JJF(皖) 165-2023 實時熒光定量PCR儀校準規(guī)范

(皖)安徽省地方計量技術(shù)規(guī)范JJF（皖）165—2023實時熒光定量PCR儀校準規(guī)范CalibrationSpecificationforReal-TimeFluorescentQuantitativePolymeraseChainReactionAnalyzer2023-08-03發(fā)布 2023-10-01實施安徽省市場監(jiān)督管理局 發(fā)布JJF（皖）165—2023JJF（皖）165—2023JJF（皖）165—2023JJF（皖）165—2023JJF(皖)165-2023實時熒光定量PCR儀校準規(guī)范JJF(皖)165-2023CalibrationSpecificationforReal-TimeFluorescentQuantitativePolymeraseChainReactionAnalyzer歸 口單位安省醫(yī)計量術(shù)委會主起單安省計科學(xué)究院安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院本規(guī)范主要起草人：徐?。┩醭桑ǎǎ﹨⒓悠鸩萑耍嘿R輝（徽省量科研究）呂 吉安徽計量學(xué)研院）李 征北京電偉電子術(shù)有公司）JJF（皖）165—2023JJF（皖）165—2023JJF（皖）165—2023JJF（皖）165—2023II目 錄引言 （III）1 范圍 （1）引用文件 （1）術(shù)語和計量單位 （1）聚合酶鏈反應(yīng) （1）聚合酶鏈反應(yīng)分析儀 （1）實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)分析儀 （1）溫度示值誤差 （1）溫度均勻度 （1）溫度波動度 （2）溫度最大過沖量 （2）平均升溫速率 （2）平均降溫速率 （2）熒光染料 （2）熒光強度精密度 （2）閾值循環(huán)數(shù) （2）閾值循環(huán)數(shù)精密度 （2）溶解溫度 （2）溶解曲線 （2）熔解溫度漂移 （2）峰值強度 （3）通道峰值強度一致性 （3）線性靈敏系數(shù) （3）熔解溫度比 （3）樣本示值誤差 （3）樣本線性 （3）4 概述 （3）計量特性 （4）校準條件 （5）測量標準及其他設(shè)備 （5）校準項目和校準方法 （6）校準項目 （6）校準方法 （6）校準結(jié)果表達 （12）復(fù)校時間間隔 （13）附錄A 標準物質(zhì)的準備及配制 （14）附錄B PCR反應(yīng)體系的配制 （16）附錄C 測量不確定度評定示例 （17）附錄D 校準原始記錄格式 （23）附錄E 校準證書內(nèi)頁格式 （28）IIJJF（皖）165—2023JJF（皖）165—2023JJF（皖）165—2023JJF（皖）165—2023IIIIII1111引 言JJF1071-2010《國家計量校準規(guī)范編寫規(guī)則》、JJF1001-2011《通用計量術(shù)語及定義》、JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》共同構(gòu)成了支撐本規(guī)范編制工作基礎(chǔ)性系列文件。校準方法及計量特性等主要參考了JJF1527-2015《聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準規(guī)范》、YY/T1173-2010聚合酶鏈反應(yīng)分析儀、JJF1101-2019《環(huán)境試驗設(shè)備溫度、濕度參數(shù)校準規(guī)范》。本規(guī)范為首次發(fā)布。實時熒光定量PCR儀校準規(guī)范范圍本規(guī)范適用于實時熒光定量PCR儀的校準，其他類型PCR儀相同原理部分可參照本規(guī)范執(zhí)行。引用文件本規(guī)范引用了下列文件：JJF1527聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準規(guī)范YY/T1173聚合酶鏈反應(yīng)分析儀JJF1101環(huán)境試驗設(shè)備溫度、濕度參數(shù)校準規(guī)范凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本規(guī)范；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本規(guī)范。術(shù)語和計量單位PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）polymerasechainreactionPCR即聚合酶鏈反應(yīng)是一種對特定的DNA或RNA片段在體外進行快速擴增的方法，由變性—退火—延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。（YY/T1173-2010）PCR儀（聚合酶鏈反應(yīng)分析儀）polymerasechainreactionanalyzer,PCRanalyzer基于PCR技術(shù)原理，模擬DNA或者RNA的復(fù)制過程，在模板、引物、聚合酶等存在的條件下，特異擴增已知序列，對其進行檢測分析的儀器設(shè)備。（YY/T1173-2010）實時熒光PCRreal-timepolymerasechainreactionPCR在PCR過程中利用熒光染料釋放的熒光能量的變化直接反映出PCR擴增產(chǎn)物量的變化，熒光信號變量與擴增產(chǎn)物變量成正比，并通過對熒光的采集和分析以達到對原始模板量進行分析的PCR。（YY/T1173-2010）注：在每個循環(huán)中監(jiān)測擴展產(chǎn)物是否可被檢測。