藥品的微生物學(xué)檢查

關(guān)于藥品的微生物學(xué)檢查一、目的要求

1、了解微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用消毒滅菌儀器設(shè)備

2、了解空氣、皮膚細(xì)菌檢查方法

3、掌握藥品的微生物學(xué)檢驗(yàn)程序和方法二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.藥品的微生物限度檢查（一）

1）口服藥物的檢查:①藥品的預(yù)處理：②大腸桿菌的檢查：③細(xì)菌總數(shù)的檢查：

2）外用藥物的檢查:①藥品的預(yù)處理：②綠膿桿菌的檢查：③金黃色葡萄球菌的檢查：2.空氣、皮膚細(xì)菌檢查方法(驗(yàn)證)3.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用消毒滅菌儀器設(shè)備：高壓蒸汽滅菌鍋、消毒煮沸器、G6玻璃濾菌器裝置、潔凈工作臺(tái)、移動(dòng)式紫外光燈、鼓風(fēng)式干烤箱、紫外線殺菌標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)一藥品的微生物限度檢查（一）實(shí)驗(yàn)室常用消毒滅菌設(shè)備空氣和皮膚細(xì)菌檢查方法（綜合實(shí)驗(yàn)+基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)）第2頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月

通過(guò)實(shí)驗(yàn)了解藥品微生物限定檢查法的意義、設(shè)計(jì)方法、細(xì)菌檢查常用的基本技術(shù)和程序，結(jié)果分析方法。藥品的微生物限度檢查實(shí)驗(yàn)?zāi)康乃幤返奈⑸锵薅葯z查實(shí)驗(yàn)程序

一、藥品的預(yù)處理二、藥品的增菌培養(yǎng)、結(jié)果分析三、細(xì)菌分離鑒定、結(jié)果分析第3頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月口服藥外用藥藥品的微生物限度檢查實(shí)驗(yàn)方法（一）

1.藥品的預(yù)處理2克藥品加20毫升生理鹽水，研磨制成懸液

2.細(xì)菌培養(yǎng)外用藥口服藥藥品混懸液10毫升加入膽鹽乳糖增菌液中藥品混懸液10毫升加入膽鹽乳糖增菌液中藥品混懸液10毫升加入亞碲酸鈉增菌液中37℃,24小時(shí)37℃,24小時(shí)第4頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月

將剩余口服藥以10-110-210-310-4

進(jìn)行稀釋(以生理鹽水稀釋)

3.細(xì)菌總數(shù)測(cè)定從上述四個(gè)稀釋管中各取1ml混入溶化的瓊脂培養(yǎng)基中，混勻，冷卻后置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)

。取四個(gè)中試管各加9ml生理鹽水從剩余10ml懸液中取1ml加入上述四個(gè)稀釋管中1ml1ml10-110-410-210-39ml生理鹽水第5頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月一、目的要求:1、了解細(xì)菌培養(yǎng)接種技術(shù)

2、掌握細(xì)菌基本形態(tài)

3、掌握藥品的微生物學(xué)檢驗(yàn)程序和方法二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.藥物的微生物限度檢查（二）2.空氣、皮膚細(xì)菌檢查結(jié)果測(cè)定。3.講授基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備方法（營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯）。4.細(xì)菌在三種不同物理性狀培養(yǎng)基上的接種方法(基本技能)

液體培養(yǎng)基 平板培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基 雙糖含鐵半固體斜面培養(yǎng)基5.顯微鏡下觀察

細(xì)菌的基本形態(tài):球菌、枯草桿菌、霍亂弧菌。特殊結(jié)構(gòu)：肺炎莢膜、變形鞭毛、破傷風(fēng)芽胞。6.培養(yǎng)基的種類和用途普通培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、厭氧培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)二藥品的微生物限度檢查（二）細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查及培養(yǎng)接種技術(shù)第6頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月一、空氣、皮膚細(xì)菌培養(yǎng)現(xiàn)象觀察

