DB15-T 3609-2024 黑土地土壤微生物肥力評(píng)價(jià)規(guī)范

65.020.01CCS

B

1015 DB15/T

3609—2024黑土地土壤微生物肥力評(píng)價(jià)規(guī)范

for

of

soil

microbial

fertility

in

blacksoil2024-07-22

發(fā)布2024-08-22

實(shí)施內(nèi)蒙古自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局 發(fā)

布DB15/T

3609—2024 本文件按照GB/T

1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則

第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧廳提出。本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)

20)歸口。牧廳綜合保障中心。文、趙靖丹、馬超、劉亞萌、董子涵、李曉彥、白嘉駿、王旭、冬梅。單位土壤中體積小于5

μm

×10

μm

單位土壤中體積小于5

μm

×10

μm

1范圍力評(píng)價(jià)指標(biāo)及測(cè)定，土壤微生物肥力評(píng)價(jià)方法等技術(shù)要求。本文件適用于黑土地土壤微生物肥力高低的評(píng)價(jià)。2 規(guī)范性引用文件文件。GB/T

化學(xué)試劑

標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備GB

20287-2006 農(nóng)用微生物菌劑GB/T

耕地質(zhì)量等級(jí)HJ

613

干物質(zhì)和水分的測(cè)定

重量法LY/T

1220 森林土壤呼吸強(qiáng)度的測(cè)定NY/T

土壤檢測(cè)

第1部分：土壤樣品的采集、處理和貯存3 術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。土壤微生物肥力 soil

fertility能對(duì)土壤的物理和化學(xué)特性起到促進(jìn)和維持作用的微生物，在生物過(guò)程中為植物生長(zhǎng)發(fā)育提供所需養(yǎng)分的能力。土壤微生物生物量 soil

microbial

biomass33 3土壤呼吸強(qiáng)度 soil

intensity單位時(shí)間內(nèi)從單位面積土壤中釋放出來(lái)的二氧化碳量。4 土壤樣品的采集、制備及基礎(chǔ)指標(biāo)測(cè)定用定位儀確定采樣地點(diǎn)的地理位置（經(jīng)緯度），每個(gè)樣地面積原則上應(yīng)＞1

hm

，在平原區(qū)地形宜DB15/T

3609—2024用定位儀確定采樣地點(diǎn)的地理位置（經(jīng)緯度），每個(gè)樣地面積原則上應(yīng)＞1

hm

，在平原區(qū)地形宜采樣時(shí)間土壤微生物取樣宜在植物生長(zhǎng)旺盛期采樣。內(nèi)蒙古東北區(qū)采集時(shí)間宜選擇在

7～8

月初進(jìn)行，在野外采樣時(shí)，應(yīng)根據(jù)區(qū)域天氣和農(nóng)業(yè)管理?xiàng)l件的變化，避開(kāi)降雨、施肥和灌溉等時(shí)期。采樣方法4.2.1 樣地設(shè)置2設(shè)置為

100

m×100

m

正方形，在丘陵山區(qū)狹長(zhǎng)地帶宜選擇

50

m×

m

的長(zhǎng)方形。4.2.2 采樣單元確定式、氣候條件、耕作以及施肥方式等將所評(píng)價(jià)樣地劃分為

3

個(gè)條件相對(duì)一致的采樣單元。4.2.3 樣品采集的不銹鋼土鉆隨機(jī)采集15～20個(gè)0

～

cm以

1

左右為宜，若采集的樣品量過(guò)多時(shí)，可用四分法（按照

NY/T

的規(guī)定執(zhí)行）將多余的土壤棄去，最后保留

1

kg

左右。每個(gè)樣地分別采集

3

個(gè)微生物混合樣作為重復(fù)。樣品處理4.3.1樣品保存4

存有土樣的4

℃冷藏箱或者冰袋在48

h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并統(tǒng)一保存于4

℃環(huán)境中。4.3.2 樣品制備10目標(biāo)準(zhǔn)篩，選取一定量的土樣用四分法過(guò)

目標(biāo)準(zhǔn)篩，用于土壤有機(jī)碳含量的測(cè)定。土壤含水量和有機(jī)碳的測(cè)定土壤含水量的測(cè)定按照HJ

613的規(guī)定執(zhí)行，土壤有機(jī)碳的測(cè)定按照GB/T

中附錄C定執(zhí)行。5 土壤微生物肥力評(píng)價(jià)指標(biāo)及測(cè)定土壤微生物肥力評(píng)價(jià)指標(biāo)微生物熵計(jì)算如公式(1)：SMBC=C/C

