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文檔簡介
1/1Ecad在膀胱癌中的表達及意義E-cad在膀胱癌中的表達及意義作者:
張東東1,梁衍鋒1,羅振國2作者單位:
1.佳木斯大學基礎(chǔ)醫(yī)學院,黑龍江佳木斯154007;2.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院,黑龍江佳木斯154003【摘要】目的:
探討E-cad在膀胱癌中的表達及意義。
方法:
通過免疫組織化學法和RT-PCR法檢測E-cad在膀胱癌和正常膀胱組織中的表達。
結(jié)果:
免疫組織化學方法對正常膀胱組織和膀胱癌組織中的E-cad進行了檢測,發(fā)現(xiàn)E-cad蛋白在膀胱癌組織中的陽性表達率為32.39%(23/71),正常膀胱黏膜組織表達的陽性率為100%,E-cad在膀胱癌組織中的表達明顯低于正常組織。
RT-PCR法從基因水平檢測正常膀胱組織和膀胱癌組織中E-cad的表達,E-cad在正常膀胱組織所得光密度值為0.9400.052,膀胱癌組織的光密度值為0.7540.044,經(jīng)統(tǒng)計學分析,E-cad在膀胱癌組織中的表達與正常膀胱組織表達相比差異有顯著性(t=11.142,P0.01)。
結(jié)論:
無論是在蛋白還是基因水平上,E-cad在膀胱癌組織中的表達低于正常膀胱組織的表達。
【關(guān)鍵詞】E-cad;膀胱癌;組織;免疫組化;RT-PCRAbstract:Objective:
ToinvestigatetheexpressionandsignificanceofE-cadherininurinarybladdercancer.Methods:
TheE-cadherinexpressionwasdetectedbyimmunohistochemistryandRT-PCRinthenormalurinarybladdertissueandurinarybladdercancertissue.Results:
Immunechistochemistry(SABC)methodshowedthepositiverateoftheE-cadherinexpressionwas32.39%(23/71)inurinarybladdercancerand100%inthenormalurinarybladdertissue.TheE-cadherexpressioninurinarybladdercancertissuewassignificantlylowerthanthatinthenormalurinarybladdertissue.RT-PCRmethodshowedtheopticaldensityvalueofE-cadherinwas0.9400.052inthenormalurinarybladdertissueandthatwas0.7540.044intheurinarybladdercancertissue.TheE-cadherinexpressionintheurinarybladdercancertissuewassignificantlylowerthanthatinthenormalurinarybladdertissue(P0.01).Conclusion:
Atbothproteinandgenelevels,theE-cadherinexpressionlevelislowerintheurinarybladdercancertissuethanthatinthenormalurinarybladdertissue.Keywords:E-cadherin;urinarybladdercancer;tissue;immunohistochemistry;RT-PCR膀胱癌是泌尿系統(tǒng)腫瘤中最常見的一種原發(fā)于膀胱上皮細胞的惡性腫瘤,是一類惡性程度較高的疾病。
膀胱癌的發(fā)病因素包含很多,其中主要是與患者的基因和環(huán)境因素有關(guān)。
在以往研究中發(fā)現(xiàn),膀胱癌的發(fā)生是由膀胱細胞內(nèi)單個或多個基因的改變決定的,主要是癌基因的激活和抗癌基因的失活,因此,對膀胱的分子遺傳學研究不僅有助于腫瘤的診斷及預后判斷,而且對腫瘤發(fā)病機制及腫瘤基因的研究均有著十分重要的意義。
現(xiàn)在膀胱腫瘤的標記物有許多,我們主要研究的是E-鈣黏素(E-cadherin,E-cad),E-cad基因定位于16q22.1,cDNA全長48kb,開放閱讀框架長2652bp,編碼含884個氨基酸的多肽[1];基因組DNA長達100kb,含16個外顯子,15個內(nèi)含子。
E-cad在體內(nèi)有兩種存在形式,組織型和可溶型[2]。
研究發(fā)現(xiàn)E-cad是維持組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,使細胞能正常有序的進行增殖、分化,從而避免細胞失控性生長,而抑制腫瘤的形成。
但是在腫瘤細胞中,特別是惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)E-cad的功能會出現(xiàn)不穩(wěn)定,主要表現(xiàn)是表達下降、缺失,或者是E-cad與細胞骨架連接的破裂,異常定位[3]。
以往的研究主要是通過免疫組織化學方法進行研究,本次實驗采用免疫組織化學和RT-PCR法檢測E-cad在正常膀胱組織和膀胱癌組織中的表達,通過分析正常膀胱組織和膀胱癌組織中E-cad的蛋白水平上的表達和基因水平上的表達相互關(guān)系,為膀胱癌的發(fā)生、診斷以及治療提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。
1材料和方法1.1實驗材料新鮮的正常膀胱組織10例,膀胱移行細胞癌組織31例,標本來自佳木斯大學附屬第一醫(yī)院和佳木斯市中心醫(yī)院。
1.2實驗主要試劑瓊脂糖(美國Sigma公司),Trizol(美國Invitrogen公司),引物、GAPDH、DEPC、RNA提取試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)有限公司)、TaqDNA聚合酶、2000bpMarker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司),兔抗人E-cad多克隆抗體、枸櫞酸緩沖液、PBS緩沖液、DAB顯色試劑盒、SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。
