DB37T-動(dòng)物疫病鑒別檢測(cè)技術(shù) 第1部分：豬瘟強(qiáng)毒與豬瘟疫苗弱毒編制說(shuō)明

《動(dòng)物疫病鑒別檢測(cè)技術(shù)第1部分：豬瘟強(qiáng)毒與豬瘟疫苗弱毒》地方標(biāo)準(zhǔn)編制說(shuō)明一、工作簡(jiǎn)況（一）任務(wù)來(lái)源任務(wù)來(lái)源于《2019年度標(biāo)準(zhǔn)化綜合改革暨“山東標(biāo)準(zhǔn)”建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目》中的“鄉(xiāng)村振興標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)項(xiàng)目”（魯標(biāo)改辦發(fā)〔2019〕6號(hào)），本文件由山東省畜牧獸醫(yī)局提出，由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口，由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院牽頭組織編制。起草單位、起草人及任務(wù)分工地方標(biāo)準(zhǔn)由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院、山東綠都生物科技有限公司與威海市畜牧業(yè)發(fā)展中心共同起草，起草人及任務(wù)分工見下表。姓名性別職務(wù)/職稱工作單位任務(wù)分工沈志強(qiáng)男研究員山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院、山東綠都生物科技有限公司主持制定標(biāo)準(zhǔn)、負(fù)責(zé)全面審核王金良男研究員山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院、山東綠都生物科技有限公司標(biāo)準(zhǔn)文本及編制說(shuō)明的統(tǒng)稿、校對(duì)于新友男副研山東綠都生物科技有限公司標(biāo)準(zhǔn)文本及編制說(shuō)明的起草、修改謝金文男副研山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法的建立肖躍強(qiáng)男研究員山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法的驗(yàn)證曲光剛男研究員山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析魏鳳男副研山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院征求意見稿反饋意見的收集與整理董林男副研山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院依據(jù)反饋意見對(duì)檢測(cè)方法的再次驗(yàn)證。孟衛(wèi)芹女助研山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院標(biāo)準(zhǔn)文本的內(nèi)容修改。趙國(guó)清男工程師威海市畜牧業(yè)發(fā)展中心標(biāo)準(zhǔn)文本的格式修改及提交材料的準(zhǔn)備。（三）起草過(guò)程收到立項(xiàng)批復(fù)后，啟動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)的編寫。主要過(guò)程及時(shí)間節(jié)點(diǎn)見下表。時(shí)間內(nèi)容2019年9月-2019年10月實(shí)驗(yàn)研究、查閱相關(guān)技術(shù)資料和文獻(xiàn)調(diào)研。2019年11月－2019年12月編寫《動(dòng)物疫病鑒別檢測(cè)技術(shù)第1部分：豬瘟強(qiáng)毒與豬瘟疫苗弱毒》，試驗(yàn)驗(yàn)證及分析相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行修訂、完善。2020年1月-2022年2月進(jìn)行項(xiàng)目專家函審；收集、匯總專家修改意見，繼續(xù)反復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，完善檢測(cè)技術(shù)方法，形成《動(dòng)物疫病鑒別檢測(cè)技術(shù)第1部分：豬瘟強(qiáng)毒與豬瘟疫苗弱毒》送審稿。2022年3月-2023年1月申請(qǐng)山東省地方標(biāo)準(zhǔn)審查，依據(jù)專家意見對(duì)標(biāo)準(zhǔn)及編制說(shuō)明文本進(jìn)行修改。2023年2月召開地方標(biāo)準(zhǔn)審查會(huì)議。