儀器分析-高效液相色譜法

第三章高效液相色譜法HighPerformanceLiquidChromatography

(HPLC)一、高效液相色譜法的特點(diǎn)1.高效液相色譜法概述2.高效液相色譜與氣相色譜的比較

GCHPLC應(yīng)用范圍熱穩(wěn)定、低沸點(diǎn)的物質(zhì)熱不穩(wěn)定、高沸點(diǎn)、離子型的物質(zhì)熱力學(xué)理論較成熟正在發(fā)展中分析成本低高分離能力與柱的類型有關(guān)較高3.高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法的比較

經(jīng)典液相色譜法高效液相色譜法粒徑(μm)75-6003-50（常用5-10）柱前壓力(atm)0.01-1.020-300分析時(shí)間(h)1-200.05-1.0色譜柱長(zhǎng)度(cm)50-2002-30柱效(塊/m)2-50104-105樣品用量(g)1-1010-6-10-24.高效液相色譜法的特點(diǎn)高壓高速高效高靈敏度5.應(yīng)用舉例人參Ginseng人參、西洋參與三七的鑒別R1Rg1ReRb1RdABCRg1Rg1ReReRfRb1RcRb2RdRc三種藥材的HPLC指紋圖譜二、高效液相色譜理論基礎(chǔ)H=A+B/u+CuA=2λdpB→0C=?高效液相色譜中的速率方程

遷移的流動(dòng)相的傳質(zhì)阻力滯留的流動(dòng)相的傳質(zhì)阻力高效液相色譜中的速率方程渦流擴(kuò)散項(xiàng)縱向擴(kuò)散流動(dòng)相傳質(zhì)滯留區(qū)傳質(zhì)固定相內(nèi)傳質(zhì)2.對(duì)速率方程的討論選用細(xì)顆粒填料可獲高柱效流動(dòng)相流速低，有利于達(dá)到高柱效選用黏度小的流動(dòng)相有利于提高柱效溫度的影響液膜厚度的影響3.柱外效應(yīng)由于色譜柱之外的因素引起的色譜峰的展寬，例如進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管路及檢測(cè)器的死體積等。三、高效液相色譜儀1.高效液相色譜儀流程高效液相色譜儀2.高壓輸液系統(tǒng)

往復(fù)泵原理示意圖往復(fù)泵梯度洗提梯度洗提

即程序控制流動(dòng)相的組成，使在整個(gè)分離過(guò)程中，溶劑強(qiáng)度按照特定的變化規(guī)律增加。

優(yōu)點(diǎn)：分離復(fù)雜混合物，使所有組分都處在最佳的k值范圍內(nèi)。

缺點(diǎn)：檢測(cè)器的使用受到限制，分析結(jié)果的重復(fù)性取決于流速的穩(wěn)定性。柱子需進(jìn)行再生處理。溶劑A溶劑B電磁閥A電磁閥B混合室泵溶劑A溶劑B高壓泵A

高壓泵B混合室低壓溶劑梯度方框圖高壓溶劑梯度方框圖梯度洗提流程應(yīng)用舉例3.進(jìn)樣系統(tǒng)

六通進(jìn)樣閥結(jié)構(gòu)示意圖4.分離系統(tǒng)——色譜柱

包括柱管與固定相兩部分一般色譜柱長(zhǎng)5～30cm，內(nèi)徑為4～5mm凝膠色譜柱內(nèi)徑3～12mm微柱內(nèi)徑1-2mm，長(zhǎng)1-5cm制備往內(nèi)徑較大，可達(dá)25mm以上5．檢測(cè)系統(tǒng)

紫外檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器電導(dǎo)檢測(cè)器（1）紫外檢測(cè)器固定波長(zhǎng)的紫外檢測(cè)器可變波長(zhǎng)的紫外檢測(cè)器二極管陣列檢測(cè)器固定波長(zhǎng)的紫外檢測(cè)器Z型流通池結(jié)構(gòu)可變波長(zhǎng)的紫外檢測(cè)器二極管陣列檢測(cè)器二極管陣列檢測(cè)器之三維圖二極管陣列檢測(cè)器之IsoabsorbancePlot

