PDECGF特異性RNA抑制片段誘導(dǎo)裸鼠膀胱癌細胞凋亡探究

1/1PDECGF特異性RNA抑制片段誘導(dǎo)裸鼠膀胱癌細胞凋亡探究1PDECGF特異性RNA抑制片段誘導(dǎo)裸鼠膀胱癌細胞凋亡探究PDECGF特異性RNA抑制片段誘導(dǎo)裸鼠膀胱癌細胞凋亡探究作者：

金寧張靈肖博晗常喜華【摘要】目的利用RNA干擾技術(shù)在裸鼠膀胱癌動物模型中通過抑制靶向沉默血小板源性內(nèi)皮生長因子基因（PDECGF）的表達，探討其在活體動物腫瘤組織中的作用。

方法將pppPDECGFpp及p穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的陽性T4細胞株及其他對照組直接接種于裸鼠皮下，觀察腫瘤細胞生長及成瘤情況、測定腫瘤體積的變化；免疫組化檢查PDECGF蛋白表達；TUNEL法檢測腫瘤細胞凋亡。

結(jié)果裸鼠體內(nèi)成瘤實驗發(fā)現(xiàn)ppRNA組第p天時成瘤率只有50%，而其他各組成瘤率為p00%。

ppRNA組生長速度明顯慢于其他3組，ppRNA組不僅成瘤延遲，且生長速度明顯慢于其他3組(P＜0.0p)。

免疫組化證實ppRNA組腫瘤組織PDECGF蛋白表達最低;TUNEL檢測ppRNA組細胞凋亡數(shù)明顯多于其他3組(P＜0.05)。

結(jié)論PDECGFppRNA載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株體內(nèi)實驗可見膀胱癌細胞成瘤率降低，成瘤延遲及腫瘤生長速度減慢，癌細胞凋亡增多。

PDECGFppRNA在裸鼠體內(nèi)依然對膀胱癌細胞有明顯抑制作用。

【關(guān)鍵詞】膀胱癌；PDECGF；RNA干擾；凋亡2【Abptract】ObjectpveTorepearchthePDECGFgenepfunctponontheanpmaltumorbypnhpbptpngtheexpreppponofthePDECGFpnthenudempcebladdercarcpnomaanpmalmodelvpappRNApyptem.MethodpThebladdercarcpnomanudempcemodelwapeptablpphedbytheptabletranpfectedbladdercarcpnomacellptoobpervetumorpgrowthanddetectthetumorcellpapoptopppbyTUNELkptwhpchcanappayplpcedDNApntumorcellp.RepultpTheformrateoftumorwaponly50%pnpptdayafterpnoculatponofT4cellpnppRNAgroupthroughbearpngtumorexperpmentpnvpvo.Therateofformtumorwapp00%pnothergroupp.ThegrowthvelocptywapplowerpnRNApgroupthanthatofothergroupp(P＜0.0p).TheexpreppponofPDECGFprotepnwaploweptpnppRNAgroup.ThecellapoptopppcountppnppRNAgroupwapmoptthanthatofothergrouppppgnpfpcantly(P＜0.05).ConclupponpPDECGFppRNAcanptplldepreppthebladdertumorpnnudempcewpththedecreapedtumorformpngrateandprolongedtumorformpngtpmeandthereducedtumorgrowthppeedandthepncreapedapoptopppcellp.【Keywordp】Bladdercarcpnoma;PDECGF；RNA3pnterference;Apoptoppp血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）與血管形成密切相關(guān)，是最重要的一種血管生長因子。

腫瘤組織VEGF表達直接影響著腫瘤血管的生長和原發(fā)瘤的生長與浸潤〔p〕。

血小板源性內(nèi)皮生長因子基因（PDECGF）作為VEGF超家族中的一分子在腫瘤的發(fā)病過程中具有重要作用。

腫瘤生長具有血管依賴性，惡性腫瘤的侵襲性生長、轉(zhuǎn)移及其預(yù)后依賴于血管生成，沒有血管網(wǎng)絡(luò)的滋養(yǎng)和帶走新陳代謝廢物腫瘤細胞就無法生存〔〕。

抑制血管生成能有效抑制腫瘤生長，因此抑制血管生成技術(shù)或藥物可用于治療腫瘤。

封閉PDECGF基因是治療實體腫瘤的新思路。

通過抑制或阻斷VEGF在腫瘤組織表達，切斷PDECGF對血管內(nèi)皮細胞的作用，抑制腫瘤的血管生成，對抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移有重要意義。

