液相色譜柱的選擇和方法開發(fā)

液相色譜柱的選擇和方法開發(fā)

內(nèi)容概要色譜根本概念回憶色譜柱類型、選擇和方法開發(fā)制備液相混合固定相----優(yōu)化復(fù)雜樣品別離的一個(gè)新策略如何改善強(qiáng)水溶性化合物的保存和別離色譜根本概念回憶

色譜〔chromatography〕色譜原理色譜分類：氣相/液相和高效液相〔HPLC〕；反相/正相/離子交換/HILIC/混合固定相色譜功能：分析〔種類/定量〕，純化液相色譜儀器結(jié)構(gòu)及功能：泵，脫氣機(jī)，混合器，進(jìn)樣器〔閥〕，色譜柱，柱溫箱，檢測(cè)器〔流通池〕幻燈片制作：WSY18別離度

Rs-ResolutionN–TheoreticalPlateNumberα–Selectivityk–RetentionFactor拖尾幻燈片制作：WSY181.SeparationofCompoundsAandB靈敏度ＬＯＤ：LimitofDetectionＬＯＱ：LimitofQuantification－柱效－峰形〔拖尾因子〕

重現(xiàn)性別離度〔Ｒ〕－保存時(shí)間〔Ｖ，Ｔ，Ｋ〕－選擇性〔α〕－柱效〔Ｎ〕靈敏度

色譜柱類型、選擇和方法開發(fā)色譜柱與色譜條件對(duì)色譜性能的影響別離度?-選擇性〈鍵合類型，基質(zhì)外表特性；流動(dòng)相、溫度-柱效〈保存體積，粒徑，柱長(zhǎng)，基質(zhì)外表特性；流動(dòng)相，溫度，上樣量，流速峰對(duì)稱性?基質(zhì)外表特性，鍵合類型，流動(dòng)相，溫度保存體積?柱長(zhǎng)，孔隙率，比外表積，基質(zhì)外表特性，鍵合類型；流動(dòng)相，溫度靈敏度?粒徑，基質(zhì)外表特性，鍵合類型；流動(dòng)相，溫度穩(wěn)定性和重現(xiàn)性?基質(zhì)外表特性，鍵合類型；流動(dòng)相，溫度流動(dòng)相?pH，緩沖鹽種類，溶劑；影響色譜柱性能的主要因素1、色譜柱的構(gòu)型色譜柱內(nèi)徑色譜柱長(zhǎng)度2、固定相柱填料粒徑比外表積孔徑孔隙率基質(zhì)外表特性：-外表活性：硅膠純度、硅羥基的酸性、均勻性和數(shù)量-耐堿性鍵合類型-官能團(tuán)、是否封尾-鍵合相的保存行為、耐酸性色譜柱的構(gòu)型對(duì)色譜柱性能的影響色譜柱的構(gòu)型對(duì)色譜柱性能的影響：長(zhǎng)度和直徑色譜柱尺寸對(duì)色譜別離的影響：?短柱(15-100mm)-運(yùn)行時(shí)間短,柱壓低

?長(zhǎng)柱(150-250mm)-分辨率高,運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)?窄徑柱(2.1mm)–滿足檢測(cè)器和樣品量限制?寬徑柱(3-7.8mm)-載樣量高，抗污染，壽命

制備柱(內(nèi)徑>10mm)–用于純化制備柱填料對(duì)色譜柱性能的影響柱填料對(duì)C18色譜柱性能的影響：粒徑

硅膠粒徑和類型對(duì)柱效的影響d硅膠粒徑和類型對(duì)壓力的影響柱填料對(duì)C18色譜柱性能的影響：粒徑II

目前市場(chǎng)主要可供選擇的填料粒徑1.7μm，1.8μm，2.2μm－快速液相色譜柱：匹配快速色譜儀2.7μm－多孔殼層：在常規(guī)液相色譜儀上實(shí)現(xiàn)快速別離(Halo)3.0μm，3.5μm－普通快速分析5.0μm－常規(guī)分析顆粒越小，柱效越高,但是耐污染性能下降，柱壓升高.柱填料對(duì)C18色譜柱性能的影響：比外表積