（一）記錄空氣微生物培養(yǎng)結(jié)果菌落數(shù)目、大小、邊緣、顏色、粗糙（光滑）（二）記錄皮膚微生物培養(yǎng)結(jié)果比較消毒前后細(xì)菌菌落數(shù)，菌落特點(diǎn)。第7頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基分類根據(jù)物理性狀分類：液體培養(yǎng)基主要用于增菌半固體培養(yǎng)基用于檢測(cè)動(dòng)力及保存菌種固體培養(yǎng)基用于分離鑒定細(xì)菌根據(jù)用途分類：基礎(chǔ)培養(yǎng)基普通瓊脂培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基血液瓊脂培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基SS培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基雙糖鐵培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)基庖肉培養(yǎng)基第8頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月培養(yǎng)基的制備程序調(diào)配→矯正pH（7.0-7.6）→分裝→滅菌（121.3℃，20-30分鐘）→放入冰箱冷藏備用。因高壓之后pH值會(huì)下降0.1左右，所以矯正pH時(shí)應(yīng)比所需的pH高。鑒定是否有菌可將培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)24小時(shí)，然后觀察。第9頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月二、細(xì)菌的接種技術(shù)材料普通瓊脂平板、肉湯培養(yǎng)基、半固體斜面培養(yǎng)基大腸埃希菌培養(yǎng)物（１套／臺(tái)）第10頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月方法1.平板劃線接種法（1）平行劃線法（2）分區(qū)劃線法2.瓊脂斜面的接種方法3.液體培養(yǎng)基接種法4.半固體接種法第11頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月分區(qū)劃線法第12頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月菌落第13頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月斜面移種技術(shù)第14頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月菌苔第15頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月液體移種技術(shù)第16頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月穿刺技術(shù)第17頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月

取出前次實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)物觀察：

1.口服藥物1)細(xì)菌鑒定：在膽鹽乳糖增菌液中有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)：增菌液變混濁―――――有

-----接種在伊紅美蘭瓊脂平板培養(yǎng)基上面。方法：分區(qū)劃線接種。

2)細(xì)菌總數(shù)測(cè)定：選擇30-300個(gè)菌落平板，細(xì)菌總數(shù)＝菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)藥物的微生物限度檢查方法（二）第18頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月2.外用藥1)判定膽鹽乳糖增菌液培養(yǎng)物及亞碲酸鈉增菌液培養(yǎng)物有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)：增菌液變混濁―――有2)細(xì)菌鑒定：（1）將膽鹽乳糖增菌液培養(yǎng)物無(wú)菌接種在16烷三甲基溴化胺瓊脂斜面培養(yǎng)基上面。方法：斜面化線接種；（2）將亞碲酸鈉增菌液培養(yǎng)物，無(wú)菌接種在卵黃高鹽瓊脂平板培養(yǎng)基上面。方法：分區(qū)劃線接種。

37℃恒溫孵育箱24小時(shí)培養(yǎng)后，觀察結(jié)果。第19頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月細(xì)菌基本形態(tài)球菌桿菌螺形菌第20頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月葡萄球菌第21頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月鏈球菌第22頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月大腸埃希菌第23頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月枯草桿菌第24頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月霍亂弧菌第25頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)鞭毛莢膜芽孢第26頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月破傷風(fēng)梭菌spore第27頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月一、目的要求:1、了解細(xì)菌的生長(zhǎng)現(xiàn)象及代謝產(chǎn)物的觀察

2、掌握藥品的微生物學(xué)檢驗(yàn)程序和方法二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.藥物的微生物限度檢查（三）2.細(xì)菌的生長(zhǎng)現(xiàn)象及代謝產(chǎn)物的觀察

1）液體培養(yǎng)基---沉淀、渾濁、表面生長(zhǎng)現(xiàn)象。

2）三葡、三鏈、大腸與副傷乙培養(yǎng)基的菌落特征、溶血環(huán)觀察。

3）雙糖含鐵培養(yǎng)基---動(dòng)力、氣體、硫化氫、分解乳糖觀察。

4）結(jié)核桿菌菌落的觀察。 3.中草藥、抗生素抑菌試驗(yàn)

1）中草藥---大蒜汁、黃連、黃芩、黃柏。

2）抗生素---青霉素、慶大、氨芐、新諾明、生理鹽水。實(shí)驗(yàn)三

藥品的微生物限度檢查（三）微生物的形態(tài)學(xué)檢查及藥物的敏感性試驗(yàn)

