MS2 介導(dǎo)的口蹄疫類病毒顆粒疫苗的研究-61

1/1MS2介導(dǎo)的口蹄疫類病毒顆粒疫苗的研究MS2介導(dǎo)的口蹄疫類病毒顆粒疫苗的研究董艷美1，張國廣1,2，汪衛(wèi)1，范紅軍3，陳亮*(1廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建廈門,361005;2漳州師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)系，福建漳州,363000;3河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng),453000)摘要:研究表明口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV）的VP1蛋白含有關(guān)鍵的抗原決定簇。

根據(jù)O型HLJOC12/03豬源口蹄疫病毒（FMDV）毒株VP1上第141-160位氨基酸序列設(shè)計(jì)引物，利用重疊延伸PCR（SOEPCR）技術(shù)將該序列插入在大腸桿菌噬菌體MS2外殼蛋白基因的特定位點(diǎn)。

然后連接到原核表達(dá)載體pET28a上，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒28a-CP-VP1，轉(zhuǎn)化BL21（DE3），ITPG誘導(dǎo)表達(dá)得到融合表達(dá)的CP-VP1。

透射電子顯微鏡下觀察融合蛋白CP-VP1成類病毒顆粒（Virus-likeparticles,VLPs）狀。

間接ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)該蛋白能夠特異地結(jié)合豚鼠抗O型口蹄疫病毒的陽性血清，30g的CP-VP1類病毒顆粒蛋白免疫小鼠后可以誘導(dǎo)其產(chǎn)生了高效價(jià)的特異的抗體。

故該口蹄疫病毒抗原決定簇展示在噬菌體MS2上表面的類病毒顆粒蛋白具有開發(fā)成口蹄疫疫苗的前景。

關(guān)鍵詞:口蹄疫；MS2噬菌體；抗原決定簇；類病毒顆粒中圖分類號：

Q78文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：

Ａ文章編號口蹄疫（Foot-and-mouthdisease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV）引起的危害牛、豬、羊、駱駝、鹿、牦牛等約70種家畜及野生偶蹄動(dòng)物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病[1-5]。

因?yàn)槠湟坏┍l(fā)則傳播速度快,流行范圍廣，補(bǔ)救措施少，可造成上百億美元的直接經(jīng)濟(jì)損失，故被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報(bào)告的動(dòng)物傳染病，我國規(guī)定其為一類動(dòng)物疾病[1,5]。

FMDV為單股正鏈RNA病毒，主要有7個(gè)血清型[6,7]，近年來，爆發(fā)流行于我國境內(nèi)的大都是O型，A型和AsiaI型[5]。

自緬甸98（MYA98）譜系口蹄疫病毒2010年2月在我國廣州白云區(qū)疫區(qū)首次發(fā)現(xiàn)以來，該病毒已經(jīng)持續(xù)地給我國多省的畜牧業(yè)造成了巨大的損失，并且該病毒在不同宿主變異較大。

雖然傳統(tǒng)的滅活疫苗的免疫原性比較好，也在口蹄疫疫情的控制和在動(dòng)物保護(hù)上發(fā)揮了極其重要的作用,但是，滅活苗在生產(chǎn)過程中不僅要求嚴(yán)格，且存在安全隱患的問題[8,9]；并且免疫動(dòng)物和感染收稿日期：

2012-11-07基金項(xiàng)目：

廈門市科技計(jì)劃項(xiàng)目(NO.3502Z20103007)，福建省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目(NO.2009N0051)和福建省自然科學(xué)基金(NO.2010J01240)資助作者簡介：

董艷美(1981-)，女，博士研究生．E-mail：

diy1129@163.com.研究方向：

口蹄疫疫苗*通訊作者：

陳亮，男，教授，博導(dǎo)，E-mail：

chenlg@FMDV的動(dòng)物無法很好區(qū)分，限制了動(dòng)物產(chǎn)品的出口；此外，滅活苗的有效期較短，諸如此類的缺陷使得尋找更安全穩(wěn)定的新型疫苗成了科學(xué)工作者的大方向[3,10-12]。

與傳統(tǒng)疫苗相比，基因工程疫苗是一類非常安全高效的疫苗。

大腸桿菌MS2噬菌體屬于正極性單鏈RNA球形病毒，基因組全長3659bp，編碼成熟酶蛋白（或A蛋白）、外殼蛋白、復(fù)制酶蛋白和裂解蛋白等4種蛋白質(zhì)分子[13,14]。

研究發(fā)現(xiàn)，體外將MS2噬菌體的成熟酶蛋白和外殼蛋白的基因以及包含基因調(diào)節(jié)元件的5非編碼序列的基因克隆到表達(dá)載體中，誘導(dǎo)表達(dá)后的蛋白可自我組裝為成熟的類病毒顆粒[15,16]，且在其外殼蛋白基因的特定位點(diǎn)處插入幾個(gè)基因可以表達(dá)成外源氨基酸展示的類病毒顆粒狀[17,18]，以此，我們可以開發(fā)出類病毒顆粒疫苗。

類病毒顆粒疫苗作為一種新型的基因工程疫苗，其具有強(qiáng)大的免疫優(yōu)勢：

表面結(jié)構(gòu)規(guī)則，大小合適，易于被免疫系統(tǒng)識(shí)別并產(chǎn)生很好的免疫效果；在血清中的半衰期較長等等[19]。