…………………(1)DB15/T

3609—2024式中：qSMBC

——微生物熵；Cmic

微生物生物量碳；Corg

土壤有機(jī)碳。評(píng)價(jià)指標(biāo)的測(cè)定5.2.1 微生物數(shù)量測(cè)定

20287-2006中6.3.2及其配制方法分別按照GB

20287-2006的附錄A中A.1、A.6落數(shù)。5.2.2 微生物生物量測(cè)定5.2.2.1 微生物生物量碳土壤微生物生物量碳測(cè)定具體方法見(jiàn)附錄AA.1。5.2.2.2微生物生物量氮土壤微生物生物量氮測(cè)定具體方法見(jiàn)附錄AA.2。5.2.3 土壤酶活性測(cè)定5.2.3.1 纖維素酶活性纖維素酶活性測(cè)定按照GB

20287-2006的附錄D中D.1的規(guī)定執(zhí)行。5.2.3.2蔗糖酶活性蔗糖酶活性以蔗糖為底物，采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定，具體方法見(jiàn)附錄B中的。5.2.3.3 脲酶活性脲酶活性以尿素為底物，采用苯酚鈉?次氯酸鈉比色法測(cè)定，具體方法見(jiàn)附錄B中的。5.2.3.4 磷酸酶活性磷酸酶活性測(cè)定采用磷酸苯二鈉比色法，具體方法見(jiàn)附錄BB.3。5.2.3.5 過(guò)氧化氫酶活性過(guò)氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定，具體方法見(jiàn)附錄B中的。5.2.3.6 硝酸還原酶活性硝酸還原酶活性采用酚二磺酸比色法測(cè)定，具體方法見(jiàn)附錄

B

B.5。5.2.3.7 多酚氧化酶活性多酚氧化酶活性采用底物（左旋多巴（L-DOPA））分光光度法測(cè)定，具體方法見(jiàn)附錄

B

中的

。5.2.4土壤呼吸強(qiáng)度的測(cè)定DB15/T

3609—2024土壤呼吸強(qiáng)度測(cè)定按照

1220的規(guī)定執(zhí)行。6土壤微生物肥力評(píng)價(jià)方法確定各評(píng)價(jià)指標(biāo)權(quán)重參照表1規(guī)定的層次分析法，建立目標(biāo)層、準(zhǔn)則層和指標(biāo)層層次結(jié)構(gòu)，構(gòu)建判斷矩陣。經(jīng)層次單排肥力(目標(biāo)層)相對(duì)重要性的排序權(quán)重值。具體方法按照GB/T

33469的規(guī)定執(zhí)行。表1 黑土地土壤微生物肥力評(píng)價(jià)因子總集??(??)

=

{??(??)

=

{??0

,

??

<

??0計(jì)算各指標(biāo)隸屬度土壤微生物數(shù)量、微生物生物量碳氮、微生物熵及酶活性均屬于S型隸屬函數(shù)，各評(píng)價(jià)因素的隸屬函數(shù)可簡(jiǎn)化為公式：??1, ??

≥

??0

…………………式中：??(??)

——隸屬函數(shù)；??

——評(píng)價(jià)指標(biāo)；??0

——評(píng)價(jià)指標(biāo)的閾值上限值。6.2.2 隸屬函數(shù)閾值上限的確定采用累積頻率曲線確定隸屬函數(shù)閾值上限，一組樣本u1,u2,...un，給定某一閾值u0，不大于u0的樣本數(shù)為m為不大于u0的指標(biāo)值作為隸屬函數(shù)的閾值上限。土壤微生物肥力指數(shù)模型采用主成分分析法確定單項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)的權(quán)重值Ci指標(biāo)的隸屬度Fi評(píng)價(jià)指標(biāo)構(gòu)成的土壤微生物肥力綜合評(píng)價(jià)。土壤微生物肥力指數(shù)模型如公式：DB15/T

3609—2024MIF

=

（????

×

????）…………………式中：MIF土壤微生物肥力綜合指數(shù)；????

——第i個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的組合權(quán)重；????

——第i個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的隸屬度。土壤微生物肥力綜合評(píng)價(jià)根據(jù)6.2.2確定的閾值上限，利用公式計(jì)算各個(gè)土壤樣品的隸屬度值。然后應(yīng)用公式(3)中所建0～1之間。壤微生物肥力水平越高。DB15/T