邀請(qǐng)9位專家對(duì)標(biāo)準(zhǔn)案進(jìn)行整體審查，范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語(yǔ)與定義等審查，題目、前言審查，試劑或材料、儀器審查，結(jié)果判定審查，附錄審查及檢測(cè)技術(shù)審查。2023年3月-2023年7月依據(jù)專家審查會(huì)意見對(duì)標(biāo)準(zhǔn)及編制說(shuō)明文本進(jìn)行修改與完善，形成《動(dòng)物疫病鑒別檢測(cè)技術(shù)第1部分：豬瘟強(qiáng)毒與豬瘟疫苗弱毒》報(bào)批稿，并申請(qǐng)山東省地方標(biāo)準(zhǔn)報(bào)批。二、地方標(biāo)準(zhǔn)制定目的和意義豬瘟（Classicalswinefever,CSF），也稱豬霍亂，是由豬瘟病毒（Classicalswinefevervirus,CSFV）引起豬和野豬的一種急性、高度接觸性傳染病，死亡率高達(dá)90%以上，該病以稽留高熱、出血、梗死、壞死和高死亡率為主要特征，可分為急性、亞急性、慢性、非典型性或不明顯型豬瘟，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須通報(bào)的動(dòng)物疫病，被我國(guó)列為二類動(dòng)物傳染病。豬瘟在家豬和野豬中傳播廣泛，發(fā)達(dá)國(guó)家采取前期疫苗免疫+檢測(cè)撲殺控制豬瘟，后期采取檢測(cè)+撲殺消滅豬瘟的策略，已有20多個(gè)國(guó)家宣布消滅了豬瘟。豬瘟兔化弱毒脾淋苗是將豬瘟兔化弱毒毒株接種于成年兔子，然后無(wú)菌采集兔子體內(nèi)含毒濃度比較高的淋巴結(jié)和脾臟，再將收集到的淋巴結(jié)和脾臟進(jìn)行減毒制備而成的疫苗，又稱之為“脾淋苗”，在我國(guó)豬瘟疫病防控過(guò)程中發(fā)揮了重要作用；目前，我國(guó)仍然采取以疫苗免疫預(yù)防為主，檢測(cè)凈化撲殺為輔的策略防控凈化豬瘟。近年來(lái)豬瘟流行方式和發(fā)病特點(diǎn)發(fā)生了很大變化，給獸醫(yī)臨床診斷帶來(lái)了很大困難。中國(guó)豬瘟兔化弱毒株疫苗的大規(guī)模應(yīng)用，導(dǎo)致常規(guī)的豬瘟病毒核酸檢測(cè)難以區(qū)分豬瘟病毒的強(qiáng)毒感染和免疫接種的疫苗弱毒，迫切需要建立一種快速、特異的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)來(lái)區(qū)分豬瘟強(qiáng)毒和豬瘟疫苗弱毒。該檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的制定實(shí)施，將為豬瘟的實(shí)驗(yàn)室診斷和豬瘟疫苗弱毒檢測(cè)提供技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，有助于豬瘟疫病的確診和豬瘟兔化弱毒脾淋苗及豬瘟細(xì)胞苗生產(chǎn)質(zhì)量的控制，為保障我省養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展發(fā)揮引領(lǐng)和示范作用。三、地方標(biāo)準(zhǔn)編制原則、主要技術(shù)內(nèi)容和確定依據(jù)（一）標(biāo)準(zhǔn)編制原則本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。（二）主要技術(shù)內(nèi)容和確定依據(jù)本文件確立了豬瘟強(qiáng)毒與豬瘟疫苗弱毒的SYBRGreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR鑒別方法技術(shù)規(guī)范。技術(shù)內(nèi)容和確定依據(jù)如下。主要技術(shù)內(nèi)容確定依據(jù)鑒別檢測(cè)結(jié)果判定SYBRGreenⅠ熒光染料法工作原理及DNA序列的差異可產(chǎn)生不同的Tm值特異性獸醫(yī)診斷制品注冊(cè)分類及注冊(cè)資料要求（中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第2335號(hào)）敏感性可重復(fù)性符合率主要研究結(jié)果如下：1.引物設(shè)計(jì)及合成對(duì)GenBank中公布的Shimen株、HCLV株、Alfort株、Brescia株等25株CSFV的基因組全序列進(jìn)行比較分析，設(shè)計(jì)4條引物（見表1），方法建立用的試驗(yàn)樣品為市售商品化豬瘟兔化弱毒疫苗及含有豬瘟強(qiáng)毒株擴(kuò)增目的基因的陽(yáng)性DNA質(zhì)粒。表1標(biāo)準(zhǔn)所用引物名稱和序列引物名稱引物序列（5′—3′）豬瘟疫苗弱毒上游引物GGTCTCCACAGGGGGGGT豬瘟疫苗弱毒下游引物ACTATTCTGTAACCTGTCTCATTT豬瘟強(qiáng)毒上游引物TGGCACATGGAGTTGAATCAT豬瘟強(qiáng)毒下游引物TGCGTCTCATTGAAAAACTCTA注：引物由生物公司合成，用DEPC水溶解并稀釋至100μmol/L后，-20℃保存?zhèn)溆茫桓鶕?jù)需要配制10μmol/L工作液，-20℃保存供檢測(cè)使用。