每克填料的外表積，與粒度，孔徑有關(guān)比外表積大，保存增加，載樣量增加，平衡時(shí)間增加(梯度洗脫尤為注意)根據(jù)需要選擇適宜的比外表積柱填料對(duì)C18色譜柱性能的影響：孔徑I

多孔材料的95%以上外表在孔內(nèi)部樣品分子直徑小于平均孔徑，才能進(jìn)入微粒內(nèi)部孔徑至少是樣品流體學(xué)直徑的4倍300?孔徑用于：超過50個(gè)氨基酸的肽或25個(gè)殘基的低聚寡核苷酸樣品分子直徑小于平均孔徑，才能進(jìn)入微粒內(nèi)部柱填料對(duì)C18色譜柱性能的影響：孔徑II

由于小孔徑填料比外表積大，小分子的保存值在小孔徑填料通常更大條件： C8色譜柱，4.6×150mm， 3.5um，A溶劑，0.1%TFA水溶液；B溶劑，0.1%TFA于80%乙腈－

水中；20min梯度，10 30%B；60°C， 1.5ml/min柱填料對(duì)C18色譜柱性能的影響：硅膠純度I2.3-二羥基萘2.7-二羥基萘TF=1.31BrandW,AQColumn5μm,4.6mm×150mm

BrandZ,C18Column5μm,4.6mm×150mm

VenusilMPC185μm,4.6mm×150mmBrandH,C18Column5μm,4.6mm×150mmBrandU,C18Column5μm,4.6mm×150mm！TF=1.42TF=1.39TF=1.69TF=？流動(dòng)相：

甲醇：水=65：35流速：

1mL/min溫度： 35℃檢測(cè)波長(zhǎng)： 230nm進(jìn)樣量： 20μL硅膠純度－金屬含量硅膠基質(zhì)類型及開展史TypeA：原料來源：水玻璃；高金屬含量，高活性，極性化合物容易形成拖尾和死吸附TypeB：原料來源：有機(jī)硅烷〔四乙氧基硅烷〕水解/燒結(jié)/酸洗雜化及外表雜化整體柱殼層柱柱填料對(duì)C18色譜柱性能的影響：硅膠純度II

硅膠純度－金屬含量d固定相對(duì)色譜柱性能的影響：硅羥基的影響剩余硅羥基的影響普通硅膠當(dāng)流動(dòng)相的pH值大于4.5-5.0時(shí)，外表的硅羥基會(huì)帶負(fù)電荷，堿性化合物拖尾。解決方法封尾雙層外表修飾外表雜化固定相對(duì)色譜柱性能的影響：剩余硅羥基的影響封尾鍵合填料與小硅烷進(jìn)行后續(xù)反響，如三甲基氯硅烷，反響掉局部剩余硅羥基，以增加外表覆蓋率。缺點(diǎn)：不能完全反響〔仍有50%的硅羥基未被反響〕在pH<3時(shí)，TMS易流失，耐用性，穩(wěn)定性不好TMS固定相對(duì)色譜柱性能的影響：剩余硅羥基的影響不同長(zhǎng)度和體積的鍵合相對(duì)外表覆蓋率的影響固定相對(duì)色譜柱性能的影響：剩余硅羥基的影響雙層外表修飾降低外表硅羥基活性，硅膠外表更加均勻固定相對(duì)色譜柱性能的影響：剩余硅羥基的影響硅膠雙層外表修飾后新增加外表層硅羥基活性更低－新硅羥基pH=5.2，普通硅羥基pH約為3.5更對(duì)稱的峰型，提高柱效，提高靈敏度硅膠外表更均勻－硅膠微晶形成過程中的不光滑外表被覆蓋重現(xiàn)性更好外表純度更高－硅膠金屬雜質(zhì)被覆蓋極性化合物保存和別離更好鍵性化合物峰形比照

Testconditions:Columndimension:4.6mmx150mmSample:doxepin,nortriptyline,trimipramineamitriptylineMobilephase:Acetonitrile/0.01Msodiumphosphate(pH=6)=70/30Temperature:30oCFlow:1mL/minDetection:UV254nmBrandAC18(non-endcapped,)C18(non-endcapped,twin-layerASBC18ZorbaxSBC18SaponinsExtract