3609—2024

附 錄 A（資料性）微生物生物量測(cè)定A.1 土壤微生物量碳的測(cè)定A.1.1 方法原理新鮮土樣經(jīng)氯仿熏蒸24

h土壤微生物量碳。A.1.2 試劑配制A.1.2.1 去乙醇氯仿（CHCl3

1:2

的比例置入分液漏斗中，充分震搖

1min

3

無(wú)水氯化鈣，以除去氯仿中的水分。純化后的氯仿置于暗色試劑瓶中，在

4

℃、黑暗條件下保存。注意：氯仿具有致癌作用，所有操作應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。A.1.2.2氫氧化鈉溶液（1

mol/L）：稱取

40

g（精確至

0.01

g）氫氧化鈉，用水溶解，定容至

mL。A.1.2.3 0.5

mol/L）：稱取

g（精確至

0.01

g于

2.5

L

2

L150

r/minA.1.2.4 重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液（

mol/L）：稱取

12.26

g（精確至

g）重鉻酸鉀（優(yōu)級(jí)純）溶于

～

水中，加水定容至

1000

mL。A.1.2.5 0.05

mol/L）：稱取

14

g（精確至

0.0001

g

600

mL～800mL

水中，加濃硫酸

5

mL

攪拌均勻，靜止片刻后定容至

1000

mL每次使用時(shí)應(yīng)標(biāo)定其準(zhǔn)確濃度。A.1.2.6

1.49

g（精確至

0.0001

g

g（精確至

g）硫酸亞鐵或

1

g（精確至

0.0001

g

100

mL

水溶液中。A.1.3 儀器設(shè)備0.0001

g和0.01

g180

5

℃)25

℃±1

℃)，搖床（25

℃，

r/min，300

r/minA.1.4 水分測(cè)定按照HJ

613測(cè)定土壤樣品的干物質(zhì)含量。A.1.5 樣品測(cè)定新鮮土壤應(yīng)立即處理或保存于4

()及土壤動(dòng)物(如蚯蚓等)2

mm免局部干燥，至土壤含水量約為田間持水量的40%（以手感濕潤(rùn)疏松但不結(jié)塊為宜）。如果土壤過(guò)于干燥，用水調(diào)節(jié)含水量至田間持水量的40%。將土壤置于密封的塑料桶內(nèi)，在25

℃±1

℃下預(yù)培養(yǎng)7

d～15

d。桶內(nèi)有適量水以保證相對(duì)濕度為100%，并在桶內(nèi)放一小燒杯1

溶液以吸收土壤呼吸產(chǎn)DB15/T

3609—2024生的CO2。這些過(guò)程是為了消除土壤水分限制對(duì)微生物的影響以及植物殘?bào)w對(duì)測(cè)定的干擾。經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的土壤應(yīng)立即分析，否則，應(yīng)置于4

℃下保存，且分析前需在上述條件下至少再培養(yǎng)24

h。A.1.6 熏蒸稱取經(jīng)預(yù)處理的土壤50.00

g共3

盛有去乙醇氯仿（約2/3燒杯）的燒杯2～3個(gè)，燒杯內(nèi)放入少量經(jīng)濃鹽酸溶液浸泡過(guò)夜后洗滌烘干的瓷片（

大小，防瀑沸），或放入抗瀑沸的顆粒，同時(shí)放入一小燒杯1

mol/LNaOH溶液以吸收熏蒸期間釋放出來(lái)的CO2-0.07

氯仿劇烈沸騰3

min～5

。關(guān)閉真空干燥器閥門(mén)，于25

℃

黑暗條件下熏蒸24

h。打開(kāi)干燥器蒸。-0.07

Ma抽真空5～6次，每次3

，每次抽真空后最好完全打開(kāi)干燥器，以加快去氯仿速度和效果。在熏蒸的同時(shí)，另稱取等量的土壤3份，置于另一干燥器中，除不加氯仿進(jìn)行熏蒸外，其他操作與熏蒸土壤一樣，作為對(duì)照土壤。A.1.7 浸提將熏蒸后的土壤無(wú)損轉(zhuǎn)移到200

mL聚乙烯塑料瓶中，加入100

mL

mol/L硫酸鉀浸提劑，使土水比為（土壤為質(zhì)量單位g，浸提液為體積單位mL），振蕩（25

℃,300

r/min）浸提30

，用中速定量濾紙過(guò)濾于

mL塑料瓶中。另稱取等量的3份對(duì)照土壤于

mL聚乙烯浸提塑料瓶中，加入100mL

mol/L硫酸鉀浸提劑同上浸提。同時(shí)做3個(gè)不加土壤的試劑空白，過(guò)濾后的浸提液應(yīng)立即分析，或在

℃下保存。A.1.8 測(cè)定取10

mL

0.2500

mol/L重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液，5.00

再將鐵絲籠沉入加熱至

℃～

185

℃

的油液。把試管內(nèi)的消煮液無(wú)損地轉(zhuǎn)入

三角瓶中，用水沖洗試管及小漏斗，洗液并入三角瓶中，使三角瓶?jī)?nèi)溶液的總體積控制在50

mL～60

3滴鄰菲啰琳指示劑，用硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定剩余的重鉻酸鉀，溶液的變色過(guò)程是橙黃--棕紅，即為終點(diǎn)。記錄硫酸亞鐵滴定量。A.1.9 結(jié)果計(jì)算樣品中有機(jī)碳含量以克每千克（g/kg）表示，按式（A.1）計(jì)算：??×??