第28頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月1）從伊紅美蘭瓊脂平板培養(yǎng)基上-----

挑取黑色帶有金屬光澤的濕潤(rùn)菌落，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上面，進(jìn)行細(xì)菌的純培養(yǎng)。

2）觀察外用藥物在16烷三甲基溴化胺瓊脂斜面培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況。記錄被檢菌色素的溶解性質(zhì)、液化明膠的狀況及菌苔粘稠度等。革蘭氏染色鏡下觀察其菌落形態(tài)。根據(jù)上述被檢菌落的生物性質(zhì)和狀況及細(xì)菌形態(tài)，確定該被檢菌的名稱。

3）從卵黃高鹽瓊脂平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，挑取黃色的濕潤(rùn)菌落，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上面，進(jìn)行細(xì)菌的純培養(yǎng)。藥物的微生物限度檢查（三）第29頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月2.細(xì)菌的生長(zhǎng)現(xiàn)象及代謝產(chǎn)物的觀察混濁生長(zhǎng)菌膜菌沉淀均勻渾濁對(duì)照第30頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月菌膜生長(zhǎng)第31頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月第32頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月第33頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月第34頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月3.中草藥、抗生素抑菌試驗(yàn)第35頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月

紙片法第36頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月六、革蘭染色法原理：革蘭陽(yáng)性菌與革蘭陰性菌細(xì)胞壁差異應(yīng)用方法標(biāo)本片制備革蘭染色結(jié)果第37頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月

2.革蘭染色（1）初染：滴加結(jié)晶紫染液l～2滴，1分鐘.水洗（2）媒染：滴加碘液，l～2滴，作用1分鐘后水洗。（3）脫色：滴加95％酒精數(shù)滴，（約15～30秒），立即水洗。（4）復(fù)染：滴加稀釋復(fù)紅染液1～2滴，作用1分鐘后水洗。（5）結(jié)果：牙垢標(biāo)本中革蘭陽(yáng)性菌染成紫色，革蘭陰性菌染成紅色。其中真菌(白色念珠菌)染成紫色，而螺旋體等被染成紅色?？谇恢忻撀涞慕M織細(xì)胞及個(gè)別白細(xì)胞被染成紅色。其細(xì)胞質(zhì)呈紅色，細(xì)胞核呈深紅色。

第38頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月實(shí)驗(yàn)四藥物的微生物限度檢查（四）病毒和細(xì)菌及其他病原微生物一、目的要求

1、了解抗酸染色方法及各種病毒和細(xì)菌的菌落形態(tài)

2、掌握藥品的微生物學(xué)檢驗(yàn)程序和方法二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1、藥物的藥物的微生物限度檢查（四）

1）將口服藥物中的細(xì)菌分別接種：①蛋白胨水培養(yǎng)基；②葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基；③枸櫞酸鹽（西蒙氏）培養(yǎng)基。同時(shí)接種產(chǎn)氣桿菌于上述培養(yǎng)管做對(duì)照，以備進(jìn)行IMViC試驗(yàn)。

2）取接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上面的外用藥物中細(xì)菌進(jìn)行血漿凝固酶檢測(cè),依據(jù)其反應(yīng)結(jié)果,確定該菌的性質(zhì)及名稱。2、抗酸染色 3、真菌培養(yǎng)物的觀察------黑曲霉、木霉、青霉菌菌落，白色念珠菌假菌絲，酵母菌菌落的觀察。4、記錄中草藥、抗生素抑菌試驗(yàn)結(jié)果5、觀察雞胚的結(jié)構(gòu) 第39頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月---------------------------------------------------試驗(yàn)培養(yǎng)基加試劑試驗(yàn)結(jié)果大腸埃希菌產(chǎn)氣桿菌蛋白胨水2管11葡萄糖蛋白胨水2管11葡萄糖蛋白胨水2管11枸櫞酸鹽2管11第40頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月實(shí)驗(yàn)四藥物的微生物限度檢查（四）病毒和細(xì)菌及其他病原微生物

取接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上面的外用藥物中細(xì)菌進(jìn)行血漿凝固酶檢測(cè),依據(jù)其反應(yīng)結(jié)果,確定該菌的性質(zhì)及名稱。

