DB46T-芒小果普癭蚊檢疫鑒定規(guī)程編制說明

PAGEPAGE2海南省地方標(biāo)準(zhǔn)編制說明（征求意見稿）一、項(xiàng)目簡(jiǎn)況（一）標(biāo)準(zhǔn)名稱：芒小果普癭蚊檢疫鑒定規(guī)程（二）任務(wù)來源（項(xiàng)目計(jì)劃號(hào)）：2021-Z-088（三）起草單位：中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所（四）單位地址：海口城西學(xué)院路4號(hào)（五）參與起草單位：無（六）標(biāo)準(zhǔn)起草人：序號(hào)姓名單位職務(wù)職稱任務(wù)分工聯(lián)系方式1韓冬銀中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所/副研究員項(xiàng)目負(fù)責(zé)人，負(fù)責(zé)整體方案設(shè)計(jì)和資料整理、標(biāo)準(zhǔn)制定Hdy426@163.com2王建赟中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所/助理研究員負(fù)責(zé)癭蚊識(shí)別資料收集與整理wjy-1989@163.com3葉政培中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所/助理研究員負(fù)責(zé)薊馬分子生物學(xué)與資料收集整理zhengpeiyecn@163.com4李磊中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所主任副研究員負(fù)責(zé)形態(tài)鑒定方法調(diào)研與分析lee_lay@163.com5張方平中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所/研究員負(fù)責(zé)蟲情調(diào)研與分析fangpingz97@163.com6符悅冠中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所/研究員負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)制定與防控技術(shù)指導(dǎo)fygcatas@163.com7陳俊諭中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所副主任助理研究員負(fù)責(zé)監(jiān)測(cè)方法調(diào)研與分析jychencn@163.com二、編制情況（一）編制標(biāo)準(zhǔn)的必要性和意義及背景芒果是海南的重要特色的水果之一，目前海南芒果種植面積達(dá)80多萬畝，第三大主產(chǎn)區(qū)；是農(nóng)民增收最主要的水果品種之一。芒小果普癭蚊是一種為害芒果花穗和幼果的新型害蟲，主要在芒果開花和幼果形成期造成為害。在發(fā)生為害區(qū)，受害輕的果園，受害率在5%～20%；受害嚴(yán)重的果園為害率達(dá)50％～90％。在芒果花序抽出后，小花蕾準(zhǔn)備開放前至幼果發(fā)育成米粒大小期間，芒小果普癭蚊成蟲產(chǎn)卵到幼果和花蕾，幼蟲孵化后即蛀食小果的幼胚，造成落果和產(chǎn)量損失，嚴(yán)重時(shí)造成失收。芒小果普癭蚊成蟲飛行能力較弱，不具備遠(yuǎn)距離擴(kuò)散能力。主要以幼蟲隨寄主果實(shí)、蛹隨寄主附著的土壤，以及卵隨寄主的花或子房進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播。目前此蟲是嚴(yán)重威脅芒果產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成的最主要的害蟲之一。鑒于芒小果普癭蚊已在廣西部分地區(qū)發(fā)生，并造成嚴(yán)重危害為害，且發(fā)生區(qū)域不斷擴(kuò)散。為防止其向海南擴(kuò)散蔓延，極有必要制定芒小果普癭蚊疫鑒定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，為對(duì)其的檢疫提供技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)支撐。本項(xiàng)目的實(shí)施，將延緩芒小果普癭蚊對(duì)海南芒果產(chǎn)業(yè)的威脅，進(jìn)而保護(hù)海南芒果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展及環(huán)境安全，保護(hù)生物多樣性。