銀耳中銀耳多糖的測定方法 編制說明

2安發(fā)(福建)生物科技有限公司、安諾康(福建)生物技科有限我國傳統(tǒng)的真菌食藥，享有“菌中之冠”的美譽，具有滋陰潤肺、養(yǎng)胃生津、免疫調(diào)節(jié)、現(xiàn)有國內(nèi)已有各級食用菌多糖類檢測標準包括：《GB/T15672-20耳多糖》等團體標準。但這些標準有各自的適用范圍、測試對象、測試方法、方法特點，3例能較為準確的將銀耳多糖與其它多糖區(qū)分開，以彌補原有苯酚-硫酸的檢測缺陷。本標準建立的方法具有專屬性強、穩(wěn)定、無雜質(zhì)干擾，此外，該方法簡單、本技術(shù)標準于2022年3月由全國銀耳標準化工作組提出策劃，并于2022年制訂，全國銀耳標準化工作組等6家單位協(xié)作，開展標準制訂、測試）：43.2標準起草階段(2023年8月根據(jù)《國家標準化管理委員會決定下達2023年第二批的測定方法》列入推薦性國家標準計劃。2023年8月28公司、福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所等9個單位組前;標準送審稿完成時間：2024年11月4曰前;標準報批全國銀耳標準化工作組:負責(zé)標準制定全過程的組織、協(xié)調(diào)，負責(zé)征求意見稿、5用離子色譜法對銀耳中銀耳多糖進行定性檢測，可顯示5種單糖簡單、可實現(xiàn)自動化檢測；苯酚硫酸法可檢測包含5種主要單糖含量以6法食用菌中總糖含量的測定本標準適用于食用菌中總糖苯酚-硫了所有單糖或淀粉糊食用菌中粗多糖含量的測定分本文件規(guī)定了食用菌中粗多糖含量的分光光度測定方本文件適用于各種食用菌鮮品及干菇、片菇、碎菇、菇粉等初加工制品中粗多糖含量的測定;不適用于添加淀以及食用菌液體發(fā)酵或固體發(fā)酵等產(chǎn)品的測定.本文件粗多糖線性含量范圍量超范圍時,可酌情減少稱樣量或加大提取液定容體積.用碘溶液進行定性鑒-硫酸法測定粗多糖含量7食品中粗多糖的測定苯本標準規(guī)定了出口植物源性食品中粗多糖含量的比色測葡萄、棗類、果汁等植物源性食品中粗多糖含量的測本標準不適用于添加淀粉、苯酚-硫用碘溶液進行定性鑒-硫酸法測定粗多糖含量食用菌中巖藻糖、阿糖甘露醇、甘露糖、葡萄核糖的測定本標準適用于食用菌中巖藻糖、阿糖醇、海藻糖、甘露醇、甘露糖、葡萄糖、半乳食用菌中巖藻糖、阿糖無水解步驟來分解單糖及并測出各種單糖銀耳多糖產(chǎn)品中多糖含本標準規(guī)定了用苯酚硫酸法測定銀耳多糖含量的方法。本標準適用于以門擔(dān)子菌門真菌銀耳的子實體為原料，經(jīng)過水洗、熱水浸提、過濾、沉淀分離、干燥、粉碎（和制粒)等工序而制成了所有單糖或淀粉糊8本標準適用于以門擔(dān)子菌銀耳科、銀耳屬真菌銀耳子實體為原料，制成的銀耳多4本文件規(guī)定了食品級與化妝品原料級銀耳多糖產(chǎn)品的質(zhì)本文件適用于以銀耳屬真菌銀耳的子實體為原料，經(jīng)過提取、分離純化、干燥等工法國家標準銀耳中銀耳多糖的測定（征求意見本文件描述了采用離子色譜法對銀耳中銀耳多糖的本文件適用于銀耳中銀耳多糖經(jīng)酸水解后的特征性單糖——巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖的測法1）用離子色譜法定性鑒別銀耳多糖并顯示2)用苯酚硫酸法檢測92024年7月15日在自然資源部第三海洋研究量檢驗所、太陽樹(廈門)生物工程有限公司等），會后，全國銀耳標準化工作組秘書處及部分參與標準根據(jù)《國家標準化管理委員會關(guān)于下達2023年第二日前將平臺和線下征集的意見，整理分類。10月16日(1)標準提出單位改為：“中華全國供銷合作總社”。(2)范圍改為：葡萄糖、木糖和甘露糖的測定?！毙薷睦碛桑涸黾印鞍肴樘?、葡萄糖、木糖”的測定(3)結(jié)構(gòu)調(diào)整和“4.4.3標準溶液的配制”一并調(diào)整為“5.4標準溶液的制備”；“4.3儀器”②“4.5結(jié)果計算”改為“8分析結(jié)果的表述”；“4.6重并列項表述；增加“7.2.2標準曲線繪制、7.2.