temperatureindicationerror熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)分析儀均熱塊設(shè)定溫度值與實際溫度平均值之差。單位：攝氏度，符號：℃。temperatureuniformity均熱塊內(nèi)所有采樣測量孔溫度孔溫度平均值的最大值與最小值之差。單位：攝氏度，符號：℃。JJF（皖）165—2023JJF（皖）165—2023JJF（皖）165—2023JJF（皖）165—2023PAGEPAGE10PAGEPAGE3temperaturevolatility在被檢設(shè)備穩(wěn)定的狀態(tài)下，在規(guī)定的時間間隔內(nèi)，均熱塊所有采樣點中任意一點溫度隨時間的變化量。冠以“±”號。單位：攝氏度，符號：℃。temperaturemaximumovershoot均熱塊溫度升高或降低至設(shè)定值過程中，所有采樣測量孔溫度超出（高于或低于）設(shè)定值的最大幅度。單位：攝氏度，符號：℃。meanheatingrate升溫過程中模塊單位時間內(nèi)上升的平均溫度度數(shù)。單位：攝氏度每秒，符號：℃/s。（YY/T1173-2010）meancoolingrate降溫過程中模塊單位時間內(nèi)下降的平均溫度度數(shù)。單位：攝氏度每秒，符號：℃/s。（YY/T1173-2010）fluorochrome由短波長激發(fā)光激發(fā)，釋放出可見光的試劑。（YY/T1173-2010）precisionoffluorescenceintensity對多個檢測孔在同一熒光條件下重復(fù)熒光強度檢測，其檢測值的一致性。（YY/T1173-2010）閾值循環(huán)數(shù)Ct(Cp)cyclethreshold,crossingpoint實時監(jiān)測擴增過程中，反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達指數(shù)擴增時經(jīng)歷的循環(huán)周期數(shù)。主要的計算方式是以擴增過程前3~15個循環(huán)的熒光值的10超過閾值時的循環(huán)數(shù)則為閾值循環(huán)數(shù)(Ct)。（YY/T1173-2010）precisionofcyclethreshold均熱塊不同測量孔在同一熒光條件下閾值循環(huán)數(shù)重復(fù)測量的一致性。melttemperature（Tm）總的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半時的溫度稱為熔解溫度，簡稱Tm值，不同序列的DNA，Tm值不同。單位：攝氏度，符號：℃。meltcurvePCR過程中均熱塊測量孔的熒光強度(縱坐標)與溫度(橫坐標)形成的曲線。melttemperature（Tm）bias根據(jù)熔解曲線計算的熔解溫度值與光學(xué)標準器熔解溫度設(shè)定值之差。單位：攝氏度，符號：℃。peakintensity熔解曲線上熔解溫度對應(yīng)的熒光強度。 channelpeakintensityconsistency（CPHC）熔解曲線上，所有采樣測量孔峰值強度的變化趨勢。峰高的差異表明熒光定量PCR儀的光路、光學(xué)、光學(xué)檢測和靈敏度的差異，理想的熒光定量PCR儀，CPHC為1.00。linearsensitivityfactor（LSF）同一熔解溫度下，表征熔解曲線線性變化靈敏程度的比率。理想的熒光定量PCR儀，線性靈敏度應(yīng)該是1.00。LSF在0.80和1.20之間，溶解曲線呈現(xiàn)基本線性；LSF<0.80：在高熒光強度下線性降低，注意信號飽和；LSF>1.20：在低熒光強度下線性降低，注意最小信號檢測和靈敏度。ratioofmelttemperature（RTm）同一熔解溫度下，表征熔解溫度漂移因素的比率。RTm在0.80到1.20之間：相同產(chǎn)品熔解溫度不同，差異僅基于控溫模塊特性，熔解峰漂移與溫度不均勻直接相關(guān)；RTm>1.20：相同產(chǎn)品熔解溫度不同，差異是由控溫模塊、光學(xué)和光學(xué)檢測系統(tǒng)不準確共同導(dǎo)致的；RTm<0.80：相同產(chǎn)品熔解溫度不同，差異是與光學(xué)、光學(xué)檢測系統(tǒng)及分析軟件直接相關(guān)。errorofsample’sindication被測儀器測量平均值與標準物質(zhì)標稱值之差。單位：拷貝數(shù)/微升，符號：copyies/μL。樣本線性Samplesofthelinear系列稀釋標準物質(zhì)擴增Ct值對濃度對數(shù)值的線性回歸系數(shù)。概述實時熒光定量PCR儀，全稱為實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)分析儀（real-timefluorescentquantitativePCRanalyzer,RFQ-PCR，以下簡稱實時熒光定量PCR儀）是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，同時通過標準曲線對擴增基因進行定量分析的儀器。標記有熒光染料的探針與模板基因混合后，完成高溫變性、低溫復(fù)性和適溫延伸的熱循環(huán)后，與模板基因互補配對的探針被切變化的熒光信號強度，既可對待測擴增基因進行定量分析。實時熒光定量PCR儀均熱塊一般有32孔板、48孔板、96孔板和384孔板等幾種類型，其中96孔板應(yīng)用最為廣泛。如圖1所示，其主要由溫度控制模塊、微量熒光檢測模塊、均熱塊、電腦控制系統(tǒng)、計算機及應(yīng)用軟件組成。圖1 實時熒光定量PCR儀結(jié)構(gòu)示意圖

