一種酚的二羥基苯酸的內酯結氯仿、二氯甲烷等溶劑。結合相關文獻與其余相關標準中真菌毒素的提取方法，本試驗主要考察的提取試劑為甲醇、乙腈以及不同比例的乙腈水混向其添加標準溶液使最終加標濃度為50μg/kg，用5種提取溶液分別進行提取操作，平行試驗三次，過濾膜上機測試，計算回收率，所得結果如下濃度為50μg/kg，分別使用震蕩、超聲和混勻三種提取方式進行提取，平時回收率最高，提取時間達到60分鐘時回收率反而下降，因此選擇超聲飼料基質比較復雜，需要進一步凈化，其最主要的雜質是油脂、蛋白質等，考慮到玉米赤霉烯酮的理化性質，結合文獻資料，主要考察了固相度為50μg/kg，分別使用不同的凈化小柱對空白飼料加標樣品進行凈化，），與真菌毒素分子具有高度親和性和專一性的特點，實現(xiàn)待測樣品凈化和富集的凈化材料，其具有高特異性，相比傳統(tǒng)的固相萃取小柱和多功能凈化柱，使用免疫親和柱凈化可以獲得更為純凈的樣品提取物，結合高效液相色譜串聯(lián)質譜可以獲得準確的定量檢測結果，因此本試驗選擇免疫親和柱UptentC18UptentPSA飛測IAC柱本標準制修訂小組所在團隊在接到制修訂任務前已經(jīng)開始對玉米赤霉每次試驗時，分別精確吸取玉米赤霉烯酮標準儲備溶液適量，逐級稀釋配次，峰面積的相對標準偏差（RSD）小于5%。試驗結果表明，標準儲備（0天）（2月）（3月）（6月）（9月）RSD/%平均峰3948263953824091534077214175594211264230124016372.5本標準制修訂小組所在團隊在接到制修訂任務前已經(jīng)開始對玉米赤霉烯酮標準中間溶液（10μg/mL）的穩(wěn)定性進行了長期考察。根據(jù)確定的色譜質譜條件，取配制好的玉米赤霉烯酮標準中間溶液（10μg/mL），分別標準偏差（RSD）小于5%。試驗結果表明，標準中間溶液在－18℃下保（0天）（2月）（3月）（6月）RSD/%平均峰面積2031692117441995271945121975942117443.2本標準方法學考察涉及小麥、玉米、仔豬配合飼料、育肥羊精料補充料、豬濃縮飼料共五種代表性飼料原料及飼料基質?；|效應會影響高效液相色譜串聯(lián)質譜的分析結果，出現(xiàn)信號抑制或者信號增強，采用初始流20動相和空白樣品基質液分別稀釋標準中間溶液，配制成標準系列溶液?；|效應通過基質標準曲線的斜率和溶劑標準曲線的斜率的比值（百分比）圍為51.2%-76.0%，為保證結果的準確性，采用基質匹配校準曲線消除基取基質空白試樣，經(jīng)提取凈化得到空白基質溶液，取標準中間溶液適質譜儀測定，以定量離子色譜峰面積為縱坐標，基質匹配標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。各種基質匹配標準曲線方程、線性范圍及相關系21ResponseResponseResponseResponseResponseResponse22ResponseResponseCompoundname:ZENCorrelationcoefficient:r=0.999321,r^2=0.998642Calibrationcurve:636.215*x+988.097Responsetype:ExternalStd,AreaCurvetype:Linear,Origin:Exclude,Weighting:1/x,Axistrans:None0000000000三5000025000500002500075000-0Conc-01020304050607080901001101201301401501601701801902002.7.2檢出限和定量限飼料基質復雜，因此本試驗選擇小麥、玉米、仔豬配合飼料、育肥羊精料補充料和豬濃縮飼料共五種飼料作為考察對象。在上述空白飼料中添加一定濃度的玉米赤霉烯酮，按照本標準進行試驗。以當色譜峰的信噪比2324），），），25），），），本方法采用液相色譜-串聯(lián)質譜法考察了玉米赤霉烯酮在小麥、玉米、玉米DDGS、噴漿玉米皮、玉米漿干粉、仔豬配合飼料、育肥羊精料補充及GB/T23182-2008《飼料中獸藥及其他化學物檢測試驗規(guī)程》等標準，考慮本試驗添加回收水平需包括定量限及規(guī)定限量，確定了玉米基質的添26行試驗考察批內精密度，進行5個不同批次的試驗考察批間精密度，發(fā)現(xiàn)內精密度在1.4%~9.4%之間，批間精密度在2.9%~9.5%之間，具體結果見27(μg/kg)測定批次回收RSDRSD123456ⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤ28(μg/