×1000×????×??

×1000×??1

…………………(A.1)

100式中：C

——樣品中有機(jī)碳的含量，單位為克每千克（）；C

——硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，單位為摩爾每升（moL/LV0

空白試驗(yàn)所消耗硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，單位為毫升（mLV

——試樣試驗(yàn)所消耗硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，單位為毫升（mLDB15/T

3609—20240.003

——1/4碳原子的毫摩爾質(zhì)量，單位為克每毫摩爾（g/mmol1.10

——氧化校正系數(shù)；m

——稱取土壤的質(zhì)量，單位為克（gf

——表示土壤樣品干物質(zhì)含量，單位為百分含量表示（%V1

——用于測(cè)定的浸提液體積，單位為毫升（mL土壤微生物量碳含量以克每千克（g/kg）表示，按式（）計(jì)算：????

=

????

÷??

…………………(A.2)式中：Bc

土壤中微生物量碳的含量，單位為克每千克（g/kg）；Ec

熏蒸土壤浸提測(cè)定的有機(jī)碳－不熏蒸土壤浸提測(cè)定的有機(jī)碳，單位為克每千克（g/kg）；K

——轉(zhuǎn)換系數(shù)，取值。結(jié)果保留三位有效數(shù)字。A.1.10 精密度在重復(fù)條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不應(yīng)超過(guò)算術(shù)平均值的。A.2 土壤微生物量氮的測(cè)定A.2.1 方法原理新鮮土樣經(jīng)氯仿熏蒸24

h微生物量氮。A.2.2 試劑配制A.2.2.1 去乙醇氯仿（CHCl3）：同

A.1.2

中的去乙醇氯仿制備。A.2.2.2 氫氧化鈉溶液（1

mol/L）：稱取

40

g（精確至

0.01

g）氫氧化鈉，用水溶解，定容至

mL。A.2.2.3 0.5

mol/L）：稱取

g（精確至

0.01

g于

2.5

L

2

L150

r/minA.2.2.4 氫氧化鈉溶液（400

g/L）：稱取

400

g

氫氧化鈉加水溶解，定容至

1

L。A.2.2.5 硼酸溶液（20

）：稱取

20

g

硼酸加水溶解，定容至

1

L。A.2.2.6 硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.02

mol/L

5.56

濃硫酸緩緩注入

mL

水中，用水定容至1000

mol/L

GB/T

601

5

倍得到

0.02

的硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。A.2.2.7 指示劑：稱取

0.10

g

甲基紅和

0.50

g

溴甲酚綠指示劑放入瑪瑙研缽中，加入

100

mL

乙醇研磨溶解。A.2.3 儀器設(shè)備電子天平（感量0.0001

g和0.01

g），真空泵，恒溫培養(yǎng)箱（25

℃±1

℃)，凱氏定氮儀，搖床（25

℃，

r/min，

r/min）。A.2.4 水分測(cè)定DB15/T

3609—2024同A.1.4。A.2.5樣品測(cè)定同A.1.5。A.2.6 熏蒸同A.1.6。A.2.7 浸提同A.1.7。A.2.8 消化取10.0

mL浸提液（解凍的浸提液在取樣前應(yīng)徹底混勻）于250

消化管中，加入0.100

g硫酸銅，5

mL濃硫酸，于電爐上消化，混合液消化變清后再回流3

h。A.2.9 測(cè)定15

25

g/L硼酸吸收液和指示劑3滴。然后向消化管緩緩加入35

mL

氫氧化鈉溶液，蒸餾5

，用少量蒸餾水沖洗冷凝管的下0.02

mol/L準(zhǔn)硫酸溶液的毫升數(shù)。A.2.10 結(jié)果計(jì)算樣品中氮含量以克每千克（g/kg）表示，按式（）計(jì)算：??×??

×

1000×??×??

×

1000×??2

…………………(A.3)

100式中：N

——樣品中氮的含量，單位為克每千克（g/kgV1

滴定樣品時(shí)消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)，單位為毫升（mLV0

滴定空白時(shí)消耗硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)，單位為毫升（mLc

——硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度，單位為摩爾每升（moL/L0.014

——氮原子的毫摩爾質(zhì)量，單位為克每毫摩爾（g/mmol）；m

——表示稱取土壤質(zhì)量，單位為克（g）；f

——表示土壤樣品干物質(zhì)含量，單位為百分含量表示（%V2

用于測(cè)定的浸提液體積，單位為毫升（mL土壤微生物量氮含量以克每千克（g/kg）表示，按式（）計(jì)算：????

=

????

÷??