前期研究己經(jīng)在體外實驗中得到較為肯定的PDECGFRNAp抑制膀胱癌細胞的效果〔3〕。

為了進一步研究RNAp的體內(nèi)抑瘤情況，通過裸鼠皮下成瘤實驗檢測生物體內(nèi)pppPDECGFp對T4細胞致瘤能力的影響，為證實臨床基因治療膀胱腫瘤可行性打下初步的實驗基礎(chǔ)，以為臨床治療膀胱癌提供新的切入點。

p材料與方法p.ppppPDECGF穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的構(gòu)建按分子克隆技術(shù)將pppPDECGFpp及p等質(zhì)粒〔3〕轉(zhuǎn)染入T4細胞，經(jīng)G4p8篩選，用未轉(zhuǎn)染的T4細胞做對照。

對照細胞完全死亡后，4再次用G4p8篩選。

分為對照組、空載體組、ppRNAp對照組以及ppRNA組。

p.裸鼠膀胱癌模型的建立裸鼠共4只，隨機分為4組，每組各6只。

p00ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞直至對數(shù)生長期，0.5%胰酶消化并計數(shù)，離心后取00p(pp05個細胞/l)懸浮細胞，加入不含血清的DMEM制成細胞懸液，選擇裸鼠右側(cè)臀部外側(cè)，消毒后進行皮下注射；每日觀察成瘤情況，成瘤后每3d稱量裸鼠體重及測量腫瘤大小，記錄腫瘤潛伏期及繪制腫瘤生長曲線，計算成瘤率、腫瘤抑制率和腫瘤生長指數(shù)。

第30日脫頸法處死裸鼠，解剖取腫瘤組織，稱重，做病理切片檢查。

用公式分別計算腫瘤體積、腫瘤抑制率和腫瘤生長指數(shù)。

計算公式如下：

腫瘤體積=腫瘤長徑腫瘤短徑0.5。

腫瘤抑制率(%)=(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重p00%。

p.3裸鼠腫瘤組織切片HE染色瘤體常規(guī)福爾馬林固定，制作石蠟切片；脫蠟后，蘇木精染色p0mpn，水沖洗后，加鹽酸酒精(p%鹽酸，70%酒精)8mpn，自來水沖洗p5mpn，逐級脫水，70%，80%，90%酒精各5mpn，進行伊紅染色5mpn，再浸入90%酒精5mpn，次p00%酒精各5mpn，脫水干燥，封片照相。

p.4裸鼠腫瘤組織PDECGF免疫組化按照常規(guī)方法進行。

一抗孵育濃度為p∶50(PBS稀釋)，生物素化的二抗孵育濃5度為p∶00，計算機病理切片圖像采集和分析，每張切片免疫組化半定量分析，取5個高倍鏡下視野(400)，統(tǒng)計圖片陽性染色細胞的平均積分光密度(IOD)值，以判斷陽性染色的差異。

p.5TUNEL法檢測凋亡細胞數(shù)采用TUNEL反應(yīng)檢測試劑盒測定腫瘤組織細胞內(nèi)DNA的片段化，按說明書操作。

400倍光學(xué)顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野，每個視野計算p00個細胞，平均每p00個細胞中凋亡細胞的個數(shù)為凋亡率(AI)。

p.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSSpp.0統(tǒng)計軟件包進行Wplcoxon檢驗和onewayANOVA分析。

結(jié)果.p成瘤潛伏期及成瘤率4組裸鼠接種細胞后，對照組、空載體組、ppRNAp組于接種細胞后第周左右肉眼均可見局部腫瘤形成，成瘤率達p00%；而ppRNA組，在近接種細胞后第p天時，6只中僅3只局部形成腫瘤，成瘤率50%，另外3只在第30天(處死當(dāng)日)仍無腫瘤形成。

.各組腫瘤體積隨時間變化比較對照組、空載體組和ppRNAp組生長速度差異不明顯，ppRNA組生長速度明顯慢于另外3組，ppRNA不僅成瘤延遲，且生長速度明顯慢于其他3組(P＜0.0p)。

見表p。

6.3腫瘤抑制率第30日末對照組、空載體組、ppRNAp組和ppRNA組腫瘤平均重量分別為(3030.0p7.4)、（87.5p55.6）、（975.0p57.5）、（p35.0p0.8）mgmg。

ppRNA組的腫瘤抑制率（56.43%）明顯高于空載體組（.05%）和ppRNAp組（6.93%）(P＜0.0p)。

.4各組HE切片結(jié)果對照組、空載體組、ppRNAp組腫瘤均呈浸潤性生長，明顯侵及周圍肌肉組織；相比于對照組而言，ppRNA組均出現(xiàn)了明顯的腫瘤組織生長不良的現(xiàn)象，見圖p。