4.6x150mmcolumn,1%formicacid/MeOH=80/20固定相對(duì)色譜柱性能的影響：剩余硅羥基的影響雙層外表修飾代表產(chǎn)品：VenusilMPC18，VenusilASBC18，VenusilHILIC0.01ng/mLPseudoephedrineAgelaVenusilASBC18,2.1×50mm,5μmBrand

A

C182.1×50mm,5μmPhenomenexLunaC18,2.0×50mm,5μm固定相對(duì)色譜柱性能的影響：鍵合類型A縱向交聯(lián)：保存和選擇不穩(wěn)定B橫向交聯(lián)：寬pH適用，Durashell，GeminiC單體鍵合：重現(xiàn)性好，柱效高D單體〔空間保護(hù)〕：低pH穩(wěn)定〔ZorbaxSB，VenusilASB〕Ｅ極性官能團(tuán)嵌合反相固定相(ZorbaxBonusRP,VenusilHLP)固定相對(duì)色譜柱性能的影響：

基質(zhì)外表特性+鍵合類型〉反相鍵合相的保存行為同一廠家相同硅膠基質(zhì)的反相柱：保存值隨含碳量的增加而增加比外表積越大，保存值越大鍵合碳鏈越長(zhǎng)，保存越大C18C8>C3>C1，長(zhǎng)鏈之間差異不大≈反相鍵合相的保存行為不同廠家色譜柱的保存值，選擇性與峰型色譜柱：4.6*150mm，流動(dòng)相：乙腈－0.05M磷酸鉀緩沖液，pH3.2(65:35);流速：1ml/min，拖尾峰T0〔尿嘧啶〕固定相對(duì)色譜柱性能的影響：

基質(zhì)外表特性+鍵合類型〉鍵合相的穩(wěn)定性鍵合相的穩(wěn)定性

低pH值，鍵合相流失高pH值，硅膠溶解影響色譜柱壽命，方法不重現(xiàn)

鍵合類型對(duì)鍵合相穩(wěn)定性影響低pH值，鍵合相流失鍵合類型對(duì)鍵合相穩(wěn)定性影響〔II〕空間位阻保護(hù)，延緩鍵合相流失空間位阻鍵合代表產(chǎn)品：VenusilASBC18ZorbaxSBC18固定相對(duì)色譜柱性能的影響：鍵合硅膠的穩(wěn)定性高pH值，硅膠基質(zhì)溶解pH9時(shí)，色譜柱的穩(wěn)定性固定相對(duì)色譜柱性能的影響：

鍵合硅膠的穩(wěn)定性碳雜化，延硅膠緩高pH值水解外表碳雜化AgelaDurashellRPPhenomenexGemini雜化顆粒：Waters

Xterra外表碳雜化示意圖pH=12條件下的穩(wěn)定性4amines,ACN/1%Ammoniaaqueous=25%:75%,40oC,4.6x150mm,5um