…………………(A.4)式中：Bc

土壤中微生物量氮的含量，單位為克每千克（g/kg）；Ec

熏蒸土壤浸提測(cè)定的氮含量－不熏蒸土壤浸提測(cè)定的氮含量，單位為克每千克（g/kg）；K

——轉(zhuǎn)換系數(shù)，取值。結(jié)果保留三位有效數(shù)字。DB15/T

3609—2024A.2.11 精密度同A.1.10。10DB15/T

3609—2024

附 錄 B（資料性）土壤酶活性的測(cè)定B.1 土壤蔗糖酶活性測(cè)定B.1.1 方法原理土壤蔗糖酶將蔗糖酶促水解為還原糖，還原糖與二硝基水楊酸在沸水浴中反應(yīng)而生成橙色的3-氨基-5-硝基水楊酸，顏色深度與還原糖量呈正相關(guān)，因而可用還原糖量來(lái)表示蔗糖酶的活性。B.1.2 試劑配制具體如下：a)

甲苯（C7H8）；b)

蔗糖（C12H22O11c)

磷酸氫二鈉（d)

磷酸二氫鉀（KH2PO4）；e)

葡萄糖（f)

3,5-二硝基水楊酸（C7H4N2O7g)

酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H2Oh)

酶促反應(yīng)試劑：1)

蔗糖水溶液（80

g/L）：稱取

8.00

g

100

mL；2)

磷酸緩沖液（pH

5.5）；3)

g

二水合磷酸氫二鈉用水溶解定容至

1

L（A

氫鉀溶液：稱取

9.078

g

磷酸二氫鉀用水溶解定容至

1

L（B

液）；取

A

液

mL，B

液9.5

混合均勻即可。i)

1

mg/mL

100

℃干燥

2

h

50

mg

mL

4

℃冰箱中保存期不超過(guò)

7d）。若該溶液發(fā)生混濁和出現(xiàn)絮狀物現(xiàn)象，則應(yīng)棄之，重新配制；j)

3,5-

試劑）：稱取

0.50

g3,5-二硝基水楊酸，溶于

20

mL

2

mol/L

氫氧化鈉溶液中再加入

50

水，再稱取

30

g

酒石酸鉀鈉，溶于上述溶液中，用水定容至

mL（保存期不超過(guò)

7

dB.1.3 儀器設(shè)備電子天平（感量0.0001

g和0.01

g），恒溫培養(yǎng)箱，分光光度計(jì)。B.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制分別吸取1

mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50

mL于50

mL補(bǔ)加水至1

mLDNS試劑3

mL5

后立即于冷水浴中冷卻至室溫，用水定容至50

mL，以空白管調(diào)零在波長(zhǎng)540

處比色，以吸光值為縱坐標(biāo)，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。B.1.5 測(cè)定步驟11

??×??×?? …………………(B.1)DB15/T

3609

??×??×?? …………………(B.1)B.1.5.1 水分測(cè)定按照HJ

613測(cè)定土壤樣品的干物質(zhì)含量。B.1.5.2 樣品測(cè)定稱取

5

g

土壤（精確至

0.0001

g

50

mL

具塞三角瓶中，加入

15

mL

80

蔗糖溶液，5

mL

pH5.5

磷酸緩沖液和

5

滴甲苯。搖勻混合后，放入恒溫培養(yǎng)箱，在37

℃±1

℃下培養(yǎng)

h，取出迅速過(guò)濾。準(zhǔn)確吸取濾液

1.00

mL，注入

50

mL

容量瓶中，加入

3

mLDNS

5

3

-5-硝基水楊酸而呈橙黃色，最后用水定容至

50

mL，在分光光度計(jì)上于

處進(jìn)行比色。注意事項(xiàng):a)

每一個(gè)樣品應(yīng)該做一個(gè)無(wú)基質(zhì)對(duì)照，以等體積的水代替基質(zhì)（80

蔗糖水溶液），其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同，以排除土樣中原有的蔗糖、葡萄糖對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響；b)

身分解，即空白試驗(yàn)；c)

如果樣品吸光值超過(guò)標(biāo)曲的最大值，則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣。B.1.6結(jié)果計(jì)算蔗糖酶活性以

h，1

g

風(fēng)干土壤可水解生成葡萄糖毫克數(shù)表示，按式（）計(jì)算：??