一般情況下，實時熒光定量PCR儀計量性能指標如表1所示。表1 實時熒光定量PCR儀計量性能指標序號項目技術(shù)指標備注1溫度示值誤差30℃50℃60℃70℃90℃95℃±0.5℃溫度項目2溫度均勻度≤1.0℃3溫度波動度≤0.2℃4溫度最大過沖量≤3.0℃5平均升溫速率50℃→90℃≥1.5℃/s6平均降溫速率90℃→50℃≥1.5℃/s7閾值循環(huán)數(shù)示值誤差±2.5光學(xué)系統(tǒng)物理項目8閾值循環(huán)數(shù)均勻度≤59閾值循環(huán)數(shù)精密度≤10%10通道峰值強度一致性±0.211線性靈敏系數(shù)±0.212熔解溫度漂移±1℃13熔解溫度比±0.214樣本示值誤差±15%光學(xué)系統(tǒng)生物化學(xué)項目15樣本線性相關(guān)系數(shù)≥0.980校準條件儀器使用允許的環(huán)境條件，測量過程中應(yīng)測量和記錄環(huán)境的溫度、相對濕度。測量標準及標準物質(zhì)光學(xué)標準器光學(xué)標準器集成了溫度傳感器和發(fā)射光發(fā)生器兩部分，該兩部分可以為集成裝置。其溫度測量范圍為（0～120）℃，最大允許誤差為±0.1范圍為（360～780）nm，相對光輻射強度在（10%～100%）范圍內(nèi)可調(diào)。標準物質(zhì)校準時應(yīng)采用國內(nèi)外有證標準物質(zhì)，包括：質(zhì)粒DNA標準物質(zhì)、核糖核酸標準物質(zhì)，其特性量值（拷貝數(shù)≥109copies/μL，相對擴展不確定度≤5%）。電子天平精度≤0.01mg，且需要計量檢定合格。移液器規(guī)格：2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL，且需要計量檢定合格。校準前按照附錄A配置校準時使用的溶液。校準項目和校準方法校準項目校準項目主要分為溫度項目和光學(xué)系統(tǒng)項目兩大類，具體項目見表1。可根據(jù)客戶要求與實際情況選擇光學(xué)系統(tǒng)物理校準方法或光學(xué)系統(tǒng)生物化學(xué)校準方法中的一種方法對熒光定量PCR儀光學(xué)系統(tǒng)進行校準。校準方法校準前的準備工作PCR儀均熱塊孔數(shù)少于96孔時，測量點為12個，布點圖（以48孔為例）如圖2所示。PCR儀均熱塊孔數(shù)大于或等于96點時，測量點為15個，布點圖如圖3根據(jù)被測PCR儀說明書或客戶要求，增加或減少測量點數(shù)量，并圖示說明。校準前將PCR儀預(yù)熱30min。將儀器及光學(xué)標準器各部件連接完好，在光學(xué)標準器下部的溫度傳感器表面上涂抹適量導(dǎo)熱油，以確保其與均熱塊測量孔接觸良好。將光學(xué)標準器分布于均熱塊測量孔中。標準物質(zhì)的準備與配置按照附錄A執(zhí)行。PCR反應(yīng)體系的配置按照附錄B執(zhí)行。圖2 12個光學(xué)標準器位置分布示意圖 圖3 15個光學(xué)標準器位置分布示意圖校準過程溫度項目校準時，典型的校準設(shè)置程序如表2步驟4～11所示（其中平均升、降溫速率的測量數(shù)據(jù)分別來源于步驟4到步驟5和步驟5到步驟6；溫度示值誤差的測量數(shù)據(jù)來源于步驟5～11；溫度均勻度、溫度波動度、溫度最大過沖量的測量數(shù)據(jù)來源于步驟5～10。光學(xué)系統(tǒng)采用物理校準方法時，典型的校準設(shè)置程序如表2步驟12～16所示（步驟12和步驟13之間設(shè)定程序循環(huán)32次）型的校準設(shè)置程序如表3所示。也可以根據(jù)被測PCR儀說明書或客戶要求，參照表2或表3進行設(shè)定，并說明具體參數(shù)校準時所選取的溫度值。表2 溫度校準控制程序步驟設(shè)定溫度點持續(xù)時間備注130℃60s預(yù)熱295℃60s330℃60s430℃60s溫度控制595℃180s630℃120s790℃180s850℃180s970℃180s1060℃180s1130℃60s1285℃10s模擬光學(xué)擴增過程重復(fù)32個循環(huán)1360℃30s1495℃15s擴增變性1560℃30s熔解曲線分解1685℃10s表3 光學(xué)系統(tǒng)采用生物化學(xué)校準方法的校準設(shè)置程序步驟設(shè)定溫度點持續(xù)時間循環(huán)數(shù)150℃120s1295℃600s1395℃30s45460℃60s溫度項目校準溫度示值誤差溫度達到設(shè)定溫度30s后開始記錄測量值，記錄5s，最少均勻記錄5組數(shù)據(jù)。溫度示值誤差的計算按照公式（1）計算：1n式中：T——溫度示值誤差，℃；Ts——設(shè)定溫度值，℃；