kg)測定批次回收RSDRSD123456ⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤ29(μg/kg)測定批次回收RSDRSD123456ⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤ30(μg/kg)測定批次回收RSDRSD123456ⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤ31(μg/kg)回收RSDRSD123456ⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤ323免疫親和柱凈化-高效液相色譜法的驗證提取劑，于振蕩器上振蕩60min，或于高速均質器均質2min后，用定量濾紙過濾，準確移取10.0mL濾液并加入40.0mLPBS溶液稀釋，用玻璃慢通過免疫親和柱，抽干。分別以10.0mL純水淋洗柱子兩次（對顏色較），3334 0.002.004.006.00分鐘0.800.60 0.400.200.00 -0.200.002.004.006.008.0010.0012.00分鐘35 4.00 2.00 0.002.004.006.00分鐘高效液相色譜法用于檢測飼料中的玉米赤霉烯酮，考察方法準確度和綜上所述，通過對標準曲線的驗證以及在玉米、玉米DDGS、噴漿玉米皮、玉米漿干粉、羊精料補充料和豬配合飼料中添加回收率、準確度和精密度的驗證，證明了高效液相色譜法能繼續(xù)適用于飼料中玉米赤霉烯酮36濃度 率RSDRSD123456ⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤⅠⅡⅢⅣⅤ4本標準方法適用性考察對本標準中兩種測試方法以及NY/T2071-2011標準方法進行了方法適37用性考察并對結果進行了對比分析，選擇了包含飼料原料、配合飼料、濃），/MS法NY/T1/2/3/456/789///38三、標準復核驗證情況，技術經(jīng)濟論證，預期經(jīng)濟效果海）、上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心、江蘇省畜產(chǎn)品質量檢驗測試中心共三家有資質的檢測機構對該標準進行復核驗證，不同實驗室間國標修訂版修改完善了飼料中玉米赤霉烯酮的測定方法，刪除了薄層串聯(lián)質譜法，為定量和定性提供了依據(jù)。經(jīng)試驗驗證，采用《飼料中玉米赤霉烯酮的測定》規(guī)定的方法測定飼料中玉米赤霉烯酮，方法重復性好，精密度符合標準要求，能滿足飼料原料、配合飼料、濃縮飼料、精料補充玉米赤霉烯酮是飼料質量控制的重要指標。修訂其測定的國家標準方法，對于規(guī)范飼料原料生產(chǎn)、提高產(chǎn)品質量和安全水平、加強飼料質量安全監(jiān)管具有重要意義，保障了我國畜產(chǎn)品質量安全，有助于推動畜牧產(chǎn)業(yè)和畜牧業(yè)經(jīng)濟快速健康發(fā)展。本標準作為飼料質量安全基礎性標準，建議四、與國際、國外同類標準技術內容的對比情況17194:2019進行比較，選取空白玉米粉和豬配合飼料樣品加標（20μg/kg和100μg/kg）進行回收率考察，結果見下表25，本39方法定量限（10μg/kg）低于歐盟標準EN17194:20），五、采標情況，以及是否合規(guī)引用或采用國際國外標準六、與有關法律、法規(guī)的關系格執(zhí)行強制性國家標準和行業(yè)標準。與相關的各種基礎標準相銜接，遵循了政策性和協(xié)調同一性的原則。本文件制定過程中參考了GB13078-2017《飼料衛(wèi)生標準》中玉米赤霉烯酮在各類飼料原料及飼料產(chǎn)品40七、重大分歧意見的處理經(jīng)過和依據(jù)八、涉及專利的有關說明九、貫徹國家標準的要求，以及組織措施、技術措施、過渡期和實施日期的建議等措施建議飼料工業(yè)標準化技術委員會組織標準起草單位通過標準培訓、會議宣貫、十、其他應予說明的事項41參考文獻[7]DB42/T808-2012中華人民共和國湖北省地方標準《飼料中黃曲霉毒素B1、玉[8]DB37/T4045.2-2020中華人民共和國山[10]謝瑜杰,陳輝,胡雪艷,等.QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質譜[11]李洪波,宋志超,陳薔,等.[12]宋月,楊麗君,吳平谷,等.復合柱凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定糧油中42[15]