響應(yīng)特性選擇性檢測(cè)器，如芳烴類化合物的檢測(cè)靈敏度高，可檢測(cè)10-9g/mL的物質(zhì)線性范圍寬，104-105對(duì)溫度及流動(dòng)相的改變不敏感適合梯度洗提HPLC常規(guī)檢測(cè)器應(yīng)用舉例波長(zhǎng)的選擇（2）示差折光檢測(cè)器結(jié)構(gòu)響應(yīng)特性通用性檢測(cè)器低靈敏度基線易受溫度的影響不適合梯度洗提熒光檢測(cè)器結(jié)構(gòu)響應(yīng)特性選擇性檢測(cè)器。如PAH，蛋白質(zhì)高靈敏度，比紫外高約1000倍適合梯度洗提應(yīng)用舉例電導(dǎo)檢測(cè)器結(jié)構(gòu)響應(yīng)特性選擇性檢測(cè)器，對(duì)離子型化合物有響應(yīng)靈敏度高受溫度的影響不能梯度洗提（5）幾種檢測(cè)器特性比較

示差折光紫外熒光電導(dǎo)應(yīng)用范圍通用選擇性高選擇性選擇性可否梯度淋洗不可可可不可線性范圍104105103104最小檢測(cè)量μgngpgng對(duì)溫度敏感度敏感低低敏感溶劑使用情況無(wú)限制受限制受限制受限制四、HPLC主要類型及其選擇

化學(xué)鍵合相色譜法液固色譜法離子對(duì)色譜法離子色譜法體積排阻色譜法1.化學(xué)鍵合相色譜法（1）分離機(jī)理正相鍵合相色譜法：固定相的極性大于流動(dòng)相的極性，適用于分離油溶性或水溶性的極性或強(qiáng)極性化合物。

分配機(jī)理：分配系數(shù)

x為溶質(zhì)，M為溶劑

反相鍵合相色譜法：固定相的極性小于流動(dòng)相的極性，適于分離非極性、極性和離子性化合物。應(yīng)用最廣泛反相鍵合相色譜法的疏溶劑機(jī)理：溶質(zhì)進(jìn)入極性流動(dòng)相后，排擠部分溶質(zhì)分子，其疏水基團(tuán)由于流動(dòng)相的斥力推動(dòng)而直接與非極性固定相上的烷基締合，構(gòu)成單分子吸附層，這種作用時(shí)可逆的。當(dāng)流動(dòng)相極性減小時(shí)，這種疏溶劑斥力下降。（2）固定相

疏水基團(tuán)如不同鏈長(zhǎng)的烷烴（C8和C18）和苯基等極性基團(tuán)如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。類型分離方式應(yīng)用特點(diǎn)C-18反相、離子對(duì)普適性好，保留值大。溶于水的高極性化合物、中等極性化合物C-8反相、離子對(duì)與C-18類似，保留值略小C-3,C-4反相保留值小，適合肽類和蛋白質(zhì)苯基反相保留適中，選擇性不同。非極性、中等極性化合物-CN反相、正相選擇性與硅膠類似，保留小，用途廣-NH2反相、正相分離糖類、核苷酸、固醇等二醇基正相分離有機(jī)酸、排阻分蛋白質(zhì)等醚基反相、正相分離酚類、芳硝基化合物，保留比C-18強(qiáng)聚苯乙烯基反相pH使用范圍廣，對(duì)部分分離峰形好，壽命長(zhǎng)常用固定相應(yīng)用舉例（3）流動(dòng)相表征溶劑特性的重要參數(shù)溶劑強(qiáng)度ε°：溶劑分子與吸附劑的親合程度，ε°越大，親合力約大。溶解度參數(shù)δ：衡量溶劑極性強(qiáng)度的指標(biāo)，δ越大，極性越強(qiáng)。是溶劑和溶質(zhì)分子間色散力、偶極力、接受質(zhì)子或給予質(zhì)子能力的總和。所以δ相近的混合溶劑，它的選擇性α不同。極性參數(shù)P’：溶劑與乙醇、二氧六環(huán)、硝基甲烷相互作用的度量，比較全面的反映了溶劑的性質(zhì)。粘度η：溶劑Eηε°δPˊxexdxn正己烷1.880.300.017.30.1