Ts ini1n

（1）Ti——第i個溫度傳感器測量值平均值，℃；n——溫度傳感器數(shù)量。溫度均勻度溫度達到設(shè)定溫度30s后開始記錄測量值，記錄5s，最少均勻記錄5組數(shù)據(jù)。溫度均勻度的計算按照公式（2）計算：?=???ˉ?? （）式中：???——溫度均勻度，℃；ˉ??——所有測溫傳感器測定值平均值的最大值，；ˉ??——所有測溫傳感器測定值平均值的最小值，。溫度波動度溫度達到設(shè)定溫度30s后開始記錄各點量值，記錄60s，最少均勻記錄10組數(shù)據(jù)。溫度波動度為實測最高溫度與最低溫度之差的一半，冠以“±”號。按照公式（3）計算：Tf

max[(TjmaxTjmin)/2]

（3）式中：Tf——溫度波動度，℃；Tjmax——測量點j溫度傳感器在m次測量中的最高溫度，℃；Tjmin——測量點j溫度傳感器在m次測量中的最低溫度，℃。溫度最大過沖量溫度過沖量的計算按照公式（4）計算：式中：

??t

?tmax?

（4）??t——溫度最大過沖量，℃；?tmax——值，℃；TS——設(shè)定溫度值，℃。平均升溫速率被測實時熒光PCR定量儀從（50±0.5）℃升溫至（90±0.5）℃時，平均升溫速率計算按照公式（5）計算：式中：

Tah

nn

TbiTaithin

（5）Tah——平均升溫速率，℃/s；——（50±0.5）℃i——（90±0.5）℃ithi——從到達的時間，s；n——溫度測量點的個數(shù)。平均降溫速率被測實時熒光儀定量PCR儀從（90±0.5）℃降溫至（50±0.5）℃時，平均降溫速的計算按照公式（6）計算：nTTnT

bi i1 tci

（6）式中：

ac nTac——平均降溫速率，℃/s；tci——從Tbi到達Tai的時間，s。光學(xué)系統(tǒng)物理校準法閾值循環(huán)數(shù)示值誤差、均勻度和精密度閾值循環(huán)數(shù)Ct示值誤差的計算按照公式（7）計算，均勻度的計算按照公式（8）計算，精密度按照公式（9）計算Ct值的相對實驗標準偏差，以其作為Ct值精密度的表征。??=?q???ts （）1tq????1?1tq????1??1tq??式中：

??t

=?1 ×Σ1?t??

×100% （9）?t?——第i個采樣測量點閾值循環(huán)數(shù)C示值誤差；tq?——iR?ts——熒光信號達到閾值時光學(xué)標準器實際經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)；??tu——閾值循環(huán)數(shù)均勻度；??tqmax——所有采樣孔熒光信號達到閾值時的閾值循環(huán)數(shù)最大值；??tqmin——所有采樣孔熒光信號達到閾值時的閾值循環(huán)數(shù)最小值；????t——閾值循環(huán)數(shù)精密度；n——光學(xué)標準器數(shù)量。通道峰值強度一致性、線性靈敏系數(shù)當DNA循環(huán)擴增從最大熒光強度（100%）減弱到20%時，儀器理論上所接受到的熒光強度也線性遞減。計算熔解曲線上熔解溫度（Tm）附近的溫度點對應(yīng)的熒光強度，得到通道峰值強度一致性（CPHC）和線性靈敏系數(shù)（LSF），分別由公式（10）、公式（11）計算：CPHCi

BC

（10）iLSFi

AiBiBiCi

（11）式中：CPHCi——通道峰值強度一致性Bi——Tm-2℃時，第i個采樣孔對應(yīng)的熒光強度；Ci——Tm+2℃時，第i個采樣孔對應(yīng)的熒光強度；B——Tm-2℃時，所有采樣孔對應(yīng)的熒光強度平均值；C——Tm+2℃時，所有采樣孔對應(yīng)的熒光強度平均值；Ai——第i個采樣孔測量熔解曲線上溫度Tm對應(yīng)的熒光強度。LSFi——線性靈敏系數(shù)；熔解溫度漂移和熔解溫度比熔解溫度漂移的計算按照公式（12）計算，熔解溫度比的計算按照公式（13）計算。mm T T mm i i s

(12)式中：

RTmmax-mn

(13)mT ——第i個采樣測量孔熔解溫度漂移，℃；miiTm——實時熒光定量PCR儀實測Tm值，℃；isTm——光學(xué)標準器TmRTm——熔解溫度比；s