1h200h總結(jié)：如何選擇色譜柱和相應(yīng)的色譜條件了解目標(biāo)化合物的性質(zhì)：結(jié)構(gòu)〔官能團(tuán)〕、pKa、分子量、濃度范圍、溶解度、極性了解色譜柱的性質(zhì)粒徑，孔徑，比外表積>保存強(qiáng)度和柱效；抗污染性基質(zhì)外表特性，鍵合類型>保存強(qiáng)度，選擇性，柱效，對(duì)稱性，靈敏度，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性選擇相應(yīng)的色譜條件色譜柱選擇〔ＩＩ〕替代：粒徑，比外表，基質(zhì)外表特性，鍵合類型相似新方法開發(fā)：－粒徑：2umvs3umvs5um〔分析時(shí)間，靈敏度，儀器，價(jià)格，壽命〕－內(nèi)徑／柱長(zhǎng)：內(nèi)徑3mmvs4.6vs7.8〔對(duì)別離影響不大，本錢〕；柱長(zhǎng)與粒徑相關(guān)－比外表：２００－４００〔低比外表耐污染，高比外表利于別離〕－孔徑：在滿足比外表前提下大孔徑較好－硅膠基質(zhì)外表特性：１〕盡可能使用高純硅膠；２〕盡可能使用低酸性硅膠；３〕當(dāng)流動(dòng)相ｐＨ>９盡可能使用外表雜化；４〕使用多硅羥基殘留，可加強(qiáng)對(duì)于極性化合物保存或削弱對(duì)于非極性化合物保存－鍵合類型：取決于選擇性和流動(dòng)相要求；具有一定極性的Ｃ１８〔ＭＰ－Ｃ１８〕可以作為首選嘗試；耐酸：選擇ＡＳＢ；耐堿：Durashell－封尾與不封尾：封尾削弱硅羥基影響；不封尾：提高硅羥基影響，增強(qiáng)極性物質(zhì)保存，降低柱流失。ＳＢ－Ｃ１８ＭＰ－Ｃ１８ＭＰ－Ｃ１８乙腈／水乙腈／水乙腈／水,KH2PO4pH=4.2混合固定相----優(yōu)化復(fù)雜樣品別離的一個(gè)新策略混合固定相的意義

系統(tǒng)化的改變選擇性，便于優(yōu)化別離度；使難以在同一固定相上分析的強(qiáng)極性和非極性化合物得以解決降低離子交換柱的保存強(qiáng)度，降低緩沖鹽濃度，從而使離子交換柱可以與質(zhì)譜檢測(cè)器相匹配混合相比例與保存時(shí)間曲線abc色譜條件ACN:50mMKH2PO4=30:70;1.5ml/min;240nm;5um,300A;4.6×250;2ul;Roomtemp.;樣品：PhenolandmelamineSCXFig.aSCX:ASBC18=4：6Fig.bASBC18Fig.cRt(Phenol)/min2.2323.0073.790Efficiency(Phenol)/Plate5908890311931Rt(Melamine)/min7.3824.7482.082Efficiency(melamine)/Plate13123100176312通過混合柱改善別離度SCXSCX:ASBC8=9:1(B0014)HPLCconditions：ACN:50mMKH2PO4=30:70;1.5ml/min;35℃;20uL;Melamine:2ppm;column:4.6×250mm;降低緩沖鹽濃度〔５倍〕以用于ＬＣ－ＭＳSampleMelamine(100ppm)LCConditions1ACN:50mMKH2PO4=30:70;1.5ml/min;240nm;5ul;5um,300A,4.6×250mmLCConditions2ACN:10mMKH2PO4=80:20;1.5ml/min;240nm;5ul;5um,300A,4.6×250mmFig.awastestedunderconditions1Fig.bandcweretestedunderconditions2abcSCXFig.aSCXFig.bSCX:ASBC18Fig.cRt(Melamine)/min7.06526.9987.577SPEproceduresFig.aLCConditionColumn:VenusilAS-TC18(SCX/C18〕2.1×150mm;5um,300?MobilePhase：ACN:Buffer=50:50;Buffer:10mMNH4Ac,HAcadjustpHto3.0240nm,0.2ml/min,10ulMassConditionESI，5KV;CapillaryTemp300℃,CapillaryVoltage15V;N2Flow35arb;PositiveiondetectionScanmode:TIC(MS),TIC(MS/MS);Range(m/z)50~140Condition3mlMethanolEquilibration3mlWaterLoading10mlSampleWashing3mlWaterWashing3mlMethanolElution6ml5%NH4OH/MethanolConcentrationEvaporatebyN2.Dissolvewith1mlmobilephaseLC-MSa標(biāo)準(zhǔn)曲線

