系統(tǒng)的分析與分離臺(tái)灣地區(qū)犬瘟熱病毒

系統(tǒng)的分析與分離臺(tái)灣地區(qū)犬瘟熱病毒摘要于2003-2005年間自17支未經(jīng)疫苗注射之發(fā)病幼犬，應(yīng)用患犬血液?jiǎn)魏饲蚺cB95a細(xì)胞株共同培養(yǎng)之技術(shù)，分離出兩株可以誘發(fā)融合細(xì)胞病變的病毒，經(jīng)免疫熒光染色及抗原測(cè)試確認(rèn)為犬瘟熱病毒。將此兩株病毒之血球凝集素基因（H），與同期間自臺(tái)灣大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院臨床送檢病例之另外4株犬瘟熱病毒之H基因進(jìn)行核酸定序。經(jīng)比對(duì)序列與樹(shù)狀圖分析發(fā)現(xiàn)，本土病毒株皆有9個(gè)N連接配醣位，其中第7個(gè)配醣位為日本或中國(guó)大陸流行之亞洲1型犬瘟熱病毒所特有。本研究顯示臺(tái)灣地區(qū)所流行之犬瘟熱病毒，經(jīng)其H基因分析屬亞洲1型。關(guān)鍵詞:犬瘟熱病毒，H基因，臺(tái)灣簡(jiǎn)介犬瘟熱（CD）最早發(fā)現(xiàn)于1791年的西班牙，1905年卡爾（Carre）首次將犬瘟熱病毒（CDV）分離出來(lái)。這種傳染病的病原機(jī)理及臨床特征已經(jīng)被廣泛報(bào)道。自最初被認(rèn)證之后的200多年來(lái)，雖然犬瘟熱病毒也感染野生食肉動(dòng)物及大型貓科動(dòng)物，但是最多發(fā)現(xiàn)的病例還是在狗類之中。犬瘟熱病毒是屬于副粘病毒科麻疹病毒屬的負(fù)鏈線性RNA病毒，基因組全長(zhǎng)15690個(gè)核苷酸。一個(gè)基因組含六種主要編碼蛋白，其中一個(gè)基質(zhì)膜蛋白（M），兩個(gè)糖蛋白（附著或血凝素蛋白H和融合蛋白F），兩個(gè)轉(zhuǎn)錄酶活性蛋白（磷蛋白P和大蛋白L）和一個(gè)核衣殼蛋白（N），由核衣殼蛋白N包裹前五種蛋白共同編碼成一條RNA病毒鏈。通過(guò)注射弱毒疫苗可以防止犬瘟熱病毒的感染。然而，由于母體對(duì)病毒疫苗的干擾作用，雖然已經(jīng)注射過(guò)疫苗，但處于郊區(qū)的幼犬和市區(qū)寵物商店里的發(fā)病率一直在上升，這種情況在日本尤為顯著。據(jù)推測(cè)這種抗原變化就是現(xiàn)在CDV流行的原因，而非疫苗已經(jīng)無(wú)法很好地起到保護(hù)作用。盡管已經(jīng)在臺(tái)灣報(bào)道過(guò)相似的問(wèn)題，但是由于分離野生型CDV和區(qū)域型CDV的困難導(dǎo)致無(wú)法分析研究區(qū)域流行性CDV的特征。而由于抗原變化大多發(fā)生在H蛋白上，因此有人指出對(duì)CDV病毒的基因突變的研究應(yīng)集中于這個(gè)蛋白質(zhì)上。許多細(xì)胞株已經(jīng)經(jīng)過(guò)測(cè)試培養(yǎng)野生型CDV和保持其同種性和毒性的能力。其中，用絨猴B淋巴細(xì)胞系（B95a）培養(yǎng)的細(xì)胞群是極易被感染的宿主。通過(guò)這項(xiàng)研究，我們已經(jīng)運(yùn)用患犬血液?jiǎn)魏饲蚺cB95a細(xì)胞株共同培養(yǎng)之技術(shù)成功分離出兩個(gè)臺(tái)灣區(qū)域的CDV，從患病犬身上提取出四個(gè)犬瘟熱病毒基因H以及六株通過(guò)與其他分離出的標(biāo)本對(duì)比核酸順序之H基因后的細(xì)胞株。材料和方法動(dòng)物17只動(dòng)物收容所的不足三四月大的未感染的幼犬，以及440只由臺(tái)灣國(guó)立大學(xué)提供的已臨床診斷疑似感染CDV病毒的狗。在440個(gè)臨床病例里，被P基因RT-PCR標(biāo)注出的陽(yáng)性診斷病例有166例，占37.7%。在2003年10月到2005年12月期間，從這些陽(yáng)性病例中，挑選出四分之一的樣本做進(jìn)一步的H基因分析。這166只狗全部顯示出感染CDV的跡象，且表現(xiàn)出至少一種癥狀，例如中央神經(jīng)系統(tǒng)方面的跡象有抓咬，運(yùn)動(dòng)失調(diào)，原地打轉(zhuǎn)和肌陣攣；消化系統(tǒng)方面的跡象有腹瀉，嘔吐，無(wú)精打采和厭食；呼吸系統(tǒng)方面的跡象有鼻腔及眼黏分泌物，咳嗽，呼吸困難和打噴嚏。細(xì)胞培養(yǎng)及病毒分離B95a細(xì)胞株在中號(hào)RPMI1640中增殖（Gibco,GrandIsland,NY,USA）,培養(yǎng)基中還添加有2%或10%經(jīng)過(guò)高溫殺菌的牛胎兒血清（FBS）（Gibco,GrandIsland,NY,USA）和2mM谷氨酸鹽，1.5g/L碳酸氫鈉，4.5g/L葡萄糖，10mMHepes和1mM丙酮酸鈉，放置于含5%CO2濃度的空氣中培養(yǎng)。