值，℃；m T ——所有采樣測量孔實時熒光定量PCR儀的T最大值，℃；m maxm T ——所有采樣測量孔實時熒光定量PCR儀的T最小值，℃；m min

——光學(xué)標準器設(shè)定Tm時所有測溫傳感器測定值的最大值，℃；——光學(xué)標準器設(shè)定Tm時所有測溫傳感器測定值的最小值，℃。光學(xué)系統(tǒng)化學(xué)校準法標準物質(zhì)的配置標準物質(zhì)配制方法見附錄A。校準板的制備用經(jīng)過計量校準的移液器，將配制好的實時熒光定量PCR儀反應(yīng)體系加入到反應(yīng)板中，按圖4所示準備96孔校準板，其他型號的儀器可參照本示例準備，被校實時熒光定量PCR儀反應(yīng)體系的配制方法見附錄B，溫度控制程序參照表3。圖4 實時熒光定量PCR儀樣本示值誤差、樣本線性校準用96孔反應(yīng)板樣本示值誤差按公式（16）計算，樣本線性按公式（17）計算。c=c?s （1）?1Ct???1Ct??t?=1Ct??t2? n???ˉ=1式中：?c——樣本示值誤差，copies/μL；c——儀器測量平均值，opis/μ；cs——標準物質(zhì)標稱值，copies/μL；r——線性相關(guān)系數(shù)；C?——iCt值；t——Ct平均值；lnci——系列稀釋標準物質(zhì)的第i個濃度的對數(shù)值；lnc——系列稀釋標準物質(zhì)濃度對數(shù)值的平均值。校準結(jié)果表達校準結(jié)果應(yīng)在校準證書（報告）上反應(yīng)，校準證書（報告）應(yīng)至少包括以下信息：標題，如“校準證書”；實驗室名稱和地址；進行校準的地點（如果與實驗室的地址不同）；證書或報告的唯一性標識（如編號），每頁及總頁數(shù)的標識；客戶的名稱和地址；被校對象的描述和明確標識；日期；如果與校準結(jié)果的有效性和應(yīng)用有關(guān)時，應(yīng)對被校樣品的抽樣程序進行說明；對校準所依據(jù)的技術(shù)規(guī)范的標識，包括名稱及代號；本次校準所用測量標準的溯源性及有效性說明；校準環(huán)境的描述；校準結(jié)果及其測量不確定度的說明；對校準規(guī)范的偏離的說明；校準證書和校準報告簽發(fā)人的簽名、職務(wù)或等效標識；校準結(jié)果僅對被校對象有效的聲明；未經(jīng)實驗室書面批準，不得部分復(fù)制證書或報告的聲明。校準原始記錄格式見附錄D，校準證書（報告）內(nèi)頁格式見附錄E。復(fù)校時間間隔根據(jù)實際使用情況，用戶可自行確定儀器復(fù)校時間間隔，建議不超過12個月。附錄A試劑

標準物質(zhì)的準備及配制質(zhì)粒DNA標準物質(zhì)或核糖核酸標準物質(zhì)其特性量值（拷貝數(shù)≥109copies/μL，相對擴展不確定度≤5%）滿足校準需求，水為符合GB/T6682-2008規(guī)定的一級水。儀器電子天平，精度≤0.01mg；移液器，規(guī)格100μL、1000μL，且需要通過計量檢定。標準物質(zhì)系列稀釋配制將標準物質(zhì)從-20℃冰箱中取出，置冰上熔解，然后室溫平衡30min。