IL1β、幽門(mén)螺桿菌cagA與人慢性胃炎的關(guān)系

1/1IL1β、幽門(mén)螺桿菌cagA與人慢性胃炎的關(guān)系IL1、幽門(mén)螺桿菌cagA與人慢性胃炎的關(guān)系作者：

喬文，李娜，李長(zhǎng)順，薛揮【摘要】目的探討IL1、幽門(mén)螺桿菌cagA基因(cytotoxinA)和人慢性胃炎之間的相關(guān)性。

方法收集西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胃鏡檢查的胃活檢標(biāo)本，經(jīng)甲醛固定，制備石蠟切片，進(jìn)行病理分型和IL1SABC免疫組化染色;同時(shí)作幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)，16srRNAPCR鑒定，檢測(cè)cagA基因。

結(jié)果慢性萎縮性胃炎組IL1表達(dá)的陽(yáng)性率高于慢性淺表性胃炎組(Plt;0.05);慢性萎縮性胃炎組中，異型增生組IL1表達(dá)的陽(yáng)性率高于腸腺化生組(Plt;0.05)。

幽門(mén)螺桿菌cagA基因陽(yáng)性率在慢性萎縮性胃炎組和慢性淺表性胃炎組無(wú)顯著性差異(Pgt;0.05)，異型增生組cagA基因陽(yáng)性率和腸腺化生組亦無(wú)顯著性差異(Pgt;0.05)。

結(jié)論IL1在慢性胃炎的轉(zhuǎn)歸和發(fā)展中具有比cagA基因更高的預(yù)測(cè)價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】IL1;幽門(mén)螺桿菌;cagA基因;慢性胃炎ABSTRACT:ObjectiveTodiscussthecorrelationbetweenIL1,cagAofHelicobacterPyloriandchronicgastritis.MethodsWecollectedthegastricbiopsyspecimensbygastroscopyforpathologicexaminationandcultureofHelicobacterpylori.Inthemeantime,IL1wasdetectedbySABChistoimmunologyandcagAgenewastestedbypolymerasechainreaction.ResultsThepositiverateofIL1inchronicatrophicgastritisgroupwashigherthanthatinchronicsuperficialgastritisgroup(Plt;0.05).Inthechronicatrophicgastritisgroup,thepositiverateofIL1indysplasiagroupwashigherthanthatinintestinalmesplasiagroup(Plt;0.05).TherewasnoobviousdifferenceinthepositiverateofcagAgenebetweenchronicatrophicgastritisgroupandchronicsuperficialgastritis(Pgt;0.05).TherewasnoobviousdifferenceinthepositiverateofIL1betweendysplasiagroupandintestinalmesplasiagroup(Pgt;0.05).ConclusionIL1hasahighervaluethancagAgeneinpredictingtheprognosisofchronicgastritis.KEYWORDS:interleukin1;Helicobacterpylori;cagA;chronicgastritis幽門(mén)螺桿菌(Helicobacterpylori,Hp)是一種革蘭氏陰性染色菌，寄居于人的胃黏膜中。

在環(huán)境因素中，Hp感染是引起胃炎、消化性潰瘍和胃癌的主要因素[1]。

目前世界上有半數(shù)以上的人被Hp感染，但其中大多數(shù)為無(wú)癥狀感染者，只有極少數(shù)發(fā)展成胃癌，因此目前認(rèn)為可能既存在Hp感染的因素，也有宿主本身的因素。

在Hp致病機(jī)制中[2]，其分泌的毒力因子細(xì)胞毒素相關(guān)基因(cytotoxinassociatedgeneA,cagA)所編碼的cagA毒素是Hp重要的毒力因子之一，cagA蛋白的表達(dá)有賴(lài)于cagA基因的存在。

IL1可抑制胃酸分泌，持續(xù)的低酸分泌可發(fā)展成為胃萎縮，增加了宿主胃癌發(fā)生的危險(xiǎn)性[3]。

本研究旨在探討宿主IL1、幽門(mén)螺桿菌cagA基因和慢性胃炎之間的相互關(guān)系。

1材料與方法1.1材料1.1.1標(biāo)本來(lái)源200例胃黏膜標(biāo)本均取自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胃鏡室接受胃鏡檢查的患者。

取材部位距幽門(mén)口3～5cm處的胃竇小彎側(cè)黏膜4塊，分別送病理制備石蠟切片和置于0.5mL布氏培養(yǎng)液中用于細(xì)菌分離培養(yǎng)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：

有外科手術(shù)史;感染HBsAg、HIV病毒;有活動(dòng)性胃腸出血;在接受胃鏡檢查前1月內(nèi)服用激素或其他免疫抑制劑、抗體及質(zhì)子泵抑制劑。

經(jīng)病理證實(shí)為慢性淺表性胃炎64例，慢性萎縮性胃炎136例，其中腸上皮化生75例、異型增生61例。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)材料哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基和布氏肉湯粉購(gòu)自上海衛(wèi)生防疫站。

