PCR實驗室操作流程11

第頁乙型肝炎病毒(HBVDNAPCRABI7300)檢側(cè)標準操作程序一、INFORMATIONFORTEST檢測信息項目名稱乙型肝炎病毒核酸方法聚合酶鏈反應(yīng)方法依據(jù)衛(wèi)生部《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第三版（2019）第七篇第六章第一節(jié)二、ANALYTICALPRINCTPLE檢測原理聚臺酶鏈式反應(yīng)(PCR〕可對特定核苷酸片段進行指數(shù)級的擴增，而實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在實時熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學物質(zhì)，熒光物質(zhì)有兩種：熒光探針和熒光染料。我們目前是使用TaqMan熒光探針的檢測原理：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’一3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，熒光信號強度也等比例增加（圖一）。這樣就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。三、操作步驟（一）試劑配制1、進入試劑準備區(qū)，開啟冰箱冷凍層取出HBV-DNA檢測試劑盒。查看外包裝盒(包括生產(chǎn)批號、有效期)，無誤后拆開試劑盒，取出核酸提取液、反應(yīng)液及Taq酶(核對核酸提取液、HBVPCR反應(yīng)液及Taq酶管上批號及試劑外包裝盒批號是否一致)（圖1），不一致則不可使用，需更換新的試劑。室溫平衡20min，完全融化后2000rpm離心備用。2、核酸提取液的分裝（1）取0.5ml離心管架置于超凈工作臺內(nèi)(開機前用紫外線消毒30分鐘)，用右手拿起鑷子逐個將離心管放入離心管架（注意應(yīng)夾住離心管外壁，不能碰到管內(nèi)壁)，擺放順序為橫列從左往右擺，豎列為從上往下隔行排，離心管個數(shù)為n(n=樣本數(shù)+對照品+質(zhì)控品)。完成后將鑷子放回原位（圖2）。（2）用移液器準確吸取核酸提取液50ul分裝至0.5m1離心管中(左上角第一排開始，從左住右依次加入）。因核酸提取液內(nèi)含固體沉淀顆粒物，為使顆粒均勻分布，故每次取樣時都要用移液器反復(fù)吸打3-4次（圖3）。分裝完畢后將移液器量程歸位。（3）加完一架后用右手拿鑷子將離心管拿起，左手大拇指和中指夾緊離心管下部，然后用食指將蓋子蓋上，順序為：從右下角第一個開始，從右住左依次蓋上（圖4），離心管蓋全部蓋完后，通過傳遞窗轉(zhuǎn)移至標本處理區(qū)。3、HBV-DNA反應(yīng)液的配制每批需設(shè)置空白對照、陰性對照、臨界陽性對照（同時檢測低值陽性質(zhì)控品，則無需再檢測臨界陽性對照〕、陽性質(zhì)控品、陽性標準品。所需每批需配制數(shù)n=樣本數(shù)+對照品+陽性標準品+質(zhì)控品，每個測試反應(yīng)體系配制如下表：試劑HBVPCR反應(yīng)液Taq酶用量（ul）35.70.3（1）每盒HBV-DNA試劑可檢測32人份，根據(jù)每日需檢測標本份數(shù)計算出每批所需HBVPCR反應(yīng)液和Taq酶用量（例有111人份需要進行檢測，則有3盒試劑可直接使用10ul移液器將Taq酶加入HBVPCR反應(yīng)液中，另有111-3*32=15人份試劑需將HBVPCR反應(yīng)液和Taq酶使用移液器按反應(yīng)體系比例吸取至1.5m1離心管中配制（圖5）。（2）取出離心后備用的HBVPCR反應(yīng)液和Taq酶，按上述要求配制后用旋渦振蕩器振蕩混勻5-10sec，然后再用離心機2000rpm離心10sec備用（圖6）。（3）從操作臺面上拿取HBV-DHA試劑配制盒(可選用空余的200u1槍頭盒)至超凈工作臺內(nèi)，打開配制盒并用記號筆在相應(yīng)的孔位右旁按順序編號（圖7）。編號規(guī)則為：樣本擴增反應(yīng)管對應(yīng)的孔位按相應(yīng)的樣本流水號編寫、陽性質(zhì)控品反應(yīng)管對應(yīng)的孔位編“Q”（如有高值則標為H，低值為L)，陰性對照品孔位編“-”，臨界陽性對照對應(yīng)的孔位編“±”，空白對照對應(yīng)的孔位編“B”，1號標準品對應(yīng)的孔位編“S1”，2號標準品對應(yīng)的孔位編“S2”，依此類推。