用經(jīng)過高溫高壓滅菌處理的純水進行稀釋配制，并定為陰性對照樣本。用電子天平配制系列稀釋樣品，其中S0為濃度為1×109copies/μL的標準物質(zhì)，S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7為S0系列稀釋后的樣品，每步樣品配制后要充分震蕩混勻，詳細配制方法見表A.1。表A.1 標準物質(zhì)系統(tǒng)稀釋配制 mg項目S0S1S2S3S4S5S6S7H2O終濃度（copies/μL）S11009001×108S21009001×107S31009001×106S41009001×105S51009001×104S61009001×103S71009001×102未知樣品的配制以配制好的S3為起點，用經(jīng)過校準的天平（0.01mg）配制未知樣品1(U1)和未知樣品2(U2)，樣品配制后要充分震蕩混勻，詳細配制方法見表A.2。表A.2 標未知樣品的配制 mg項目S3U1H2O終濃度（copies/μL）U15005005.0×105U23503502.5×105附錄B試劑

PCR反應(yīng)體系的配制ddH2O、10×PCRbuffer、25mmol/LMgCl2、dNTPs、10μmol/LProbe、10μmol/LPrimer1、10μmol/LPrimer2、5U/μLTaqenzyme、DNA。儀器移液器，規(guī)格2μL、10μL、100μL、2000μL、1000μL，且需要通過計量檢定。PCR反應(yīng)體系的配制參照表B.1進行PCR反應(yīng)體系溶液的配制。表B.1 PCR反應(yīng)體系的配制試劑終濃度體積ddH2O/20.6μL10×PCRbuffer1×5μL25mmol/LMgCl22.5mmol/L5μLdNTPs0.2mmol/L4μL10μmol/LProbe0.2μmol/L1μL10μmol/LPrimer10.4μmol/L2.0μL10μmol/LPrimer20.4μmol/L2.0μL5U/μLTaqenzyme0.04U/μL0.4μLDNA/10.0μLtotal/50μL注：如果Mg2+、dNTPs和Taqenzyme已經(jīng)在10×PCRbuffer中，不需要加，如果使用2×PCRbuffer，調(diào)整加樣體積使?jié)舛群线m。ddH2O為滅菌雙蒸餾水，Probe為熒光標記探針，Primer為引物，Taqenzyme為熱啟動酶，buffer為緩沖溶液，dNTPs為四種脫氧核糖核苷-磷酸混合物。附錄C溫度示值誤差和閾值循環(huán)數(shù)示值誤差測量結(jié)果的不確定度評定示例溫度測量結(jié)果不確定度評定測量方法將實時熒光定量PCRPCRPCR標準器的溫度傳感器表面上涂抹適量導(dǎo)熱油，將15個溫度傳感器置于儀器加熱模塊中，并確保與加熱模塊接觸良好。按照儀器說明書或用戶要求或推薦使用的溫度控制程PCR擴增光學(xué)標準器進行溫度數(shù)據(jù)采集。溫度示值誤差的計算按照公式（C.1）進行計算。測量模型115式中：