將從外周血白細(xì)胞分離出的病毒株（PBML）隔離在淋巴細(xì)胞分離液里，用與Blixenkrone-Moller提過(guò)的相似方法處理。簡(jiǎn)而言之，用三到五毫升肝素加固的從17只疑似感染CDV的幼犬血液在加了2%高溫殺菌的FBS的RPML1640培養(yǎng)基中稀釋為1:1的比例。用1.077g/mL,400g的聚蔗糖密度梯度離心手法在室溫下處理45分鐘分離出PBML。將表層細(xì)胞株取下，并在含2%FBS的RPMO1640培養(yǎng)基中用400g，3分鐘的離心法洗兩次。之后覆蓋在25cm2燒瓶中培養(yǎng)的50%到60%的B95a細(xì)胞株上，觀察2到3天其細(xì)胞病變效應(yīng)。當(dāng)B95a細(xì)胞中100%融合后且檢測(cè)不到CPE時(shí)，就開(kāi)始第二階段的盲傳。即用細(xì)胞刮刀（細(xì)胞刮刀353085，F(xiàn)alconBectonDickinsonLabware,FranklinLakes,NJ,USA）移除融合的B95a細(xì)胞株。將1mL刮出的融合細(xì)胞中懸浮于25cm2純50%融合B95a細(xì)胞株培養(yǎng)燒瓶共下一階段的盲傳和測(cè)試。CDV抗原檢測(cè)當(dāng)感染的B95a細(xì)胞株顯示出40%到50%的CPE時(shí)，將細(xì)胞刮出并滴四滴懸浮液分布于BIT極速上色的CDV樣本周期帶上。BIT極速上色CDV工具（Donghwa-Ri,Bongdam-Eup,Hwaseong,KyungGi-Do,Korea）用于測(cè)試CDV抗原的存在。簡(jiǎn)而言之，從感染體身上提取出的全部血液（血清或血漿），眼膜或鼻膜分泌物溶液都分布于樣本周期帶中。等待5到10分鐘后用肉眼看結(jié)果。主控線上（C）顯示出一個(gè)紅色或紫色色帶，測(cè)試線（T）上無(wú)明顯色帶的則表明為CDV感染的陰性結(jié)果。主控線上（C）顯示一個(gè)紅色或紫色色帶，測(cè)試線上（T）顯示色帶的則表明陽(yáng)性結(jié)果。間接免疫熒光測(cè)定當(dāng)感染的B95a細(xì)胞株在25cm2燒瓶中顯示出40-50%的CPE時(shí)，將細(xì)胞株取出并鋪開(kāi)在10周期的免疫熒光測(cè)定（IFA）片上（Assistant-Prazisions,Glaswarendabrik,KarlHechtKG,Sondheim,Germany）。測(cè)定片是經(jīng)空氣干燥，并在4°C下經(jīng)丙酮甲醇1:1處理15分鐘。在處理的細(xì)胞中用IFA（OlympusBX51,Shinjku-Ku,Tokyo,Japan）顯微檢測(cè)病毒抗原。原始抗體，即一個(gè)老鼠抗CDV血型稀釋于1:150的抗原稀釋液中（VentanaMedicalSystem,Tucson,AZ,HSA）,然后敷在細(xì)胞株上在37°C溫度下60分鐘。之后將細(xì)胞株注入磷酸鹽緩沖鹽水（PBS;DakoCytomation,Carpinteria,CA,USA）中停10分鐘，再用FITC標(biāo)記的第二抗原山羊抗鼠免疫球蛋白（Chemicon5008,SingleOakDriveTemecula,扁桃體和脾臟中分離出的CDV有一點(diǎn)低?，F(xiàn)在對(duì)于CDV的H基因的分子數(shù)據(jù)的廣泛認(rèn)知已經(jīng)允許關(guān)于地理起源，6種明顯的動(dòng)植物種類史的分化的認(rèn)定。在一個(gè)給予考慮的地理范圍，兩到三種CDV的基因型可以表現(xiàn)出來(lái)?；贖基因的進(jìn)化分析，六個(gè)臺(tái)灣菌株在這次研究中被討論，包括NTU1-2004，NTU4-2003，NTU3-2004,NTU2004，NTU2005-1，和NTU2005-2。這些菌株屬于Asia-1群組，與過(guò)去的CDV和Asia-2群組有明顯區(qū)別。本研究中經(jīng)鑒定的六種CDV菌株間聯(lián)系緊密。這也許是由于所有的樣本在一個(gè)限定的時(shí)期（2003-2005）都來(lái)自臺(tái)灣北部。然而，在動(dòng)植物種類樹(shù)同一分支的菌株顯示著在H基因上大于95%的氨基酸相似性，因此會(huì)被認(rèn)為屬于同一基因型。第8137個(gè)在病毒基因組的核苷酸，疫苗的一個(gè)胸腺嘧啶，在野生型菌株中被取代為胞嘧啶。這個(gè)點(diǎn)突變也在這次研究的六個(gè)臺(tái)灣菌株中發(fā)生。使用EcoRV和SsoⅠ進(jìn)行H基因的RFLP分析也許對(duì)檢測(cè)臺(tái)灣菌株有用處。這次研究中的地區(qū)CDV菌株擁有9個(gè)天冬酰胺，這九個(gè)天冬酰胺是N連接糖基化在他們