HpcagA和16srRNAprimer由上海生物工程技術(shù)公司合成，primer序列見(jiàn)cagA。

primer1：

5ATAATGCTAAATTAGACAACTTGAGCGA3，primer2：

5TTAGAATAATCAACAAACATCACGCCAT3;16srRNA：

primer1：

5TGGCAATCAGCGTCAGGTAATG3，primer2：

5GCTAAGAGATCAGCCTATGTCC3。

白介素1多克隆抗體由SantaCruzBiotechnology公司提供。

SABC免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

TaqDNA聚合酶購(gòu)自西安鼎國(guó)有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)菌株8823、60190由英國(guó)ATHERTONJC博士惠贈(zèng)。

1.2方法1.2.1幽門(mén)螺桿菌的培養(yǎng)及鑒定將所取組織在含有4mL生理鹽水的無(wú)菌勻漿器中研磨成勻漿，分別吸取0.5mL接種于哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基，然后用接種環(huán)將其均勻劃開(kāi)，放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱中，抽氣換氣1次。

在微需氧條件下，37℃培養(yǎng)5d。

取1接種環(huán)幽門(mén)螺桿菌，生理鹽水稀釋后，涂于載玻片上，常規(guī)Gram染色，完成初步鑒定。

1.2.2模板DNA的制備刮去培養(yǎng)基平板上的可疑菌落，將其溶于500L生理鹽水中，-30℃冷凍20min，取出置于室溫15min，完全溶解，混勻后，再放入冰箱。

如此反復(fù)凍融3次后，4℃12000r/min離心15min，吸取上清液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.316srRNA基因PCRPCR反應(yīng)總體積25L。

PCR反應(yīng)體系包括：

10PCR緩沖液2.5L，4dNTP(250mol/L)2.5L，primer1(25mol/L)0.75L，primer2(25mol/L)0.75L，模板3L，TaqDNA聚合酶(5u/mL)0.5L，去離子水12L，MgCl23L。

反應(yīng)條件：

95℃變性5min(94℃1min，55℃1min，72℃1min)30個(gè)循環(huán)72℃7min4℃保存。

15g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

1.2.4cagA基因PCRPCR反應(yīng)總體積25L。

PCR反應(yīng)體系包括：

10PCR緩沖液2.5L，4dNTP(250mol/L)0.5L，primer1(25mol/L)0.75L，primer2(25mol/L)0.75L，模板5L，TaqDNA聚合酶(5u/mL)0.5L，去離子水15L。

反應(yīng)條件：

94℃變性5min(94℃30s，55℃30s，72℃1.5min)30個(gè)循環(huán)72℃5min4℃保存。

20g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

1.2.5胃黏膜的組織病理學(xué)診斷兩位病理醫(yī)師盲法閱片。

常規(guī)HE染色法，根據(jù)國(guó)際胃腸病的病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)確定胃黏膜活檢標(biāo)本的病理分型。

1.2.6IL1免疫組織化學(xué)染色對(duì)幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性者的組織切片進(jìn)行免疫組化染色。

常規(guī)脫蠟至水，每張切片加10g/LTritonX100工作液50L、37℃1h進(jìn)行抗原修復(fù)。

加50g/LBSA封閉液，室溫20min。

加1∶30稀釋的一抗兔IgG，4℃過(guò)夜，PBS洗滌2min3次。

加生物素化羊抗小兔IgG，37℃1h，PBS洗滌2min3次。

加SABC37℃40min，PBS洗滌5min4次。

DAB顯色。

蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片和顯微鏡下觀察。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。

cagA基因與慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、不典型性增生與慢性淺表性胃炎的關(guān)系采用2檢驗(yàn);IL1免疫組織化學(xué)染色與慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、不典型性增生與慢性淺表性胃炎的關(guān)系采用2檢驗(yàn)，腸上皮化生和不典型性增生的關(guān)系采用2檢驗(yàn)。

Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果2.1幽門(mén)螺桿菌的培養(yǎng)和鑒定幽門(mén)螺桿菌呈透明、針尖樣大小狀。

Hp涂片Gram染色鏡檢呈弧形、S形、海鷗狀彎曲菌或短桿菌。

16srRNA基因PCR產(chǎn)物為一條522bp的清晰電泳條帶(圖1)。

200例標(biāo)本中幽門(mén)螺桿菌菌株分離數(shù)為：

慢性淺表性胃炎32例，慢性萎縮性胃炎85例，其中腸上皮化生47例，非典型增生38例，合計(jì)分離菌株數(shù)117例。

2.2cagA基因PCR分析117株臨床分離的Hp中93株為cagA基因陽(yáng)性(圖2)，陽(yáng)性率79.5%。

其中25例慢性淺表性胃炎，68例慢性萎縮性胃炎，其中腸上皮化生37例、異型增生31例(表1)。

經(jīng)2檢驗(yàn)，慢性萎縮性胃炎組與慢性淺表性胃炎組比較，P=0.19;腸腺化生組與慢性淺表性胃炎組比較，P=0.22;異型增生組與慢性淺表性胃炎組比較，P=0.22，均無(wú)顯著性差異。