對照組和空載體組、ppRNAp組裸鼠腫瘤組織切片均未見明顯異常改變。

.5腫瘤組織細胞凋亡TUNEL結(jié)果TUNEL陽性染色結(jié)果為黃褐色。

ppRNA組細胞凋亡數(shù)（78）明顯多于對照組（p）、空載體組（30）、ppRNAp組（6）（P＜0.0p）。

見圖p。

.6各組免疫組化結(jié)果PDECGF蛋白主要為細胞漿表達，陽性染色主要為細胞漿染色呈棕褐色。

對照組、空載體組和ppRNAp組鏡下約80%的面積為陽性染色，ppRNA組染色呈現(xiàn)不均勻性，鏡下約40%的面積為陽性染色，與其他3組結(jié)果之間有顯著差異(P＜0.0p)。

ppRNA組腫瘤組織與周圍組織分界較清楚，未見明顯浸潤，見圖。

圖p對照組和ppRNA組裸鼠腫瘤HE染色（00）和TUNEL染色結(jié)果（400）3討論作為VEGF超家族中的一分子，PDECGF主要通過旁分泌機7制及與兩種在血管內(nèi)皮細胞上選擇性表達的高親和力酪氨酸受體(Fltp和Flkpp/KDR)的結(jié)合來發(fā)揮促進內(nèi)皮細胞增殖和增加血管通透性的作用，進而促進腫瘤的血管新生，增強腫瘤組織的代謝能力，使腫瘤的局部侵襲、轉(zhuǎn)移能力及病理惡性度不斷提高〔4～5〕。

腫瘤血運豐富時PDECGF及其他癌基因也會進一步過度表達，如此循環(huán)形成惡性病理生理環(huán)，促使腫瘤組織不斷惡變〔6〕。

研究證明人膀胱癌PDECGF基因的高表達水平和膀胱癌的病理分級、分期呈正相關(guān)，也恰好證明上述的觀點〔7〕。

PDECGF基因的這種腫瘤病理分級、分期的正相關(guān)性是VEGF超家族中其他基因所不具備的。

本實驗采用裸鼠建立膀胱癌動物模型，研究pppPDECGFp轉(zhuǎn)染人膀胱癌T4細胞在裸鼠體內(nèi)成瘤及腫瘤生長情況，探討生物活體對RNAp的影響因素。

本實驗結(jié)果顯示PDECGF表達量下降，而對照組、空載體組和ppRNAp組腫瘤呈浸潤性生長，提示PDECGFppRNA載體轉(zhuǎn)染細胞株可裸鼠體內(nèi)抑制PDECGF基因的表達，轉(zhuǎn)染細胞株模型建立成功。

ppRNA不僅延遲成瘤，且生長速度明顯降低。

且通過RNAp的方法可使裸鼠體內(nèi)種植瘤的PDECGF基因沉默，抑制腫瘤細胞增殖，可以初步肯定PDECGF基因與膀胱癌細胞的增殖和侵襲密切相關(guān)，其高表達利于膀胱癌細胞增殖，在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，PDECGF促進腫瘤血管生長及腫瘤細胞增殖，使腫瘤生長和浸潤加快；而抑制膀胱癌細胞8PDECGF基因表達就可抑制膀胱癌細胞增殖，限制腫瘤發(fā)展及轉(zhuǎn)移，阻礙腫瘤惡性度進一步增高。

本實驗發(fā)現(xiàn)ppRNA組腫瘤細胞凋亡比空載體組和ppRNAp組增多。

研究提示腫瘤細胞能在體內(nèi)增殖主要是細胞凋亡受到抑制造成的，使腫瘤細胞不斷地增長并浸潤其他組織。

加速腫瘤細胞凋亡過程或擴大凋亡細胞數(shù)量可達到抑制腫瘤生長的作用，提示抑制PDECGF基因表達可誘發(fā)較多腫瘤細胞凋亡，增大腫瘤細胞凋亡數(shù)量，從而起到治療作用。

本實驗在裸鼠體內(nèi)應(yīng)用能高效特異阻斷基因表達的RNAp技術(shù)，使膀胱癌腫瘤增殖受到抑制，在RNAp技術(shù)用于治療哺乳動物體內(nèi)腫瘤方面進行了有益的嘗試。

相信有望在不久的將來RNAp技術(shù)可以應(yīng)用于臨床治療腫瘤疾病患者。

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