=

(??1???2)×??×??式中：X

——樣品中蔗糖酶的含量，單位為毫克每克每24

h（mg/g·

h）；

——加基質(zhì)樣品由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的葡萄糖的含量，單位為毫克每毫升（）；

——未加基質(zhì)樣品由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得葡萄糖的含量，單位為毫克每毫升（）；V

——顯色定容體積，單位為毫升（mLN

——為分取倍數(shù)=浸出液體積（mL）／吸取濾液體積（mL）；m

——表示稱取新鮮土壤質(zhì)量，單位為克（g）；f

——表示土壤樣品干物質(zhì)含量，單位為百分含量表示（%t

——表示土壤培養(yǎng)時(shí)間，單位為24小時(shí)（24

h結(jié)果保留三位有效數(shù)字。B.1.7 精密度在重復(fù)條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不應(yīng)超過(guò)算術(shù)平均值的

。B.2 土壤脲酶活性測(cè)定B.2.1 方法原理—常溫條件下作用生成藍(lán)色靛酚，顏色深度與生成氨的量呈正比，用比色法測(cè)定氨的量來(lái)表示脲酶活性。B.2.2 試劑配制B.2.2.1甲苯（C7H8）。B.2.2.2 尿素（CON2H4）。12DB15/T

3609—2024B.2.2.3 檸檬酸（C6H8O7）。B.2.2.4 氫氧化鉀（KOH）。B.2.2.5 苯酚鈉（C6H5ONa）。B.2.2.6 次氯酸鈉溶液：根據(jù)市售次氯酸鈉溶液濃度稀釋試劑，至活性氯的濃度為

。B.2.2.7 尿素溶液（100

g/L）：稱取

10

g

100

mL。B.2.2.8 檬酸鹽緩沖液（pH

）：稱取

g

檸檬酸和

147.50

g

并，用

1

mol/L

氫氧化鈉將

pH

調(diào)至

6.7，用水定容至

1000

mL。B.2.2.9 苯酚鈉溶液（1.35

mol/L）：稱取

62.50

g

苯酚鈉溶于少量乙醇，加

2

18.5

丙酮，用乙醇定容至

（A

27

g

mL（B

液）。將

A、B

溶液保存在

4

A

B

液各

20

混合，用水定容至

100

。B.2.2.10 氨的標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取

0.4717

g

經(jīng)干燥箱

105

℃烘干

3

h

硫酸銨溶于水并定容至

1000mL

1

mL

0.1

mg

0.01

mg/mL的工作液。B.2.3儀器設(shè)備電子天平（感量

0.0001

g

和

0.01

gB.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制在測(cè)定樣品吸光值之前，分別吸取0.00、1.00、、5.00、7.00、9.00、、13.00

mL氨的標(biāo)準(zhǔn)溶液，移于50

容量瓶中，然后加水20

。再依次加入4

mL苯酚鈉溶液和3

mL次氯酸鈉溶液，邊加邊搖勻。20

min0.0、0.2、0.6、1.0、、、、2.6

μg/mL的一組標(biāo)準(zhǔn)濃度。1

h內(nèi)在分光光度計(jì)

波長(zhǎng)處比色。然后以氨濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。B.2.5 測(cè)定步驟B.2.5.1 水分測(cè)定按照

測(cè)定土壤樣品的干物質(zhì)含量執(zhí)行。B.2.5.2 樣品測(cè)定稱取

5

g

土樣（精確至

0.0001

g

100

具塞三角瓶中，加入1

mL

甲苯，振蕩均勻，

min

后加入

10

尿素溶液和

20

mL

檸檬酸鹽緩沖溶液，搖勻后在

37

1

℃恒溫箱培養(yǎng)

24

h。培養(yǎng)結(jié)束后過(guò)濾，過(guò)濾后吸取

1.00

濾液至

50

容量瓶中，再依次加入

4

苯酚鈉溶液和

3

mL

次氯酸鈉溶液，邊加邊搖勻。20

50

mL。1

h

內(nèi)在分光光度計(jì)

578

1

h

注意事項(xiàng):a)

與樣品實(shí)驗(yàn)相同，以排除土樣中原有的氨對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響；b)

身分解，即空白試驗(yàn)；c)

如果樣品吸光值超過(guò)標(biāo)曲的最大值，則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣。B.2.6 結(jié)果計(jì)算13

??×??×1000×??

…………………(B.2)DB15/T

3609

??×??×1000×??

…………………(B.2)脲酶活性以24

h，1

g風(fēng)干土壤可水解生成氨量的毫克數(shù)表示，按式（）計(jì)算：X=

(??1???2)×??×??式中：

——mg/g，24

h）；————

——顯色定容體積（）；

——為分取倍數(shù)=浸出液體積（mL）／吸取濾液體積（mL）；

——表示稱取新鮮土壤質(zhì)量，單位為克（g）；

——表示土壤樣品干物質(zhì)含量，單位為百分含量表示（%）；

——表示土壤培養(yǎng)時(shí)間，單位為

小時(shí)（

h）。結(jié)果保留三位有效數(shù)字。B.2.7精密度在重復(fù)條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不應(yīng)超過(guò)算術(shù)平均值的。B.3 土壤磷酸酶活性測(cè)定B.3.1 方法原理劑反應(yīng)生成藍(lán)色，顏色深度與酚含量呈正相關(guān)，用比色法測(cè)定游離的酚含量來(lái)表示磷酸酶的活性。B.3.2 試劑配制具體如下：a)