2.3IL1免疫組織化學(xué)染色I(xiàn)L1蛋白主要定位于胃黏膜細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒(圖3)。

隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率，30%為陽(yáng)性，lt;30%為陰性。

染色強(qiáng)度判定：

淺黃色為弱陽(yáng)性(-)，棕色為陽(yáng)性(+)，棕褐色為強(qiáng)陽(yáng)性()。

IL1在不同胃黏膜病變組織中的表達(dá)見(jiàn)表2。

經(jīng)2檢驗(yàn)，慢性萎縮性胃炎組與慢性淺表性胃炎組比較，P=0.00;腸腺化生組與慢性淺表性胃炎組比較，P=0.02;異型增生組與慢性淺表性胃炎組比較，P=0.00;腸腺化生組與異型增生組比較，P=0.01。

均有顯著性差異。

表2IL1在不同胃炎組中的表達(dá)3討論幽門(mén)螺桿菌與胃炎、消化性潰瘍及胃癌等許多疾病的發(fā)生有關(guān)。

世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)在1994年年鑒中已將其列為人類(lèi)胃癌的第一致癌原[4]。

然而世界上約有半數(shù)人口感染了Hp，但不同個(gè)體感染Hp的后果差異很大，有的為無(wú)癥狀的攜帶者，有的發(fā)生消化性潰瘍，而部分患者可發(fā)生胃癌，其中的機(jī)制尚不清楚。

宿主因素、幽門(mén)螺桿菌毒力型在發(fā)病中是否起很大的作用，是目前研究的重點(diǎn)。

幽門(mén)螺桿菌是一種微需氧的革蘭氏陰性菌，培養(yǎng)需要較高的條件，因此培養(yǎng)的陽(yáng)性率相對(duì)較低，本研究培養(yǎng)陽(yáng)性率僅為58.5%。

CagA蛋白是由cagA基因編碼的一種分子質(zhì)量為120～140ku的具有強(qiáng)免疫原性的外膜蛋白。

CagA的功能尚未完全明確。

胃癌的發(fā)生是一個(gè)多階段、多因素的過(guò)程。

腸上皮化生和非典型增生可能是幽門(mén)螺桿菌感染起主要作用的起始階段。

腸上皮化生是胃上皮類(lèi)似于腸上皮的形態(tài)學(xué)改變，是胃黏膜對(duì)持續(xù)性感染的一種適應(yīng)。

CRAANEN[5]報(bào)道在135例腸化生的的胃竇黏膜中Hp陽(yáng)性有95例(72.6%)。

胃黏膜上皮異型增生是重要的癌前病變。

陳孝等[6]用PCR法檢測(cè)胃黏膜幽門(mén)螺桿菌的研究結(jié)果顯示，存在胃黏膜異型增生組的幽門(mén)螺桿菌檢出率為89.5%。

本研究顯示在幽門(mén)螺桿菌陽(yáng)性的慢性淺表性胃炎、腸上皮化生和異型增生組中cagA基因的表達(dá)無(wú)顯著差異，所以cagA基因還不能作為慢性胃炎轉(zhuǎn)歸、惡變的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

白細(xì)胞介素1(interleukin1,IL1)是機(jī)體對(duì)幽門(mén)螺旋桿菌的免疫炎性反應(yīng)中最關(guān)鍵的功能細(xì)胞因子。

在胃炎、胃潰瘍時(shí)，胃黏膜上皮細(xì)胞具有較高的IL1mRNA表達(dá)率，顯示IL1參與了胃黏膜炎癥，上調(diào)IL8表達(dá)。

在生理?xiàng)l件下，IL1具有調(diào)控幾種類(lèi)型胃上皮細(xì)胞的功能，這些細(xì)胞包括分泌激素來(lái)調(diào)節(jié)胃酸分泌的細(xì)胞和壁細(xì)胞，是目前已知最強(qiáng)的胃酸分泌抑制因子。

幽門(mén)螺桿菌可刺激IL1分泌，是目前研究Hp相關(guān)性疾病的重要細(xì)胞因子。

TAKASHIMA等[7]證實(shí)IL1介導(dǎo)Hp感染時(shí)的低胃酸分泌，從而使胃黏膜上皮易發(fā)生腸化生和異型增生。

本研究結(jié)果顯示萎縮性胃炎組較慢性表型胃炎組IL1表達(dá)陽(yáng)性率高，腸上皮化生組較異型增生組表達(dá)陽(yáng)性率高，與TAKASHIMA的結(jié)果相一致，表明Hp誘導(dǎo)IL1分泌，使胃酸分泌受抑制。

IL1作為慢性胃炎轉(zhuǎn)歸的預(yù)測(cè)指標(biāo)具有一定的應(yīng)用前景。

【參考文獻(xiàn)】[1]廖愛(ài)軍，蘇琦，田鋒，等.白細(xì)胞介素1B基因多態(tài)性、幽門(mén)螺桿菌感染與胃癌發(fā)生的相關(guān)性[J].腫瘤防治研究