（二）編制過程簡(jiǎn)介2021年11月3日，收到《關(guān)于下達(dá)2021年第三批海南省地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃的通知》后，成立標(biāo)準(zhǔn)編制小組，成員有韓冬銀、王建赟、葉政培、李磊、張方平、符悅冠、陳俊諭共7人。標(biāo)準(zhǔn)起草過程：按照制定海南地方標(biāo)準(zhǔn)的工作程序，編制小組分工協(xié)作著手標(biāo)準(zhǔn)的制定工作。同時(shí)，向海南省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳、海南省市場(chǎng)監(jiān)督管理局上報(bào)了標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施方案。2021年11月-2022年5月，收集整理團(tuán)隊(duì)前期的工作基礎(chǔ)及國(guó)內(nèi)外公開發(fā)表的相關(guān)資料；前往廣西百色、田東等芒小果普癭蚊發(fā)生區(qū)進(jìn)行調(diào)研，掌握了科研生產(chǎn)上的第一手資料，形成基本的框架思路。2022年2-10月完成芒果薊馬的防治技術(shù)補(bǔ)充試驗(yàn)及其數(shù)據(jù)的收集整理。在2022年11月開始組織技術(shù)專家著手標(biāo)準(zhǔn)的起草工作，于2023年2月完成意見征求稿初稿，并在此基礎(chǔ)上按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的編寫要求和格式對(duì)標(biāo)準(zhǔn)初稿進(jìn)行了進(jìn)一步修改和完善，形成征求意見稿。征求意見情況：2023年3月，由起草單位牽頭負(fù)責(zé)通過網(wǎng)站通訊的方式公開征求意見，共向5個(gè)有關(guān)海南大學(xué)、海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院、廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院、椰城海關(guān)及三亞市熱作中心等有代表性的標(biāo)準(zhǔn)利益方發(fā)函征求意見。截止2023年4月，征求意見共收到X家單位21條意見，最終18條采納，4條未采納。（三）制定標(biāo)準(zhǔn)的原則和依據(jù)，與現(xiàn)行法律法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系(從科學(xué)性、統(tǒng)一性、協(xié)調(diào)性、適用性、一致性和規(guī)范性等方面說明標(biāo)準(zhǔn)制定的原則，從技術(shù)方面說明標(biāo)準(zhǔn)制定過程中所依據(jù)的技術(shù)性文件。應(yīng)寫清該項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)與現(xiàn)行法律、法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)是否協(xié)調(diào)一致、有無沖突。)1）科學(xué)性：本標(biāo)準(zhǔn)中各部分內(nèi)容上下連貫，層次分明、合理，符合芒果產(chǎn)業(yè)發(fā)展需求，文件內(nèi)容力求簡(jiǎn)化、協(xié)調(diào)、實(shí)用和統(tǒng)一的原則。2）適用性：本標(biāo)準(zhǔn)制訂的各項(xiàng)工作既要充分發(fā)揮各級(jí)政府的主導(dǎo)作用，又要積極引導(dǎo)生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)企業(yè)、中介組織、農(nóng)戶和技術(shù)服務(wù)部門全面參與，確保制訂、發(fā)布和實(shí)施全過程的連貫性。此外，標(biāo)準(zhǔn)只能在一定時(shí)期內(nèi)與當(dāng)時(shí)的科學(xué)技術(shù)水平和經(jīng)濟(jì)發(fā)展需要相適應(yīng)。