在制定過程中，需要把握三項原則：一是需要明確在適用性方面本標準充分考慮了離子色譜的工作原理及特點，具有專屬性、根據(jù)銀耳多糖各單糖色譜圖的保留時間和峰面積與各實驗方法：選擇三種型號的色譜柱：CarboPacTMPA10色譜柱(250×4.6mm，PA20和PA100色譜柱，各個單糖標準品，依萄糖(Glc)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)，可以達到分離效果，由于P但分離效果越差。在NaOH濃度為20mmol/L時，各個單糖標離度影響(見圖7~8)，隨著流動相的流速增大時，雖然保留譜柱使用以及儀器的運行造成影響，因此選擇流速為0.色譜柱：CarboPacTMPA20(250×2.3mm，5μCarboPacTMPA20(50×3mm，5使用DIONEXICS-5000+SP-5系統(tǒng)，檢測器：脈沖波形：Carbohydrates(St流動相：以水、50mmol/LNaOH溶液NaOH(%)02222溶液0.5mL，于110℃條件下水解3h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，加入1吹干，加水溶解轉(zhuǎn)移至5mL容量瓶中，用水定容至刻度，采用離子考慮3倍量乙醇醇沉比例是否偏少，擬加大酒精比例進行醇沉，5倍量乙醇沉淀單糖總量分別為：8.29%、9.25%、9.33%，從3-4倍量乙所測定單糖總合略有增長；從4-5倍乙醇沉淀時，所測定的單糖總合基針對水解可能會對單糖進行破壞問題，我們補充了單糖水解破壞試驗，結(jié)果表明，精密稱取巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖標準品各5m量瓶中，用水定容至刻度，得濃度均為0.5mg/mL的單糖標準儲備液。5mL容量瓶中，加水定容至刻度，即得各單糖濃度均為100μg/mL的混吸取0.5mL混合標準儲備液于水解管中，加入2mo3實驗方法：準確稱取粉碎銀耳樣品（過二號篩取上清液加水定容至一定體積，各取0.5mL提取液于水解管中，加入2mo0.5mL，于110℃條件下水解3h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，加入1mL甲醇氮在4h之后，增長趨勢不明顯，單糖總量出現(xiàn)了下降。這可能由于當(dāng)加入50mL水，分別于60、70、80、90、100上清液加水定容至一定體積，各取0.5mL提取液于水解管中，加入2mol/L的mL，于110℃條件下水解3h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，加入1mL甲醇氮吹，用實驗結(jié)果：由圖11表明，隨著溫度的升高，銀實驗方法：準確稱取粉碎銀耳樣品（過二號篩）1.0000g，置于125mL錐形瓶中，于100℃水浴中攪拌4h，分別選取料液比1：20、1：30、1：40、1：50、1：60（g/mL）加入水，提取結(jié)束后，冷卻離心，取上清液加水定容至一定體積，各取水解管中，加入2mol/L的TFA溶液0.5mL，于110℃條件下水解3h至室溫，加入1mL甲醇氮吹，用超純水溶解，稀釋至適宜濃度，采加，多糖溶出達到飽和，會趨于平穩(wěn)或者緩慢下降，因此最佳料液比選擇1:40(g/mL)。加入50mL水，于100℃水浴中攪拌4h，提取結(jié)束后，冷卻離心，留提取液于水解管中，加入2mol/L的TFA溶液0.5mL，于110℃條件下后，冷卻至室溫，加入1mL甲醇氮吹，用超純水溶解，稀釋至適實驗方法：在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)響112335110203000400050116017000809000010101100001011001量對提取時間(A)、提取溫度(B)、料液比(C)的回=10.72+3.50A+3.33B+1.90C+3.18AB+3.24AC+0.035BC+0.000A2-3.04B通過響應(yīng)面試驗得到的結(jié)果對銀耳多糖溶液提取工藝的回歸方程9A1BBCC773344注:“*”表示差異顯著注:“*”表示差異顯著(P＜0.05)；“**”表示差異極顯著P值均小于0.01，說明存在顯著性。