Ts i15i115

（C.1）T——采樣測量孔內(nèi)溫度示值誤差，℃；Ts——儀器設(shè)定溫度值，℃；Ti——第i個溫度傳感器測定值，℃。不確定度來源根據(jù)上述數(shù)學(xué)模型以及測量方法，其不確定度來源主要包括以下三個方面：測量重復(fù)性引入的標準不確定度分量；1溫度傳感器分辨力引入的標準不確定度分量u；1溫度傳感器準確度引入的標準不確定度分量u2；測量不確定度評定重復(fù)性測量引入的不確定度分量以95℃為例，對同一臺儀器，在相同的測量條件下，重復(fù)測量10次，溫度穩(wěn)定后讀取溫度測量值，15個溫度傳感器的重復(fù)測量數(shù)據(jù)見表C.1。表C.1 溫度測量結(jié)果次數(shù)測量點不同測量點溫度傳感器測量結(jié)果（℃）12345678910A195.0194.9895.0194.9594.9894.9895.0195.0495.0194.98A495.2295.2295.2595.2595.2895.2295.1995.2295.1995.22A794.9394.9394.9394.9694.9394.9694.9394.9994.9194.96A1095.2695.2695.2695.2695.2695.2995.2695.2995.2695.26A1295.4995.4095.4095.4995.4695.5295.4695.4695.5295.46D195.0395.1595.0995.0995.0395.1295.0695.0995.0995.06D794.9094.8794.8794.8294.9394.9094.8794.8494.8794.87D1295.3795.2695.2995.2995.3295.2095.2995.2995.3595.29E494.9494.8594.8594.8594.8594.9494.8894.8594.9794.91E1095.3795.2895.3495.2895.3495.3795.3195.2895.3495.31H195.4795.4795.5095.4795.5095.5095.4795.4795.4795.50H495.0395.1295.0695.0695.0395.0995.0695.0695.0995.06H795.0395.0095.0395.0095.0095.0095.0095.0695.0095.00H1095.2595.2895.2595.3195.3195.2595.2895.2595.2595.28H1295.0194.9895.0194.9894.9594.9895.0194.9595.0395.01合并樣本標準偏差按公式（C.2）計算：m n 2(ykj2S jk

yj)

（C.2）p m(n1)式中：m——測量點的數(shù)量；n——每個測量點測量次數(shù)；ykj——jk次的測量值，℃；yj——j個測量點測量值的平均值，℃；通過（C.2）Sp=0.0313℃由于每個點測量5次取平均值，因此重復(fù)測量引入的不確定度分量u1為：51uSp51

0.0134℃1溫度傳感器分辨力引入的不確定度u'1溫度傳感器的分辨力為0.01℃，分散區(qū)間半寬為0.005℃，按均勻分布計算，k=31，則u'為：31

31u'0.005℃31由于重復(fù)測量引入的標準不確定度分量u1大于分辨力引入的標準不確定度分量11u'，兩者具有一定的相關(guān)性，因此在不確定度計算時不考慮由讀數(shù)分辨力引入的標準不確定度分量u'。11溫度傳感器準確度引入的標準不確定度分量u2；溫度傳感器的最大允許誤差±0.1℃，按均勻分布計算，則：合成標準不確定度

u0.1℃0.058℃2 3u u2u2=0.06℃c 1 2擴展不確定度取k2，則：Ukuc=0.12℃閾值循環(huán)數(shù)測量結(jié)果的不確定度評定測量方法將實時熒光定量PCR儀及光學(xué)標準器各部件連接完好，將光學(xué)標準器的置于儀器加熱模塊中，并確保與加熱模塊接觸良好。按照儀器說明書或用戶要求或推薦設(shè)置光學(xué)擴增程序，并運行該程序，同時啟動PCR擴增光學(xué)標準器進行溫度和光學(xué)數(shù)據(jù)采集。示值誤差的計算按照公式（C.3）計算。測量模型式中：