甲苯（C7H8）；b)

冰醋酸（C2H4O2c)

無(wú)水醋酸鈉（C2H3O2Na）；d)

檸檬酸（C6H8O7e)

磷酸氫二鈉（Na2HPO4）；f)

四硼酸鈉（Na2B4O7·2O）；g)

氫氧化鈉（NaOH）；h)

硫酸鋁（Al2(SO4)3i)

磷酸苯二鈉（C6H5Na24j)

苯酚（C6H6O）；k)

氯代二溴對(duì)苯醌亞胺（C6H2Br2CLNOl)

醋酸鹽緩沖液（pH

1)

醋酸溶液（0.2

mol/L）：準(zhǔn)確移取

11.55

mL

冰醋酸用水溶解定容至

1

L；2)

醋酸鈉溶液（

mol/L）：稱取

16.40

g

無(wú)水醋酸鈉用水溶解定容至

1

L；3)

準(zhǔn)確移取

14.80

mL

0.2

mol/L

35.20

mL

醋酸鈉溶液（0.2

mol/L）用水定容至

1

L。m)

檸檬酸鹽緩沖液（pH

7.0）：1)

檸檬酸溶液（

mol/L）：稱取

19.20

g

檸檬酸，用水溶解定容至

1

L；14DB15/T

3609—20242)

磷酸氫二鈉溶液（

）：稱取

53.63

g

七水合磷酸氫二鈉或

71.70

g

十二水合磷酸氫二鈉，用水溶解定容至

1

L；3)

準(zhǔn)確移取

6.40

0.1mol/L

檸檬酸溶液加

43.60

0.2

mol/L

磷酸氫二鈉溶液，用水定容至

100

mL。n)

硼酸鹽緩沖液（pH

1)

硼砂溶液（0.05

mol/L）：稱取

19.05

g

四硼酸鈉，用水溶解定容至

1

L；2)

氫氧化鈉溶液（0.2

mol/L）：稱取

8.00

g

氫氧化鈉，用水溶解定容至

1

L；3)

準(zhǔn)確量取

mL

硼砂溶液（0.05

mol/L

23

mL

氫氧化鈉溶液（0.2

mol/L）用水定容至

200

mL。o)

5

5.00

g

酸鹽緩沖液溶解定容至

1

L；p)

氯代二溴對(duì)苯醌亞胺試劑：稱取

0.125

g

氯代二溴對(duì)苯醌亞胺，用

10

mL

乙醇溶解，貯于棕色瓶中，放冰箱

4

℃冷藏保存。溶液顏色未變褐色之前均可使用；q)

硫酸鋁溶液（3

g/L）：稱取

3.00

g

硫酸鋁，用水溶解定容至

1

L；r)

酚標(biāo)準(zhǔn)溶液（1

mg/mL1)

1

g（精確至

0.0001

g

1

L2)

酚工作液（0.01

mg/ml）：準(zhǔn)確移取

10.00

酚儲(chǔ)備液，用水定容至

1

L。B.3.3 儀器設(shè)備電子天平（感量

0.0001

g

和

0.01

gB.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制準(zhǔn)確吸取0.00、1.00、、5.00、7.00、9.00、、13.00

mL酚工作液（0.01

mg/ml），置于50

mL5

緩沖液和4滴氯代二溴對(duì)苯醌亞胺試劑，顯色后用水稀釋定容至刻度，配成濃度為0.0、0.2、0.6、1.0、、、、

μg/mL的一組標(biāo)準(zhǔn)濃度。30

計(jì)上

nm處比色。以顯色液中酚濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。B.3.5 測(cè)定步驟B.3.5.1 水分測(cè)定按照

測(cè)定土壤樣品的干物質(zhì)含量。B.3.5.2 樣品測(cè)定準(zhǔn)確稱取

5

g（精確至

0.0001

g

mL

具塞三角瓶中，加入

mL

后，加入

20

mL

5

磷酸苯二鈉溶液，仔細(xì)搖勻后放入恒溫培養(yǎng)箱，37

1

℃下培養(yǎng)

24

h

后取出，在培養(yǎng)液加入

mL

3

硫酸鋁溶液搖勻，并過(guò)濾。準(zhǔn)確吸取3.00

濾液于

50

處比色。整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置一個(gè)無(wú)土對(duì)照，不加土樣，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同，以檢驗(yàn)試劑純度和基質(zhì)自身分解。B.3.6結(jié)果計(jì)算15