四氫呋喃7.60.460.579.14.00.380.200.42乙腈37.50.340.6511.85.80.310.270.42甲醇32.70.540.9512.95.10.480.220.31水78.50.89

2110.20.370.370.25溶劑的選擇原則溶劑具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)溶劑的選擇與使用的檢測(cè)器要有相容性溶劑的粘度要小溶劑的沸點(diǎn)不能太低溶劑的純度要高且價(jià)格便宜

溶劑選擇分組正相：正己烷、正庚烷、乙醚、二氯甲烷、氯仿等，己烷為主體，加入質(zhì)子接受體乙醚或甲基叔丁基醚，質(zhì)子給予體氯仿，偶極溶劑二氯甲烷

反相：水、甲醇、乙腈、四氫呋喃、乙醇及其混合物等，以水為主體，加入質(zhì)子接受體甲醇，質(zhì)子給予體乙腈，偶劑溶劑四氫呋喃。應(yīng)用舉例2.液固色譜法（1）分離機(jī)理以固體吸附劑為固定相的液相色譜法。由于溶質(zhì)分子和流動(dòng)相分子在吸附劑表面的吸附活性中心上進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)吸附，這種競(jìng)爭(zhēng)吸附形成不同溶質(zhì)在吸附劑表面的吸附、解吸平衡。平衡常數(shù)的不同導(dǎo)致不同溶質(zhì)得以分離。

（2）固定相

極性固定相：硅膠、氧化鎂、氧化鋁等非極性固定相：活性炭、高分子多孔微球、碳多孔微球等

（3）流動(dòng)相ε°越大，洗脫力越強(qiáng)。合適的洗脫強(qiáng)度可通過(guò)混合溶劑來(lái)得到硅膠為固定相時(shí)：以弱極性的正構(gòu)烷烴為主體，加入二氯甲烷等中等極性溶劑調(diào)節(jié)合適的洗脫強(qiáng)度。可用水對(duì)硅膠進(jìn)行減活處理，或加入四氫呋喃、乙腈、甲醇、異丙醇等改性劑舉例（4）應(yīng)用中等分子量的油溶性樣品如油品、脂肪、芳烴等不同極性取代基的化合物結(jié)構(gòu)異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體混合物的分離應(yīng)用舉例3.離子對(duì)色譜法（1）分離機(jī)理將一種或數(shù)種與樣品離子電荷（A+）相反的離子(B-)（稱為對(duì)離子或反離子）加入到色譜系統(tǒng)流動(dòng)相中，使其與樣品離子結(jié)合生成弱極性的離子對(duì)（中性締合物）的分離方法。多為反相離子對(duì)色譜

（2）固定相、流動(dòng)相和離子對(duì)試劑固定相：多為C18,C8反相鍵合相流動(dòng)相：以水為主的緩沖液，或水-甲醇、水-乙腈等混合溶劑離子對(duì)試劑：四丁基銨正離子、十六烷基三甲基銨正離子，ClO4-，十二烷基磺酸根等

（3）應(yīng)用有機(jī)酸、有機(jī)堿特別是強(qiáng)酸強(qiáng)堿的分析，如羧酸、磺酸、胺類、酚類、藥物、染料等4.離子色譜法

(1)分離機(jī)理試樣中的離子與離子交換樹脂上的離子發(fā)生反應(yīng)：

陽(yáng)離子交換：樹脂—SO3-H++M+=樹脂—SO3-M++H+

陰離子交換：樹脂—NR3+Cl-+X-=樹脂—NR3+X-+Cl

-不同的離子與樹脂離子的交換能力（親和能力）不同，親和力越大，離子越難洗脫，從而得以分離。離子交換色譜與離子色譜的分離原理一樣離子色譜最大的改進(jìn)是解決了微量組分的檢測(cè)問(wèn)題