（4）編號完畢后，用右手拿起鑷子夾起反應(yīng)管(ABI7300使用的是八聯(lián)一薄壁反應(yīng)管，鑷子應(yīng)夾住反應(yīng)管外壁，不可接觸到內(nèi)壁。按（圖8）所示方向依次將所有反應(yīng)管(反應(yīng)管數(shù)=n)隔列擺放到配置盒上。（5）從離心機中取出已混好Taq酶的PCR反應(yīng)液，用移液器(量程調(diào)至36ul)，準確吸取反應(yīng)液并按從上到下、從左至右的順序依次加至反應(yīng)管中，注意：吸頭應(yīng)深入到反應(yīng)管底部，放液時應(yīng)緩慢，切勿形成氣泡（圖9）。全部加樣完畢后將配制盒通過傳遞窗轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。（二）標本處理1、標本、質(zhì)控品及對照品的處理（1）從冰箱冷凍室取出HBVDNA陽性質(zhì)控品、陰性對照品，室溫平衡20min待其完全融化。ADICONP00012019ADICONP00012019-01-122、從傳遞窗中取出試劑準備區(qū)分裝好核酸提取液的離心管架，移至生物安全柜內(nèi)在管蓋上用記號筆寫上阿拉伯數(shù)字1、2、3、，陽性質(zhì)控管標上“Q”（如有高值則標為H，低值為L)，陰性對照管標上“-”，臨界陽性對照管標上“±’，。離心管蓋上標記的是1，就表示該管要加入流水號為P0001的標本（圖10）。注意：每個離心管的編號方向都應(yīng)朝向管口開啟的方向。（圖11）3、去除標本管蓋：將標本從前處理取至標本準備區(qū)，按排列順序依次去除樣本管上的橡膠塞。具體操作為：在生物安全柜中，左手拿起血清管并固定，右手拇指和中指涅緊橡膠塞，右手食指輕輕頂住橡膠塞頂部凹面，逆時針方向輕輕旋下橡膠塞后廢棄于裝有消毒液的垃極桶（圖12）。（注意：手指切勿接觸到血清管口或碰觸到血清，如手套上有血清則需及時跟換新的手套；待所有樣本管蓋都去除完畢后，也需更換新的手套。)4、樣本及對照品的處理：a、左手拿起樣本，用量程為200u1調(diào)至50u1的移液器準確吸取樣本(注：為保證樣本的均一性和吸樣準確，每次取樣時需用移液器將樣本吸打3-5次；吸樣時移液器套筒不可接觸到樣本管內(nèi)壁)（圖13）b.吸樣完畢后，將樣本管放至另一試管架中(切勿不可將樣本放回原試管架位)（圖14）。c.再用左手按前面所述樣本流水號和離心管編號的對應(yīng)關(guān)系拿起相應(yīng)的離心管，打開離心管蓋(注：單手操作，食指和中指固定離心管，拇指稍向后上方發(fā)力打開管蓋，手指切勿碰到離心管口和管蓋內(nèi)側(cè))（圖15）。d.管蓋完全打開后，用左手食指、拇指和中指固定離心管，將吸頭中的樣本全部打入離心管底部，輕輕吸打混勻3-5次。（圖16）e.加樣完畢后棄槍頭干盛有消毒液的垃極桶中(注：一個吸頭只能用于一個樣本的吸樣，禁止使用一個吸頭重復(fù)吸取不同樣本)。同時蓋上離心管蓋并放回離心管架(放回的位置需另起一行，切不可放回原位)，繼續(xù)處理下一個樣本。對照品和質(zhì)控品同病人樣本一樣處理。（圖17）f.待一架離心管全部加樣完成后用振蕩混勻器充分振蕩混勻10-15秒。g.左手將混勻后的離心管轉(zhuǎn)移至恒溫金屬浴上(注：離心管需對稱的放置在恒溫金屬浴相匹配的孔槽內(nèi))，用計時器計時，100℃誤差不超過±1℃〕干浴10min(誤差不超過±30sec)。（圖18）干浴時用離心管架置于加熱的離心管上，防止離心管蓋因加熱爆開導(dǎo)致標本間的污染（圖19）。h.十分鐘后〔前后不超過半分鐘)，右手用攝子夾起橡皮墊從恒溫金屬浴中拿出離心管（圖20）。I.將上述離心管按順序?qū)ΨQ放入低溫高速離心機轉(zhuǎn)子孔內(nèi)，擺放離心管時要將離心管開口朝內(nèi)，蓋上轉(zhuǎn)子蓋及離心機蓋后，12,OOOrpm離心10min(注：離心時需在轉(zhuǎn)子孔內(nèi)放置0.5m1離心管專用適配器（圖21）。j.待離心結(jié)束后，取出離心管并按編號順序依次擺放在離心管架上(參照（圖10）的排列方式)并4'C冰箱保存?zhèn)溆?；若當夭不使用，則應(yīng)保存在一20'C條件下，使用前置室溫平衡20min，再以12,OOOrpm離心10min。5、待全部樣本加樣完畢更換手套，左手用鑷子夾起反應(yīng)管蓋的一側(cè)的延伸段(不要碰到管蓋)，然后用右手大拇指從左住右依次蓋緊管蓋(不要碰到其他未蓋的反應(yīng)管口)（如圖22）。6、將反應(yīng)管連同試劑配置盒通過傳遞窗傳至擴增分析