因此，還應(yīng)根據(jù)海南省芒果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及芒小果普癭蚊的發(fā)生情況對(duì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行完善修訂。3）一致性：本標(biāo)準(zhǔn)與有關(guān)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)、法律、法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)沒有沖突。4）規(guī)范性：本標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)GB/T1.1—2020的編寫要求制訂。本標(biāo)準(zhǔn)的編制充分考慮了標(biāo)準(zhǔn)須具備包容性、先進(jìn)性、實(shí)用性和可操作性的特點(diǎn)，確保本標(biāo)準(zhǔn)能在相關(guān)領(lǐng)域和部門有條件實(shí)施，并能通過標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施，規(guī)范芒小果普癭蚊的檢疫鑒定技術(shù)。（四）主要條款的說明，主要技術(shù)指標(biāo)、參數(shù)、試驗(yàn)驗(yàn)證的論述1、主要條款本文件的章節(jié)由范圍、規(guī)范性引用文件、基本信息、方法原理、儀器、用具和試劑、現(xiàn)場(chǎng)檢查、室內(nèi)檢驗(yàn)檢測(cè)、芒小果普癭蚊鑒定特征、結(jié)果判定及標(biāo)本保存組成。其中“方法原理”、“室內(nèi)檢驗(yàn)檢測(cè)”和“芒小果普癭蚊鑒定特征”是本標(biāo)準(zhǔn)的主要技術(shù)內(nèi)容。本文件植物檢疫中芒小果普癭蚊的檢疫鑒定方法。2、主要技術(shù)指標(biāo)、參數(shù)1）原理本標(biāo)準(zhǔn)在確定芒小果普癭蚊鑒定方法時(shí)，充分考慮了該蟲為害癥狀，各齡期蟲態(tài)形態(tài)特征，以雄成蟲形態(tài)特征作為判定依據(jù)，并對(duì)其地理分布、寄主范圍及為害特點(diǎn)等進(jìn)行描述。鑒于芒小果普癭蚊外部形態(tài)與同屬其它癭蚊十分相似。普癭蚊屬不同種類昆蟲的識(shí)別與鑒定通常依據(jù)雄成蟲生殖器的特征，并綜合觸角、下顎須、產(chǎn)卵器、尾須的特征判定，但因種類繁多,癭蚊蟲體微小蟲體應(yīng)用常規(guī)的比較形態(tài)學(xué)方法難以準(zhǔn)確鑒別，對(duì)于卵、若蟲或不完整的癭蚊標(biāo)本則更無法進(jìn)行種類鑒定。故本標(biāo)準(zhǔn)利用癭蚊昆蟲COI基因序列的保守片段，參照Kolesik（2009）的方法進(jìn)行分子生物檢測(cè)鑒定。2）鑒定方法采用常規(guī)生物學(xué)和形態(tài)學(xué)作為主要手段（KE-LONGJIAO,etal.2018），分子生物學(xué)作為輔助手段進(jìn)行檢測(cè)鑒定。其中分子生物學(xué)輔助檢測(cè)采用PCR法（Kolesik,etal.2009）。3）芒小果普癭蚊成蟲的形態(tài)特征雄蟲。體色：頭及胸棕褐色，腹部淺褐色。翅長(zhǎng)1.1mm～1.2mm，寬0.5mm～0.6mm。頭。頭頂復(fù)眼橋長(zhǎng)6-7個(gè)小眼直徑。下顎須4節(jié)，向端部逐節(jié)漸長(zhǎng)。單眼突微隆起。觸角具12節(jié)，第1節(jié)與第2節(jié)融合；梗節(jié)亞球形，略微比柄節(jié)長(zhǎng)；鞭節(jié)為雙亞節(jié)，每個(gè)亞節(jié)具一圈環(huán)毛；第3鞭節(jié)中部的無毛區(qū)約為基亞節(jié)長(zhǎng)度的0.6-0.7倍，頸部長(zhǎng)約為端亞節(jié)長(zhǎng)的1.0-1.1倍；基亞節(jié)的環(huán)毛伸至端亞節(jié)中部，端亞節(jié)環(huán)毛伸達(dá)頸部末端。胸部。翅膜質(zhì)，被稀疏細(xì)鱗片，R1脈和C脈在翅前緣的近中部融合；R5脈和C脈交會(huì)于翅端部，Rs脈細(xì)縮呈R5脈上的一個(gè)隆起，Cu脈叉狀。各足密被細(xì)鱗和稀疏短毛；前跗節(jié)齒狀；爪間突與前跗節(jié)近等長(zhǎng)；爪墊幾不可見。腹部。第1節(jié)至第6節(jié)背板矩形，表面散布鱗片，各節(jié)后緣具單排長(zhǎng)毛，側(cè)緣及中部散布短毛，前緣具成對(duì)毛狀感器；第7背板似第6背板，稍窄；第8背板似第7背板，但明顯窄??