藥物氟尼康中鹽酸多西環(huán)素苯尼考的高效液相色譜檢測(cè)

藥物氟尼康中鹽酸多西環(huán)素、苯尼考的

高效液相色譜檢測(cè)

藥品簡(jiǎn)介鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考為我國(guó)獸藥標(biāo)準(zhǔn)《獸藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-獸藥地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)第一冊(cè)》中批準(zhǔn)的內(nèi)服藥。鹽酸多西環(huán)素（doxycyclinehydrochloride）為四環(huán)素類廣譜抗生素，主要用于革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌感染[1]氟苯尼考（florfenicol）為氯霉素類廣譜抗生素，主要用于治療魚(yú)、豬、牛及家禽類的細(xì)菌性感染[2]我國(guó)及歐盟、日本等國(guó)對(duì)鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考在動(dòng)物體內(nèi)含量有嚴(yán)格要求，因此對(duì)于有治療作用的氟尼康中鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考的含量的測(cè)定，需有嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)定量測(cè)定。藥典中包含兩種物質(zhì)各自的檢測(cè)方法，而對(duì)于兩種物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)沒(méi)有相應(yīng)的規(guī)定。因此，建立鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考的同時(shí)檢測(cè)的方法，在藥物生產(chǎn)和藥品檢驗(yàn)過(guò)程中極為重要藥品簡(jiǎn)介本HPLC方法簡(jiǎn)介采用較為簡(jiǎn)單的溶劑作為流動(dòng)相建立了同時(shí)檢測(cè)兩種物質(zhì)的高效液相色譜法方法簡(jiǎn)便、精確、檢測(cè)靈敏度高，分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，可以作為藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定的依據(jù)和參考本HPLC方法簡(jiǎn)介儀器：高效液相色譜儀（LC-10ATvp日本島津公司）配SPD-10Avp紫外檢測(cè)器配大連依利特公司色譜柱Hypersil-ODS2（4.6mm×250mm5μm）TOP色譜工作站；針筒式微孔濾膜過(guò)濾器0.45μmAL-204電子天平PHS-3CPH計(jì)KQ3200B型超聲波清洗器儀器與試劑LC-10A高效液相色譜儀（單泵）系統(tǒng)LC-10ATvp輸液?jiǎn)卧狧ypersilODS是硅膠基質(zhì)上鍵合了C18為官能團(tuán)的色譜柱填料，是典型的高效液相色譜柱用填料，適合于分析非極性和中性樣品，包括酸性、中性及親脂性化合物價(jià)格：

4.6*150*5u1200.00元

4.6*200*5u1250.004.6*250*5u1300.00

針筒式微孔濾膜過(guò)濾器試劑：試劑藥品氟尼康鹽酸多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品甲醇（色譜純）乙腈（色譜純）磷酸二氫銨三次蒸餾水儀器與試劑流動(dòng)相為乙腈：甲醇：磷酸二氫銨（0.1mol/L）=10:11:29pH=3.50檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm流速為1mL·min-1柱溫：30℃進(jìn)樣量10μL靈敏度0.01AUFS(滿量程的吸光度單位Absorbanceunits,fullscale)色譜條件

儲(chǔ)備溶液配制：分別精密稱取鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品各50mg，置于50mL棕色容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液，4℃冰箱冷藏待用供試液的制備：用研缽將氟尼康研碎后，稱取50mg，置于50mL棕色容量瓶中，用流動(dòng)相溶解后并定容，作為供試液，4℃冰箱冷藏待用溶液配制1.打開(kāi)電腦主機(jī)，再打開(kāi)高效液相色譜的模塊，啟動(dòng)工作站并初始化儀器2.儀器初始化完畢后，在工作界面上選擇測(cè)量項(xiàng)目，設(shè)置適當(dāng)?shù)膬x器參數(shù)：流動(dòng)相組成=乙腈：甲醇：磷酸二氫銨（0.1mol/L）=10:11:29，流速=1mL/min3.運(yùn)行程序，清洗色譜柱，直至基線平穩(wěn)，然后進(jìn)樣，進(jìn)行測(cè)定4.測(cè)定結(jié)束后，依次用純水、100%甲醇洗滌20分鐘，退出主程序，關(guān)閉計(jì)算機(jī)基本操作結(jié)果與討論流動(dòng)相的選擇:實(shí)驗(yàn)中考察了乙腈-水、甲醇-水的不同比例的流動(dòng)相對(duì)兩者的分離效果，鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考的出峰時(shí)間相同，不能夠達(dá)到分離。因此將乙腈、甲醇以一定比例混合加入磷酸二氫銨的鹽溶液，對(duì)三種溶液比例進(jìn)行了調(diào)節(jié)，實(shí)驗(yàn)中隨著乙腈和甲醇比例的增加，兩種物質(zhì)出峰時(shí)間同時(shí)前移，分離效果漸差；當(dāng)乙腈比例逐漸增大時(shí)，氟苯尼考的色譜峰型漸差；當(dāng)甲醇比例逐漸增大時(shí)，鹽酸多西環(huán)素的色譜峰型托尾嚴(yán)重；磷酸二氫銨鹽溶液比例增加時(shí)，兩種物質(zhì)出峰時(shí)間向后推移，且分離效果逐漸變優(yōu)，但鹽溶液加入過(guò)多時(shí)二者保留時(shí)間較長(zhǎng)，且分離不佳。此外pH值的確定也會(huì)同時(shí)影響二者的分離效果，適當(dāng)減小pH值，可以達(dá)到較優(yōu)的分離效果。實(shí)驗(yàn)通過(guò)調(diào)節(jié)得到：乙腈：甲醇：磷酸氫二銨溶液=10：11：29，pH=3.50，為最佳比例結(jié)果與討論檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇：鹽酸多西環(huán)素的紫外吸收的最大波長(zhǎng)為269nm，氟苯尼考的紫外吸收的最大波長(zhǎng)為220nm，鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考結(jié)構(gòu)式中均含有苯環(huán)，因此為了使得兩者都能更好的檢測(cè)，選定檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