第41頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月二.血漿凝固酶試驗(yàn)原理：非致病性葡萄球菌不產(chǎn)生血漿凝固酶而致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，可使含有枸櫞酸鈉或肝素抗凝劑的兔或人等血漿發(fā)生凝固。方法：1.取潔凈玻片，用記號(hào)筆畫(huà)兩個(gè)圈并標(biāo)號(hào)，其中一個(gè)滴加生理鹽水另一個(gè)滴加兔血漿。2.接種環(huán)燒灼滅菌后挑取金葡菌苔，1/2在生理鹽水中研勻混懸，另1/2在兔血漿中研勻混懸，靜止片刻，觀察結(jié)果。結(jié)果：凝集呈顆粒狀判定為血漿凝固酶試驗(yàn)（+），呈均勻混濁狀不凝集判定為（-）第42頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月方法：1.取潔凈玻片，用記號(hào)筆畫(huà)兩個(gè)圈并標(biāo)號(hào)，其中一個(gè)滴加生理鹽水另一個(gè)滴加兔血漿。2.接種環(huán)燒灼滅菌后挑取金葡菌苔，1/2在生理鹽水中研勻混懸，另1/2在兔血漿中研勻混懸，靜止片刻，觀察結(jié)果。結(jié)果：凝集呈顆粒狀判定為血漿凝固酶試驗(yàn)（+），呈均勻混濁狀不凝集判定為（-）第43頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月制片（涂片、干燥、固定）；石炭酸復(fù)紅初染（加溫、蓋濾紙片）5min---水洗；3％鹽酸酒精脫色（15S,水洗）；美蘭復(fù)染（1min，水洗）-濾紙吸干鏡檢?？顾崛旧襟E第44頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月結(jié)核桿菌第45頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月抗生素體外抑菌試驗(yàn)（二）

記錄紙片法結(jié)果測(cè)量抑菌環(huán)直徑

第46頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月病毒的分離培養(yǎng)—雞胚接種動(dòng)物接種雞胚培養(yǎng)組織細(xì)胞培養(yǎng)病毒的培養(yǎng)方法：第47頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月病毒的分離培養(yǎng)—雞胚接種第48頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月病毒名稱接種部位雞胚胚齡（天）痘類病毒絨毛尿囊膜10～13流感、副流感、腮腺炎病毒尿囊9～11嗜神經(jīng)病毒卵黃囊5～8初次分離標(biāo)本羊膜腔10～12病毒的分離培養(yǎng)—雞胚培養(yǎng)第49頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月實(shí)驗(yàn)五藥物的微生物限度檢查（五）一、目的要求掌握藥品的微生物學(xué)檢驗(yàn)程序和方法二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容以生化反應(yīng)（IMViC）檢測(cè)口服藥中細(xì)菌的性質(zhì)。第50頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月---------------------------------------------------試驗(yàn)培養(yǎng)基加試劑試驗(yàn)結(jié)果大腸埃希菌產(chǎn)氣桿菌吲哚(I)蛋白胨水2管苯甲醛試劑0.5ml(5滴)紅陽(yáng)性（+）無(wú)色變陰性（-）甲基紅(M)葡萄糖蛋白胨水2管甲基紅5滴紅色陽(yáng)性（+）黃色陰性（-）VP葡萄糖蛋白胨水2管培氏乙6滴——萘酚試劑6滴無(wú)色變陰性（-）紅色陽(yáng)性（+）枸椽酸鹽(C)枸櫞酸鹽2管綠無(wú)色變陰性（-）綠—藍(lán)色陽(yáng)性（+）第51頁(yè),共62頁(yè)，星期六，2024年，5月IMViC結(jié)果吸哚試驗(yàn)：取出后每管滴加柯氏試劑0.5ml，靜止片刻，觀察有無(wú)顏色改變。大腸埃希菌能夠分解色氨酸產(chǎn)生吲哚，加入對(duì)二甲基氨基苯甲醛后形成紅色的玫瑰吲哚，則為陽(yáng)性反應(yīng)；產(chǎn)氣桿菌不產(chǎn)生吲哚，添加試劑后無(wú)顏色變化，為陰性反應(yīng)。甲基紅試驗(yàn)：取出后各管內(nèi)滴加甲基紅試劑