本項(xiàng)研究選擇了O/HLJOC12/03毒株口蹄疫病毒VP1蛋白上關(guān)鍵的抗原決定簇第141-160位氨基酸[1,10,20]對應(yīng)的核苷酸序列，利用SOEPCR插入到MS2噬菌體的外殼蛋白基因的特定位點(diǎn)，經(jīng)過大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)出O/HLJOC12/03口蹄疫病毒的抗原決定簇多肽表達(dá)展示在MS2病毒樣顆粒的表面的類病毒顆粒。

體外和體內(nèi)的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)都證實(shí)該類病毒顆粒蛋白可以很好地誘導(dǎo)被免疫的小鼠產(chǎn)生特異的抗體，且具有很好的免疫原性。

本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果為進(jìn)一步開發(fā)出新型的口蹄疫類病毒顆粒疫苗提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法1.1材料1.1.1菌株、質(zhì)粒和主要試劑：

BL21（DE3）表達(dá)菌株，為本實(shí)驗(yàn)室保存，質(zhì)粒pMS27（包含有大腸桿菌噬菌體MS2的結(jié)構(gòu)基因序列）[21]由美國新墨西哥大學(xué)的DavidS.Peabody教授惠贈(zèng)。

限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和NheⅠ酶，氨芐青霉素、卡納霉素等抗生素及Taq酶，T4連接酶，dNTPs和克隆載體pMD18-TSimpleVector等購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司；DNAMarker和ProteinMarker購自北京天為時(shí)代科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自廣州東盛生物科技有限公司；5蛋白緩沖液、SDS配制溶液、磷酸鹽緩沖液和電轉(zhuǎn)緩沖液等均按分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[22]進(jìn)行配制。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、陽性血清：

實(shí)驗(yàn)選用的15只20g左右的健康清潔級的BAL（B/C）小鼠購自廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；O型FMDV抗原和豚鼠的陽性血清等購自中國農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所；辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗小鼠的IgG抗體購自成都的杰華科技有限公司。

1.1.3引物：

根據(jù)pMS27序列設(shè)計(jì)的擴(kuò)增出能夠自我組裝的MS2的5非編碼區(qū)、成熟酶基因、外殼蛋白基因的序列的引物為U-CP和D-CP。

引物序列見表1。

根據(jù)網(wǎng)站plexedwithaneutralizingantibody:directinvolvementoftheArg-Gly-Aspmotifintheinteraction.TheEMBOJ,1995,14(8):1690-1696.[26]DiMarchiR,BrookeG,GaleC,etal.Protectionofcattleagainstfoot-and-mouthdiseasebyasyntheticpeptide.Science,1986,232:639-641.[27]MorganD,MooreD.ProtectionofcattleandswineagainstFoot-and-mouthdiseaseusingbiosyntheticpeptidevaccines.AmJVetRes,1990,51:40-45.[28]LiGJ,ChenWZ,YanWY,etal.Comparisonofimmuneresponsesagainstfoot-and-mouthdiseasevirusinducedbyfusionproteinsusingtheswineIgGheavychainconstantregionor-galactosidaseasacarrierofimmunogenicepitopes[J].Virology,2004,328:274-281.[29]ZhangQ,LiLX,YanAG,etal.Immunogenicityofarecombinantfusionproteinoftandemrepeatepitopesoffoot-and-mouthdiseasevirustypeAsia1forguineapigs[J].ActaVirol,2002,46:1-9.[30]SubramanianBM,MadhanmohanM,SriramanR,etal.Developmentoffoot-and-mouthdiseasevirus(FMDV)serotypeOvirus-like-particles(VLPs)vaccineandevaluationofitspotency.ANTIVIRRES,2012,96(3):288-295.StudyonMS2mediatedviruslikeparticlesVaccineagainstFMDV1,GuoguangZhang1,2,WeiWang1,HongjunFan3,LiangYanmeiDongChen*1ThekeyLaboratoryofministryofEducationforCellbiologyandTumorCellEngineering,schoolofLifesciences,XiamenUniversity,Xiamen,Fujian,3610052Departmentofbiologicalscienceandtechnology,ZhangzhouNormalUniversity,Zhangzhou,Fujian,3630003SchoolofLifesciences,HenanNormalUniversity,Henan,Xinxiang,453000Abstract:Foot-and-mouthdisease(FMD)hascausedsevereeconomiclossestomillionsoffarmersinmanycountriesallovertheworld.Theseverityofthediseaseandthespreadofthisepidemicvirushavenotbeencontrolledfruitfully,anditcontinuestobeathreattolivestock.Vaccinationisoneofthemosteffectiveweaponsagainsttheinfectiousdisease.Ourstudywasaimedtodevelopakindofeffectiveandsafeviruslikeparticles(VLPs)vaccine.VP1proteinoffoot-and-mouthdiseasevirus(FMDV)haskeyantigenicdeterminantswhichwereusedbyvaccinedeveloperstimeandagain.Thenucleotidescodingthepeptidesfrom141to160AAofVP1proteinofstrainHLJOC12/03FMDVwereamplifiedandinsertedintothespecificsiteinthecoatproteingeneofMS2byusingSOEPCR.TheproductsweredigestedbyenzymesandthenligatedtothepET28a.Therecombination