；第2節(jié)至第7節(jié)腹板矩形，具不規(guī)則長(zhǎng)毛，側(cè)緣及中部短毛較背板密，前緣具一對(duì)緊鄰的毛狀感器；第7腹板稍窄于第6腹板；第8腹板明顯較第7腹板短小。末節(jié)：生殖基節(jié)伸長(zhǎng)；生殖基節(jié)基突圓鈍，強(qiáng)烈骨化，密生毛列；生殖突粗壯，向端部齒突逐漸細(xì)縮，基部三分之一密被微毛，其余部分具稀疏短毛；尾突短寬，幾近完全愈合，端緣中部微凹入，端緣具長(zhǎng)毛；肛下板窄，略與尾突等長(zhǎng)，端部微凹入，端部具若干短毛；陽(yáng)莖細(xì)長(zhǎng)，明顯長(zhǎng)于生殖基節(jié)，向端部逐漸變細(xì)，末端背側(cè)1/3具無毛點(diǎn)狀感器，腹側(cè)1/4較稀疏地散布稍大的感器。雌蟲。翅長(zhǎng)1.2mm～1.8mm，寬0.6mm～0.7mm。頭。具單眼突，微隆起。觸角鞭節(jié)柱狀，第3節(jié)中部略縊縮，頸部約為小節(jié)長(zhǎng)的1/3；環(huán)毛緊貼表面，由2條水平方向和2條垂直方向的環(huán)帶交聯(lián)而成。腹部。背板第1節(jié)至第7節(jié)，腹板第2節(jié)至第7節(jié)與雄性相近，但毛及鱗片略多；第8節(jié)背板及腹板未骨化，后緣稀疏散布一排短毛。產(chǎn)卵器較伸長(zhǎng)，伸出時(shí)約為腹部其他部分的0.55-0.65倍；第9節(jié)腹面密布短毛，背面無毛被；尾突從端部1/5處分開，密被短毛，背部具若干稀疏長(zhǎng)毛，端部具若干中等長(zhǎng)度的剛毛；肛下板約為尾突長(zhǎng)的1/5，腹面觀端部寬圓，后緣具一對(duì)毛。其他部分與雄性相近。aabA翅b第三鞭毛粒ddcfec背面末端d末端腹位e頭枕部突起f跗爪伴瞼窩圖1芒小果普癭蚊雄成蟲的特征圖3、試驗(yàn)驗(yàn)證的論述本文件選擇芒小果普癭蚊若蟲為試樣，分別用了試劑盒法，將癭蚊樣本移入1.5mL離心管或碾缽中，搗碎或加入液氮碾磨，之后實(shí)驗(yàn)步驟根據(jù)DNA提取試劑盒的操作說明書操作。癭蚊基因組DNA溶液置于-20℃冷凍保存。提取得到的基因組DNA作為模板于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR體系為：DNA模板1μl，10×ExTaqBuffer（Mg2+Plus）2.5μl，TaKaRaExTaq0.25μl（1.25U），dNTP0.5μl（100nmol·L-1），引物正向:5'-GGATCACCTGATATAGCATTCCC-3'(COIS)和反向:5′-CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3′各0.25μl（250pmol·L-1），加ddH2O補(bǔ)足至25μl。反應(yīng)條件為：94℃4min，進(jìn)入循環(huán)：94℃30s，50℃45s，72℃45s，共35個(gè)循環(huán)，最后延伸10min。取10μl～15μl擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖電泳。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果待測(cè)樣品與陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出一條大小為446bp的PCR產(chǎn)物帶，陰性對(duì)照無DNA產(chǎn)物帶。將產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后，登錄GenBank系統(tǒng)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果與系統(tǒng)中芒小果普癭蚊的序列一致則可判定樣本的種類為芒小果普癭蚊。（五）標(biāo)準(zhǔn)中如果涉及專利，應(yīng)有明確的知識(shí)產(chǎn)權(quán)說明本標(biāo)準(zhǔn)沒有涉及專利。（六）采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)或國(guó)外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的，說明采標(biāo)程度，以及國(guó)內(nèi)外同