1.3實驗方法RT-PCR法提取RNA及逆轉(zhuǎn)錄反應所使用的所有器具均在使用前經(jīng)濃酸浸泡過夜,流水沖凈后,0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水浸泡過夜,高溫高壓滅菌后烤干密封保存?zhèn)溆谩?/p>
PCR操作所用耗材只需高溫高壓蒸氣滅菌。
1.3.1提取總RNA并檢測其質(zhì)量勻漿處理組織,離心后取澄清的勻漿液加入氯仿,劇烈振蕩。
再次離心取上層水相轉(zhuǎn)移到新的離心管中加入無水乙醇,混勻后離心棄掉流出液。
重復上一步一次。
再次離心去除殘余液體。
加入無RNase的水后離心,放置保存。
溶解好的RNA溶液,加DEPC水稀釋,微量比值,確定RNA純度和濃度,糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。
1.3.2反轉(zhuǎn)錄依據(jù)試劑反應體系對提取的mRNA進行反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)錄后的cDNA-20℃保存。
將反轉(zhuǎn)錄的cDNA擴增。
1.3.3RT-PCR標準曲線制備,瓊脂糖凝膠電泳。
利用天能GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)對RT-PCR實驗所得凝膠進行分析,得出數(shù)據(jù)。
1.3.4免疫組化(SABC)法取正常膀胱組織和膀胱癌組織的免疫組化標本按以下步驟進行:
室溫下,10%甲醛溶液浸泡標本24h。
脫水,石蠟包埋,切片。
常規(guī)石蠟切片脫蠟至水。
甲醇-H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物,梯度乙醇水化后用PBS沖洗。
微波修復后加血清覆蓋組織(5%BSA),水浴箱加熱。
加一抗,4℃冰箱過夜。
PBS沖洗,加滴二抗,水浴箱加熱,PBS沖洗后加SABC,再次水浴箱加熱并沖洗。
加DAB顯色劑,靜止,上色,入水阻斷,蘇木素復染。
入水,入鹽酸酒精,入水酚化,去蘭。
梯度乙醇脫水,二甲苯透明,樹脂封片,光鏡下觀察,計數(shù)、拍照。
1.4結(jié)果評定染色結(jié)果判定:
E-cad陽性細胞為細胞膜或細胞漿著棕黃色,細胞膜染色呈顆粒或線狀,細胞漿染色呈斑片狀。
E-cad表達分3級:
陰性(-),細胞無棕色染色且陽性細胞數(shù)10%;陽性(+),細胞淺棕黃色染色且陽性細胞數(shù)為10%~50%;強陽性(++),細胞棕黃色染色且陽性細胞數(shù)50%。
1.5統(tǒng)計學處理應用SPSS16.0ForWindows軟件進行統(tǒng)計分析。
2結(jié)果2.1RT-PCR法E-cad的檢測E-cad在膀胱癌組織中光密度值明顯低于正常膀胱組織的光密度值見表1,E-cad在膀胱癌組織的表達明顯低于正常膀胱組織的表達。
RT-PCR法檢測E-cad在正常膀胱組織和膀胱癌組織的光密度值變化2.2免疫組化E-cad的檢測正常膀胱黏膜組織為陽性表達,膀胱發(fā)生癌性病變時表達低或不表達。
通過免疫組化法發(fā)現(xiàn)E-cad在膀胱癌組織中的陽性表達率為32.39%(23/71),正常膀胱黏膜組織表達的陽性率為100%,E-cad在膀胱癌組織中的表達明顯低于正常組織。
免疫組化法分析E-cad在正常膀胱組織和膀胱癌組織的表達3討論近年來研究發(fā)現(xiàn)E-cad在膀胱中具有黏附性,在正常膀胱黏膜中的E-cad均會出現(xiàn)陽性表達,膀胱癌E-cad出現(xiàn)低表達或不表達[4,5]。
本實驗使用免疫組織化學方法對正常膀胱組織和膀胱癌組織中的E-cad進行了檢測,發(fā)現(xiàn)E-cad蛋白在膀胱癌組織中的陽性表達率為32.39%(23/71),正常膀胱黏膜組織表達的陽性率為100%,E-cad在膀胱癌組織中的表達明顯低于正常組織。
本實驗通過RT-PCR法從基因水平檢測正常膀胱組織和膀胱癌組織中E-cad的表達,E-cad在正常膀胱組織所得光密度值高于膀胱癌組織的光密度值,經(jīng)統(tǒng)計學分析,E-cad在膀胱癌組織中的表達與正常膀胱組織表達相比差異有顯著性。
無論是在蛋白水平還是基因水平上,E-cad在膀胱癌組織中的表達都低于正常膀胱組織的表達。
這提示E-cad抑制在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。
通過本次實驗研究能為膀胱癌的發(fā)生、診斷和治療等提供一定的基礎(chǔ)理論依據(jù)。
【參考文獻】[1]BerxG,StaesK,VanHengelJ,etal.CloningandcharacterizationofthehumeninvasionsupperssorgeneE-cadherin(CAH1)[J].Genomics,1995,26(2):281289[2]MatsuyoshiN,TanakaT,OkamotoH,etal.SolubeE-cadherinanovelcutaneousdiseasemarker[J].BrJDermatol,1995,132:745749[3]FrixenUH,NagamineY.Stimulationofurokinase-typeplasminogenactivatorexpressionbyblockageofE-cadherin-dependentcell-celladhesion[J].CancerRes,1993,53(15):36183623[4]代新年,楊豐,紀祥瑞.E-cad、-cat和Ki-67在膀胱癌的表達及意義[J].實用醫(yī)藥雜志,2008,8:
900902[5]許勵,湯琪樂,徐文娟,等.E-cadherin、-catenin和MMP2在膀胱癌中的表達及預后意義[J].診斷病理學雜志,2003,6:
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