2.樣品總核酸的制備用商品化試劑盒進(jìn)行豬瘟弱毒疫苗及帶有豬瘟強(qiáng)毒擴(kuò)增目的基因核酸溶液進(jìn)行豬瘟樣品總核酸的制備。3.SYBRGreenΙ熒光RT-PCR反應(yīng)體系熒光定量PCR擴(kuò)增體系見下表2和3。表2豬瘟疫苗弱毒熒光RT-PCR反應(yīng)體系試劑加入量/個(gè)反應(yīng)2×OneStepTBGreenRT-PCRBufferⅢ12.5μLPrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.5μLExTaqHS（5U/μL）0.5μL豬瘟疫苗弱毒上游引物1.0μL豬瘟疫苗弱毒下游引物1.0μLRNaseFreedH2O7.5μL檢測(cè)樣品RNA溶液2.0μL總體積25.0μL表3豬瘟強(qiáng)毒熒光RT-PCR反應(yīng)體系試劑加入量/個(gè)反應(yīng)2×OneStepTBGreenRT-PCRBufferⅢ12.5μLPrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.5μLExTaqHS（5U/μL）0.5μL豬瘟強(qiáng)毒上游引物1.0μL豬瘟強(qiáng)毒下游引物1.0μLRNaseFreedH2O7.5μL檢測(cè)樣品RNA溶液2.0μL總體積25.0μL4.反應(yīng)程序中退火溫度的優(yōu)化42℃反轉(zhuǎn)錄5min；95℃預(yù)變性10s；95℃變性5s，(52-60)℃退火10s，72℃延伸20s，72℃時(shí)收集熒光（40個(gè)循環(huán)）；溶解曲線分析，60℃1min，以0.1℃/s的速率升溫，直到97℃，整個(gè)過(guò)程連續(xù)采集熒光，最后40℃冷卻，繪制擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線。5.結(jié)果判定依據(jù)豬瘟疫苗弱毒、豬瘟強(qiáng)毒及陰性對(duì)照Ct數(shù)值、熔解曲線及溶解峰的情況，確定反應(yīng)程序中最優(yōu)的退火溫度為55℃，并在此最優(yōu)程序下確定結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。5.1豬瘟疫苗弱毒檢測(cè)結(jié)果判定5.1.1若檢測(cè)樣品無(wú)Ct值并且無(wú)典型的擴(kuò)增曲線，但熔解曲線Tm值為（81.5±0.5）℃未出現(xiàn)熔解峰，則判為豬瘟疫苗弱毒陰性（見圖1）。5.1.2若檢測(cè)樣品Ct值≤30.0，出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，且熔解曲線Tm值為（81.5±0.5）℃出現(xiàn)熔解峰，則判為豬瘟疫苗弱毒核酸陽(yáng)性。5.1.3若檢測(cè)樣品30.0＜Ct值≤35.0，出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，且熔解曲線Tm值為（81.5±0.5）℃出現(xiàn)熔解峰，則判為可疑?？梢蓸颖具M(jìn)行雙孔重復(fù)試驗(yàn)，若任一孔或兩孔重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性者判為豬瘟疫苗弱毒核酸陽(yáng)性，否則為陰性。5.2豬瘟強(qiáng)毒檢測(cè)結(jié)果判定5.2.1若檢測(cè)樣品無(wú)Ct值并且無(wú)典型的擴(kuò)增曲線；或有Ct值，并出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，但熔解曲線Tm值為（83.3±0.9）℃未出現(xiàn)熔解峰，則判為豬瘟強(qiáng)毒陰性（見圖2）。5.2.2若檢測(cè)樣品Ct值≤30.0，出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，且熔解曲線Tm值在（83.3±0.9）℃出現(xiàn)熔解峰，則判為豬瘟強(qiáng)毒核酸陽(yáng)性。5.2.3若檢測(cè)樣品30.0＜Ct值≤35.0，出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，且熔解曲線Tm值在（83.3±0.9）℃出現(xiàn)熔解峰，則判為可疑?？梢蓸颖具M(jìn)行雙孔重復(fù)試驗(yàn)，若任一孔或兩孔重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性者判為豬瘟強(qiáng)毒核酸陽(yáng)性，否則為陰性。圖1豬瘟疫苗弱毒熔解曲線分析1為豬瘟疫苗弱毒；2為豬瘟強(qiáng)毒；3為陰性對(duì)照。