二次項中，A2影響不顯著(P＞0.05)，B2(P＜0.01)，C2影響極顯著(P＜0.01)。校正模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9940可知試值和模擬預(yù)測值之間的相關(guān)性很高，表明該方程的模擬性較好。根據(jù)三種因單糖總量單糖總量B:B:溫度A:時A:時單糖總量單糖總量C:料液比A:時單糖總量單糖總量C:料液比C:料液比B:溫通過響應(yīng)面試驗得到最佳提取條件為提取時間4.94比1：58.8（g/mL）。為了驗證工藝參數(shù)的可靠性，結(jié)合實際操作的藝參數(shù)調(diào)整為提取時間5h、提取溫度92℃、液料比1：59（g/mL采取3組試驗進行驗證，多糖提取率19.15%，與預(yù)測結(jié)果相近，誤差為0.52%，說明程具有良好的預(yù)測性，其優(yōu)選出的最佳提取個因素為響應(yīng)因子建立正交實驗，單糖總量為衡量指標結(jié)束后，冷卻至室溫，加入1mL甲醇氮吹，用超純水溶解，稀釋至適宜濃度，采色譜分析，以單糖總量為衡量指標。結(jié)果見圖1是酸溶劑中單糖組成最多，且單糖總量最高，因此，選擇三氟乙酸為酸水解最佳溶劑。超過2mol/L，單糖總量出現(xiàn)了平緩下降情況。TFA濃度過低，多糖水解不完全，只能水過2mol/L后部分單糖開始分解，以至于單糖總量有所下降。故選擇2mol2.0、2.5mL的2mol/LTFA溶液，于110℃條件下水解2h，反應(yīng)結(jié)加入1mL甲醇氮吹，用超純水溶解，稀釋至適宜濃度，采用離子色實驗結(jié)果：由圖17可知，當(dāng)TFA用量為0.5~糖總量出現(xiàn)了降趨勢。這是TFA用量過低時，多糖水解還不夠完全溶液。取0.5mL多糖溶液于螺紋管中，加入2mol/LTFA溶液1.0m度較高會使多糖碳化，出現(xiàn)分解不利于水解反應(yīng)。因此，選擇110℃為最佳水解溫度。下水解0.5、1、2、3、4h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，加入1mL甲醇氮解，稀釋至適宜濃度，采用離子色譜分析，以單糖總量為衡量解2h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，加入1mL甲醇氮吹分別氮吹1、2、3次，用超解，稀釋至適宜濃度，采用離子色譜分析，以單糖總量為衡量A/(mol/L)123BCD111112122231333421235223162312731328321393321R為C＞D＞A＞B，即水解溫度對單糖總量的影響最大，水解時間和T水解溫度110℃、水解時間3h。對最佳組合實驗進行驗證，在此單糖總量8123456葡萄糖、木糖、甘露糖的峰面積RSD分別為1.88、2液，搖勻，作為標準曲線溶液。進樣量10μL，按照色譜條加入量/μg檢測量/μg131313加入量/μg檢測量/μg1231231高23加入量/μg檢測量/μg131313加入量/μg檢測量/μg123123123中中高加入量/μg檢測量/μg131313本標準與國內(nèi)硫酸-苯酚法及衍生化方法進行五、主要試驗(或驗證)的分析、綜述報告耳中銀耳多糖含量，使其更好地應(yīng)用于生活和生產(chǎn)無十、貫徹該標準的要求和措施建議(包括組織措施、技術(shù)措施、過渡辦法等內(nèi)容)。無[11]HANCK,CHIANGHC,LanticanceractivitiesindifferentstrainsofTremellafuciformisBAmericanJournalofChineseMedicine,015,43(8):1637-16ctsofex