雙柱抑制型：在分離柱和檢測(cè)器之間加一個(gè)化學(xué)抑制器，其作用有二，一是降低淋洗液的背景電導(dǎo)，二是增加被測(cè)離子的電導(dǎo)值，改善信噪比。靈敏度高。

單柱非抑制型：淋洗液直接進(jìn)入電導(dǎo)檢測(cè)器。簡(jiǎn)單、分辨率較好。（2）固定相離子交換劑，最常用的是乳膠薄殼型離子交換樹脂小球，根據(jù)功能基可分為：強(qiáng)酸型（磺酸基團(tuán)）、強(qiáng)堿型（季銨基）、弱酸型（羧酸）、弱堿型（伯、仲、叔胺）（3）流動(dòng)相

雙柱抑制型：分離陽(yáng)離子，一般采用無(wú)機(jī)酸如HCl，HNO3等；分離陰離子，一般采用NaOH、NaHCO3/NaCO3。

單柱非抑制型：分離陽(yáng)離子，用低濃度的HCl，HNO3等；分離陰離子，可用苯甲酸及其鹽、酒石酸、檸檬酸等

（4）應(yīng)用分析無(wú)機(jī)陰離子的首選方法還可用于分析無(wú)機(jī)陽(yáng)離子，有機(jī)酸、堿，糖類、蛋白質(zhì)等。應(yīng)用舉例5.體積排阻色譜法（SEC）

(1)分離原理以多孔凝膠為固定相，利用精確控制的凝膠孔徑，使樣品中不同分子大小的組分得以分離。

VR=V0+KD·Vp0<KD<1.0洗脫體積在V0

和V0+Vp之間，峰容量有限，10-12個(gè)峰用于分離分子大小差大于10%的樣品分離原理示意圖使用水溶液的凝膠過(guò)濾色譜法（GFC），主要用于分析多肽、蛋白質(zhì)、核酸、多糖等。使用有機(jī)溶劑的凝膠滲透色譜法(GPC)，主要用于高聚物（如聚乙烯、聚氯乙烯等）分子量的測(cè)定（2）固定相軟質(zhì)凝膠：如交聯(lián)葡聚糖等，水相分離生化體系，適于低、中壓操作半剛性凝膠：較高交聯(lián)度的苯乙烯、二乙烯苯共聚物，有機(jī)相洗脫，可承受10Mpa的壓力硬質(zhì)凝膠高交聯(lián)度苯乙烯、二乙烯苯共聚物：凝膠滲透色譜法多孔球形硅膠：凝膠過(guò)濾色譜法、凝膠滲透色譜法羥基化聚醚多孔微球：凝膠過(guò)濾色譜法

（3）流動(dòng)相改善分離主要通過(guò)固定相來(lái)實(shí)現(xiàn)。流動(dòng)相的選擇原則是：溶解樣品、與凝膠浸潤(rùn)、與檢測(cè)器匹配、粘度小。如四氫呋喃；緩沖溶液（4）應(yīng)用大分子的分離分析聚合物分子量分布的測(cè)定應(yīng)用舉例1.聚乙二醇400002.聚乙二醇100003.聚乙二醇30004.聚乙二醇10005.聚乙二醇6.液相色譜分離類型及條件選擇選擇合適的液相色譜分離類型

了解分析對(duì)象要分析的組分的大致濃度干擾物質(zhì)試樣的性質(zhì)結(jié)構(gòu)分子量酸堿性溶解性溶于水——排阻色譜，水為流動(dòng)相相對(duì)分子質(zhì)量＞2000不溶于水——排阻色譜，非水流動(dòng)相同系物——鍵合相色譜不溶于水異構(gòu)體——液固色譜樣品分子大小差異——排阻色譜反相鍵合相色譜相對(duì)分子質(zhì)量溶于水，不離解＜2000排阻色譜，水為流動(dòng)相