圖2豬瘟強(qiáng)毒熔解曲線分析1為豬瘟強(qiáng)毒；2為豬瘟疫苗弱毒；3為陰性對(duì)照。6.特異性實(shí)驗(yàn)以最優(yōu)反應(yīng)體系分別擴(kuò)增豬瘟病毒兔化弱毒疫苗株、已知豬瘟強(qiáng)毒株的RNA以及BVDV、PRV、PPV、PCV2、PRRSV基因組，均無(wú)特異峰值出現(xiàn)，表明本方法具有較好的特異性（如圖3和圖4所示）。圖3豬瘟疫苗弱毒檢測(cè)方法特異性分析圖4豬瘟強(qiáng)毒檢測(cè)方法特異性分析7.敏感性實(shí)驗(yàn)以10倍系列稀釋的含有豬瘟疫苗弱毒與豬瘟強(qiáng)毒目的基因的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行熒光定量RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明將模板稀釋10000倍后仍能得到特異性擴(kuò)增，經(jīng)計(jì)算均為在(1-10)X101拷貝/μL（如圖5和圖6所示）。圖5豬瘟疫苗弱毒檢測(cè)方法敏感性分析圖6豬瘟強(qiáng)毒檢測(cè)方法敏感性分析8.可重復(fù)性委托5家單位，依據(jù)《動(dòng)物疫病鑒別檢測(cè)技術(shù)第1部分：豬瘟強(qiáng)毒與豬瘟疫苗弱毒》標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿，對(duì)送檢的豬瘟活疫苗、含有豬瘟弱毒的兔脾臟組織，豬瘟強(qiáng)毒核酸物質(zhì)進(jìn)行復(fù)核驗(yàn)證。五家單位復(fù)核驗(yàn)證結(jié)果表明：經(jīng)復(fù)核驗(yàn)證，標(biāo)準(zhǔn)文本中鑒別檢測(cè)技術(shù)敏感、特異，具有很好的可重復(fù)性，可有效檢測(cè)鑒別豬瘟強(qiáng)毒與疫苗弱毒。9.與商品化試劑盒檢測(cè)結(jié)果符合率用該方法對(duì)各地送檢的24份豬瘟病料進(jìn)行檢測(cè)，熔解曲線分析顯示有10份樣品屬于強(qiáng)毒，12份樣品屬于疫苗弱毒，2份樣品結(jié)果不明確，與深圳市康百得生物科技有限公司的豬瘟病毒RT-nPCR檢測(cè)試劑盒的符合率為91.67%。10.采樣、運(yùn)輸與保存采集豬扁桃體、豬和兔（脾臟、淋巴結(jié)、腎臟、肺臟、盲腸）等組織器官樣品、豬全血樣品、豬排泄物樣品、細(xì)胞培養(yǎng)物等樣品按2%（V/V）加入5×105.0個(gè)兔感染量/mL豬瘟兔化弱毒，分裝成若干份，分別存放于2℃～8℃、-20℃及-70℃條件,不同時(shí)間取出進(jìn)行樣品處理、核酸提取及擴(kuò)增，評(píng)價(jià)不同保存條件對(duì)檢測(cè)樣品的影響，檢測(cè)結(jié)果見表4。樣品進(jìn)行核酸提取前做如下處理：1）組織樣品：樣品加入5倍體積4℃預(yù)冷的DEPC水，充分2）排泄物樣品：4℃、10000r/min離心5min，取上清液0.5mL轉(zhuǎn)入離心管中編號(hào)備用。3）細(xì)胞培養(yǎng)物：10000r/min離心5min，取上清液0.5mL轉(zhuǎn)入離心管中編號(hào)備用。4）全血樣品：全血樣品直接用做核酸提取。表4不同保存條件下檢測(cè)Ct值一覽表組織樣品全血樣品排泄物樣品細(xì)胞培養(yǎng)物6ha：25.36±0.132;b:(-)；c:(-)12ha：25.21±0.186;b:(-)；c:(-)24ha：26.35±0.385;b:(-)；c:(-)36ha：28.26±0.525;b:(-)；c:(-)15da：(-);b:25.28±0.252；c:(-)30da：(-);b:25.52±0.275；c:(-)45da：(-);b:25.28±0.252；c:(-)60da：(-);b:25.42±0.378；c:(-)75da：(-);b:25.89±0.259；c:(-)90da：(-);b:26.22±0.132；c:(-)105da：(-);b:28.45±0.652；c:(-)120da：(-);b:(-)；c:25.48±0.158180da：(-);b:(-)；c:25.35±0.189360da：(-);b:(-)；c:25.85±0.145注：“-”表示未進(jìn)行檢測(cè)。a表示采集的樣品在2℃～8℃條件下保存；b表示采集的樣品在-20℃保存；c表示采集的樣品在-70℃保存。依據(jù)在不同保存條件下，樣品檢測(cè)Ct數(shù)值的變化，在2℃～8℃條件下保存24h后及在-20℃保存3個(gè)月后，檢測(cè)數(shù)值發(fā)生了較大變化，病毒含量較低樣本會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)；基于此，標(biāo)準(zhǔn)文本中規(guī)定了采集的樣品在2℃～8℃條件下保存，時(shí)間不超過(guò)24h；-20℃條件下保存不超過(guò)3個(gè)月。-70℃保存條件下樣品，在保存360天進(jìn)行檢