??×??×1000×??…………………(B.3)DB15/T

3609

??×??×1000×??…………………(B.3)磷酸酶活性以24

h，1

g風(fēng)干土壤可水解生成酚的量（mg）表示，按式（B.3）計(jì)算：X=

(??1???2)×??×??式中：——樣品中磷酸酶的含量，單位為毫克每克每

小時(shí)（mg/g·24

h）；————

——顯色液定容體積，單位為微升（mL）；

——為分取倍數(shù)=浸出液體積（mL）／吸取濾液體積（mL）；

——表示新鮮土壤質(zhì)量，單位為克（g）；

——表示土壤樣品干物質(zhì)含量，單位為百分含量表示（%）；

——表示土壤培養(yǎng)時(shí)間，單位為

小時(shí)（

h）。結(jié)果保留三位有效數(shù)字。B.3.7 精密度在重復(fù)條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不應(yīng)超過(guò)算術(shù)平均值的。B.4 土壤過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定B.4.1方法原理在

4

所消耗的高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液體積數(shù)來(lái)表示過(guò)氧化氫酶的活性。B.4.2 試劑配制B.4.2.1 甲苯（C7H8）。B.4.2.2 濃硫酸（H2SO4）。B.4.2.3過(guò)氧化氫（H2O2）。B.4.2.4 高錳酸鉀（K24）B.4.2.5 0.2

mol/L

5.43

mL

400

mL

至

500

mL。置于

4

℃冰箱貯存。B.4.2.6 高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液

c（2MnO4）=0.1

mol/L：稱取

3.30

g

高錳酸鉀，溶于

1050

水中，緩緩煮沸

，冷卻，于暗處放置兩周，過(guò)濾。貯存于棕色瓶中，并按照

GB/T

601

對(duì)其進(jìn)行標(biāo)定。B.4.2.7 過(guò)氧化氫水溶液（3

%

%過(guò)氧化氫溶液

25

mL，用水定容至

mL

3

%

4

mol/L

1.00

mL3

%過(guò)氧化氫溶液于

50

mL

三角瓶中，加入

5

mL

水，5

mL

0.1

mol/L

的高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)定，所消耗的體積數(shù)為

16.51

。16.51

mL3%3%B.4.3儀器設(shè)備電子天平（感量

0.0001

g

和

0.01

gB.4.4測(cè)定步驟16用于表示硝酸還原酶活性。其反應(yīng)式如：NO3

→NO2

→NH2用于表示硝酸還原酶活性。其反應(yīng)式如：NO3

→NO2

→NH2→4

。

??×??×??

…………(B.4)B.4.4.1 水分測(cè)定按照

測(cè)定土壤樣品的干物質(zhì)含量。B.4.4.2 樣品測(cè)定分別稱取

5

g（精確至

0.0001

g

0.5

mL

4

℃冰箱中放置

30

25

℃冰箱貯存的

3%過(guò)氧化氫水溶液，充分混勻后，再置于

4

℃冰箱中放置

1

h。取出，迅速加入

25

mL

貯存于

4

℃冰箱的

0.2

硫酸溶液，搖勻后過(guò)濾。準(zhǔn)確吸取

1.00

mL

濾液于

50

三角瓶中，加入5

mL

5

mL

0.2

mol/L

硫酸溶液，用

mol/L

高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，滴定至紫色褪去出現(xiàn)淺粉色為終點(diǎn)。根據(jù)空白和樣品的滴定差，求出相當(dāng)于分解過(guò)氧化氫的量所消耗的高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液。B.4.5 結(jié)果計(jì)算過(guò)氧化氫酶活性以1

h，1

g風(fēng)干土壤所消耗0.1

mol/L高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積數(shù)來(lái)表示，按式（B.4）計(jì)算：X=

(??0???)×??式中：·h）；——樣品所消耗的高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的滴定體積，單位為毫升（）；

——1/5

高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，單位為摩爾每升（）；

——g）；

——表示土壤樣品干物質(zhì)含量，單位為百分含量表示（%）；

1

1

h）。B.4.6 精密度在重復(fù)條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不應(yīng)超過(guò)算術(shù)平均值的

。B.5 土壤硝酸還原酶活性測(cè)定B.5.1 方法原理采用酚二磺酸比色法。在厭氧環(huán)境下，通過(guò)與酚二磺酸的藍(lán)色反應(yīng)，求出反應(yīng)前后硝態(tài)氮量差值，- -+B.5.2 試劑配制B.5.2.1 1%KNO3溶液。B.5.2.2 1%葡萄糖。B.5.2.3CaCO3。B.5.2.4 鋁鉀礬飽和溶液。B.5.2.5 酚二磺酸：取

3

g

重蒸酚與

37

g(20.1

濃

H2SO4混合，在沸水浴上回流加熱

6

h

即成或直接使用商品化試劑。B.5.2.6 10%

NaOH。B.5.2.7 KNO3標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取

16.3052

g

重結(jié)晶

3溶于蒸餾水中并稀釋至

1

mL

含

17硝酸鹽還原酶活性以24

h后10

硝酸鹽還原酶活性以24

h后1