Precision:RSD=2.83%

(n=5)Reproducibility：RSD=4.45%

(n=5)LOD:0.002ug/mLLOQ:0.01ug/mLRecovery:89.7%

RSD=7.3%

(n=9)空白樣品

如何改善強(qiáng)水溶性化合物

的保存和別離改進(jìn)水溶性化合物的保存和別離2，-0-甲基-腺嘌呤核苷HPLC方法RT樣品峰=18.902minRT主雜質(zhì)峰=21.024min主峰與后雜峰〔RT=20.634min〕的別離度R=7.81,主峰后雜峰〔RT=20.634min〕與主要雜質(zhì)的別離度R=1.70色譜柱：MPC185um100?4.6*250mm;波長(zhǎng)：260nm;柱溫：30℃;流速：1.0mL/min流動(dòng)相：流動(dòng)相A：0.63g甲酸銨溶解于900ml水中，并用甲酸調(diào)PH=3.00，再加水使溶液為1L,過濾即得；流動(dòng)相B：乙腈樣品：流動(dòng)相A溶解，待別離樣品1mg/mL；進(jìn)樣：5ul梯度表：時(shí)間（min）A(%)B(%)01000209010359010351000451000阿奇霉素有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)空白藥典方法樣品，100%水次黃嘌呤有關(guān)物質(zhì)分析色譜柱：MPC185um100?4.6*250mm流動(dòng)相：0.1%磷酸氫二鈉溶液〔磷酸調(diào)節(jié)pH值至7.50〕流速：1.0ml/min柱溫：室溫波長(zhǎng)：254nm樣品：樣品2.0mg/ml〔水溶解〕，對(duì)照品0.2408mg/ml〔客戶原液〕進(jìn)樣：5ul鍵合相，原理和目的正相條件下與氨基柱比較TestinTraditionalNormalPhaseModeColumns:5um,4.6x150mmMobilephase:Chloroethane/methanol/water=91.8:8:0.2Sample:Toluene,Nitrobenzene,4-Bromoanilineacetate,3-nitroaniline

UnisolAmidelesspolarVenusilNH2ＨＩＬＩＣ別離模式N-acetouracil

uracilColumn:VenusilSilica,5um,4.6x150mmMobilePhase:10mmolsodiumphosphate(pH7.0)/ACN=35/65Temperature:ambientDetection:UV254nmＨＩＬＩＣ別離模式N-acetouracil

uracilColumn:VenusilHILIC,5um,4.6x150mmMobilePhase:10mmolsodiumphosphate(pH7.0)/ACN=35/65Temperature:ambientDetection:UV254nmN-acetouracilGanciclovirGanciclovirColumn:VenusilHilic,5um,4.6x150mmMobilePhase:10mmolsodiumphosphate(pH7.0)/ACN=35/65Temperature:ambientDetection:UV254nm水溶性維生素別離TimeSamples:VB1,VB6,VC,VB2HPLCConditionsColumn:VenusilHILIC4.6x150mm,5umMobilePhase：0.1%TFA:ACN

=90:10Det:280nm;Flow:1.0mL/min;Temp:30℃；Inj:

2μLＶｅｎｕｓｉｌＨＩＬＩＣColumn,5μm,4.6mm×150mmPartNo.:ＶＨ951505-0BrandP,NH2Column,5μm,4.6×150mmBrandWSilicaColumn,5μm,4.6×150mmMobilePhase:A:0.1%TFAinWater；B:0.1%TFAinAcetonitrile

A:B=90:10FlowRate: 1mL/minTemperature: 30℃Detection: UV@280nmSample: VB1+VB6+VC+VB2

選擇性比較VB1+VB6+VC+VB2VC+VB6+VB1+VB2VB1+VB6+VB2+VC穩(wěn)定性比較

(aging:pH=7,20mMphosphatebuffer/MeOH=40/60;100h)100hVenusilHILIC

silicaVB1VB2VB1VCVB2VB1VCVB6VB2VB1VB2VB6VB1VB2VB1VB235h100hNH2DecitabineandImpurityAnalysisVenusilHILIC4.6×150mm，5μm，ACN：H2O＝96∶4，1ml/min，UV@244nm，roomtemp.AnalysisofAcarboseandImpurityACN:KH2PO4(4.4mmol/L)-Na2HPO4(2.0mmol/L)=70:30;1.5ml/min;35℃;210nm;VenusilHILIC，5um，100?，4.6×150mmSeparationofShikimicAcid(3,4,5,trihydroxy-1-cyclohexene-1-carboxylicacid