?t?=?t??ts （C.）?t?——閾值循環(huán)數(shù)示值誤差；tq?——i?ts——光學(xué)標準器第i個采樣孔的閾值循環(huán)數(shù)；不確定度來源根據(jù)上述數(shù)學(xué)模型以及測量方法，其不確定度來源主要包括以下三個方面：測量重復(fù)性引入的標準不確定度分量；1光學(xué)標準器分辨力引入的標準不確定度分量u；1標準器具引入的標準不確定度u2；測量不確定度評定重復(fù)性測量引入的不確定度分量對同一臺設(shè)備，在相同的測量條件下，使用光學(xué)標準器按照推薦的光學(xué)擴增程序?qū)ζ溟撝笛h(huán)數(shù)進行10次重復(fù)測量，對重復(fù)測量結(jié)果進行分析，測量結(jié)果表C.2所示：表C.2 閾值循環(huán)數(shù)測量結(jié)果次數(shù)測量點閾值循環(huán)數(shù)測量結(jié)果12345678910實時熒光定量PCR儀A111.3411.3711.2311.5611.5611.6411.7311.7611.2811.77A411.5511.7511.5611.2411.8411.3811.4211.3611.3711.35A711.5011.2411.2411.6311.7311.3711.5711.3711.5411.57A1011.2311.7311.6411.2511.5311.5611.3511.3611.6911.37A1211.7811.2711.2511.0711.6511.3711.3311.8311.5311.74D111.3311.7511.7311.8411.2411.8711.7311.5511.4811.35D711.4511.2311.2411.2511.2611.3811.2911.5811.3711.38D1211.7711.8911.5711.6411.5211.9711.2911.3811.4611.46E411.2411.6411.8511.2811.7311.6311.7811.4711.3611.56E1011.9611.8611.9511.8411.3711.6811.7311.2911.7411.37H111.7511.2211.3511.3411.7411.2511.4711.2811.2611.66H411.3511.4511.6711.6611.2711.3711.6711.7811.7311.33H711.7611.7611.2411.6311.8311.4211.3611.5611.3811.34H1011.3211.5511.1111.3211.5511.5311.3711.3711.3311.37H1211.7711.3411.7411.7711.4411.6211.8311.8311.1111.38光學(xué)標準器A111.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50A411.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50A711.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50A1011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50A1211.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50D111.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50D711.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50D1211.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50E411.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50E1011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50H111.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50H411.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50H711.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50H1011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50H1211.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.5011.50合并樣本標準偏差按公式（C.2）計算：m n 2(ykj2S jk

yj)

（C.4）p m(n1)式中：m——測量點的數(shù)量；n——每個測量點測量次數(shù)；ykj——jk次的測量值，℃；yj——j個測量點測量值的平均值，℃；通過（C.4）Ct值合并樣本標準偏差Ct值合并樣本標準偏差Sps如下：

和PCR擴增光學(xué)模擬器的Spq=0.0421℃因此重復(fù)測量引入的不確定度分量u1u10.0421

Sps=01光學(xué)標準器分辨力引入的不確定度分量u'1PCR擴增光學(xué)標準器的分辨力為0.01，分散區(qū)間半寬為0.005，按均勻分布計算，則1u'1

0.00530.0053由于重復(fù)測量引入的標準不確定度分量u1大于分辨力引入的標準不確定度分量1u'，兩者具有一定的相關(guān)性，因此在不確定度計算時不考慮由讀數(shù)分辨力引入的標準11不確定度分量u'。1標準器具引入的不確定度u2針對光學(xué)標準器，需要考慮其溫度傳感器最大允許誤差引入的不確定度分量uT和發(fā)射光發(fā)生器發(fā)光強度測量不確定度引入的不確定度分量uL。光學(xué)標準器溫度傳感器的最大允許誤差±0.1℃，最小溫度測量點30℃時引入的不確