結(jié)果與討論藥品氟尼康中鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考的分離色譜圖、標(biāo)準(zhǔn)品鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考的分離色譜圖分別如圖1、2所示：圖1藥品氟尼康中鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考的分離色譜圖圖1標(biāo)準(zhǔn)品鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考的分離色譜圖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:精確移取儲(chǔ)備液適量，并將儲(chǔ)備液置于容量瓶中，用流動(dòng)相定容，由此逐級(jí)稀釋得一系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用孔徑0.45μm的有機(jī)系微孔濾膜濾過(guò)。在1.2條件下，進(jìn)樣分析，以其色譜峰面積（Y）作為縱坐標(biāo)，以分析樣品濃度（C）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線鹽酸多西環(huán)素的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：

Y=-10611+3.5332×106C，r=0.9994

在6.25μg·mL-1~200μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性良好；氟苯尼考的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：

Y=-292.97+1.99×105C，r=0.9999

在6.25μg·mL-1~250μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性良好結(jié)果與討論精密度試驗(yàn):將鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考儲(chǔ)備液稀釋10倍，分別量取兩種溶液各25mL，均勻混合后，注入液相色譜進(jìn)行分析，連續(xù)進(jìn)樣七次，計(jì)算該方法的精密度，得到鹽酸多西環(huán)素的精密度為RSD=0.87%；氟苯尼考的精密度為RSD=0.72%。RSD即RelativeStandardDeviation.叫相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,也稱變異系數(shù)(CV).

RSD=標(biāo)準(zhǔn)差/平均值*100%常用它表示精密度2005版藥典附錄色譜法規(guī)定重復(fù)性連續(xù)進(jìn)樣5次ＲＳＤ%小于2%結(jié)果與討論穩(wěn)定性試驗(yàn)

穩(wěn)定性試驗(yàn):供試品溶液在自然光照射的條件下，在0、2、4、6、10、12h、24h時(shí)測(cè)定其主成分峰面積，鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考二者峰面積基本不變，RSD分別為0.94%和0.83%，結(jié)果表明供試品氟尼康溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定結(jié)果與討論小結(jié)

經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，對(duì)檢測(cè)方法中使用的溶劑、檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相等分析條件進(jìn)行了多次摸索，找到了一種在同一色譜條件下，實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物氟尼康中鹽酸多西環(huán)素和氟苯尼考的同時(shí)檢測(cè)本方法簡(jiǎn)便、快捷，結(jié)果可靠準(zhǔn)確該方法亦可用做藥物氟尼康的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定方法，靈敏度高，顯示出較好的分離效果參考文獻(xiàn)[1]徐群.高效液相色譜法測(cè)定鹽酸多西環(huán)素原料藥中的有關(guān)物質(zhì).齊魯藥事.2006，25（3）：159-160[2]郭霞，張素霞，沈建忠等.魚(yú)肌肉中氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留的高效液相色譜檢測(cè).中國(guó)獸醫(yī)科學(xué).2006，36（9）：743-747[3]范琦，蔣心惠，鄧晴源等.高效液相色譜法測(cè)定人尿中鹽酸多西環(huán)素.中國(guó)醫(yī)藥藥學(xué)雜志.2006，26（4）：447-450[4]楊方，余孔捷，黃建生.高效液相色譜法檢測(cè)鰻魚(yú)中氟苯尼考?xì)埩袅縖J].分析試驗(yàn)室.2005，24（2）：44-46[5]王旗，蔣激揚(yáng)，謝蜀生.高效液相色譜法