VenusilHILIC4.6x250mm,5um;ACN/1%formicacid90-60%in20min,ambienttemperature,1mL/min,UV210nmComparison:ValidamycinAtlantis-C18(AQ),4.6x250mm,TFA1%VenusilHILIC,4.6x250mm,ACN/water85-40%in30min,UV210nm博納艾杰爾科技及其產(chǎn)品介紹

汪群杰WhoisAmerica-gel-AsiaTechnologies?核心業(yè)務(wù)別離材料固相萃取色譜純化GPCHPLC分析生物分離手性分離解決方案固相萃取和色譜別離純化設(shè)備創(chuàng)新成就夢(mèng)想!全球最大色譜柱研發(fā)團(tuán)隊(duì)之一：歸國(guó)博士4名；碩士12名，本科11名開發(fā)色譜相關(guān)設(shè)備和材料5大類〔液相色譜柱、固相萃取柱、快速純化柱、全自動(dòng)制備色譜儀、固相萃取儀〕，近百個(gè)系列，上千個(gè)規(guī)格的商業(yè)化產(chǎn)品；申報(bào)專利11個(gè)〔其中2個(gè)已獲授權(quán)〕2006年10月成功主標(biāo)科技部十一五重大支撐工程<<科學(xué)儀器研制與開發(fā)>>工程中的課題四“高性能色譜填料和色譜柱的研制〞；成功參標(biāo)科技部十一五重大工程?科研試劑?工程中“固相萃取材料的研制與開發(fā)〞入圍天津市2021年15個(gè)自主創(chuàng)新重大專項(xiàng)基質(zhì)廠家鍵合廠家填裝廠家銷售公司我們?cè)谶@兒！不斷完善的質(zhì)量保證體系

全球一體化的研發(fā)、生產(chǎn)、銷售和效勞客戶評(píng)價(jià)－Merck“theASBC18columnoutperformedanyothercolumnIcouldgetmyhandsonandIwasabletohandlethehundredsofCOMTcompoundsIwaspresentedwith.

〞McClainRayT.,Ph.DMerck&Co.,IncFriday,March20,2021

客戶評(píng)價(jià)－Covance“ItestedformycompoundandfoundabetterSensitivityforASBC18columnthanregularlunaC182.1×50mm,5um.〞XiaorongLiang,Ph.DStaffScientistCovanceLaboratoriesInc.Thu,Mar19,2021

從樣品前處理到分析、制備的全線產(chǎn)品

中壓制備系統(tǒng)及制備柱CHEETAHFS-12021年即將建成的研發(fā)生產(chǎn)基地主要色譜柱產(chǎn)品尺寸規(guī)格：快速分析柱、分析柱、制備柱固定相-反相-正相-HILIC系列-離子交換-混合固定相〔Optimix〕-體積排阻-高聚物與多層結(jié)構(gòu)相關(guān)的新型固定相UnisolC18:VenusilASBC18,UnisolAmide:DurashellRPAgelaUnisolC18具有高度適用性的反相色譜柱極性化合物保持良好的對(duì)稱峰形LC-MS極高的靈敏度顯著增強(qiáng)的對(duì)極性化合物的保存和別離能力100%水流動(dòng)相兼容對(duì)生物基質(zhì)的耐受性寬pH范圍(1.5-9.0)堿性化合物優(yōu)良的對(duì)稱峰形1.Uracil2.Pyridine3.Butylparaben4.Naphthalene5.Acenaphthene6.AmitriptylineColumn:UnisolC18,4.6x150mm,5uMobilephase：MeOH：NaH2PO4/Na2HPO4〔PH7.0〕=70：30Temp.：30℃Detection：254nmInjection：10μLTF=1.09Plate=12046對(duì)極性化合物顯著增強(qiáng)的保存和別離能力FreshColumn;Plates:3224Aftercolumnwashingandre-equilibriumin100%water(0.1%formicacid);Plates:3045After500sampleinjections;Plates:2810Sample:uridineofcalfbloodplasm(dilute20timeswith0.1%formicacid)Injection:1uLColumn:UnisolC182.1×50mm,5μmFlow:0.3mL/minMobilephase:0.1%formicacidsolution(100%aqueousphase)Injectionfrequency：500/8min,