分子生物學(xué)技術(shù)在鳥類親緣關(guān)系研究中的應(yīng)用

鳥類的親緣關(guān)系不能只根據(jù)鳥類的外形和行為來判斷，比如鮮艷的蜂鳥和褐色的歐夜鶯這兩種迥然不同的鳥類就有親緣關(guān)系。有些鳥類差異過大，從未被聯(lián)想在一起，但科學(xué)證明它們的確是近親，例如常見的鸚鵡和不常見的鳴鳥。而那些行為習(xí)慣較為相似的鳥類，比如獵隼和其他食肉猛禽，在基因上可能沒有關(guān)聯(lián)性。為闡述分子生物科學(xué)在鳥類親緣關(guān)系領(lǐng)域的應(yīng)用，本文簡要介紹了幾種生物分子技術(shù)。1同工酶和蛋白電泳技術(shù)隨著蛋白質(zhì)電泳技術(shù)的發(fā)展，人們對蛋白質(zhì)的多態(tài)性進行了深入的研究。該方法利用特定的電泳載體，將同工酶和非酶體蛋白的電荷性進行區(qū)別，分離出不同的基因座，或相同位點的不同等位基因，以實現(xiàn)對基因型的識別。傳統(tǒng)的同工酶檢測技術(shù)是通過橫向切片的淀粉凝膠電泳法或高分辨率的縱向板狀聚丙烯酰胺凝膠電泳法來實現(xiàn)的（見圖1）。試驗必須在低溫環(huán)境中進行，需確保樣品的新鮮度或利用低溫冷凍組織，再進行萃取；電泳時要確保環(huán)境溫度適宜，在低溫操作過程中維持酶和蛋白的活性。蛋白質(zhì)電泳技術(shù)僅能探測到編碼蛋白的基因位點，不能測出某些潛在的變異性，可能會低估遺傳變異程度，這對研究近親群體的遺傳差異有不利影響；而且，可分析的同工酶種類也很少。雖然有以上缺點，但其成本低、設(shè)備簡單、操作快捷，在基因多樣性的研究中仍有廣闊的應(yīng)用前景。圖1水平式（A）和垂直式（B）平板凝膠電泳圖解2隨機擴增多態(tài)DNA分析隨機擴增多態(tài)DNA技術(shù)是一種新的DNA分子結(jié)構(gòu)分析方法。該方法基于PCR技術(shù)，以10bp的短寡核糖核酸單鏈作為引子，且這種核糖核酸單鏈?zhǔn)前凑諌A基順序隨意排序的，通過這種方法可使基因組DNA擴增，便于利用PCR技術(shù)對擴增物進行試驗和觀察。然后用聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠電泳法分離擴增物，用溴化乙錠染色，對其DNA片段進行多態(tài)性分析。RAPD技術(shù)能快速檢測DNA的多態(tài)性，無需對該品種進行任何分子生物學(xué)的研究，且檢測效率高，樣品用量少，靈敏度高，操作簡單快捷，成本低，所以能在近親樣品中擴大不同的帶型。這項技術(shù)自威廉姆斯和威爾士兩個研究小組于1990年共同開發(fā)以來，已經(jīng)在遺傳多樣性、分類和進化等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。但是，RAPD技術(shù)的，應(yīng)用也有不足之處，該技術(shù)對環(huán)境要求較高，反應(yīng)易受外界因素影響，重復(fù)性和可比性較差，經(jīng)濟效益一般。3DNA序列分析DNA一級序列是基因遺傳多樣性的根本體現(xiàn)，是一種最直接的遺傳反映。PCR技術(shù)的問世降低了科學(xué)研究人員的工作量，使PCR產(chǎn)物的直接測序過程不再復(fù)雜繁瑣；還使DNA序列分析結(jié)果更適合于揭示群體的差異。在DNA序列分析法中，需要對動物線粒體DNA（mtDNA）進行分析，它是一種共價閉環(huán)的雙鏈DNA，它是一種以母系遺傳為主的獨立復(fù)制體系，進化速度是單拷貝核DNA的5～10倍，已經(jīng)成為近緣物種與種內(nèi)群體遺傳關(guān)系研究的重要標(biāo)志，因此，經(jīng)常利用mtDNA序列來分析鳥類的親緣關(guān)系。路基尼和蘭迪利用mtDNA調(diào)控區(qū)進行序列分析，對70只來自不同區(qū)域的歐洲石雞進行了研究。索倫森等人也從一種已絕跡的鳥類的骨頭中提取mtDNA，用PCR技術(shù)對其進行了擴增，并對其序列進行了序列分析。再比如，內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)院對12種雀形目鳥類進行了四種堿基比例電泳檢測，獲得12對SrRNA序列，通過實驗過程中的保守位點、轉(zhuǎn)換位點、顛換位點的計算，得到A、T、G、C四個堿基的變異具情況（見表1）。最后再利用MEGA軟件進行比對，測算出這12種雀形目鳥類的遺傳距離。表112SrRNA序列三位點變異最后得到的結(jié)果較為準(zhǔn)確，比如長尾山雀到山雀科鳥類的距離是0.1114～0.1198；白腰朱頂雀與白翅交嘴雀的遺傳距離為0.0028；獵隼到長尾山雀的遺傳距離是0.5599......4DNA指紋分析DNA指紋的研究建立在DNA序列中的高變區(qū)上，而這種高變區(qū)又叫做“小衛(wèi)星DNA”。杰弗里斯等人的研究表明，在不同的DNA片段中，小衛(wèi)星DNA的復(fù)制單元具有不同的長度和順序，但其核心的片段是同一的。不同的群體間存在著明顯的差異，DNA探針與含有核心序列的小衛(wèi)星DNA雜交，形成含多條圈帶的雜交圖譜，因為不同個體之間的雜交圖譜不同，表現(xiàn)出個體特異性，而且像人類的指紋一樣獨一無二，因人而異，所以我們稱之為DNA指紋，其構(gòu)建過程（見圖2）。圖2DNA指紋的構(gòu)建過程相對于小型衛(wèi)星，基因組具有更多的隨機分布的微衛(wèi)星，因而可以提供更多的隨機分布的分子遺傳標(biāo)記。DNA指紋圖譜的特征是：多位點性、高變異性、基因結(jié)構(gòu)簡單、遺傳穩(wěn)定性好，而多位點DNA指紋圖譜包含許多不同的圖帶，技術(shù)檢測與數(shù)據(jù)分析方面都比較復(fù)雜。要想簡化數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，可以利用DNA指紋分析，一些小、微型衛(wèi)星探針分別與各自的等位基因進行雜交，就會得到一個包含1～2條圖帶的圖譜，即DNA指紋圖樣，這時若一次僅對個別小、微衛(wèi)星位點進行分析，統(tǒng)計起來就會比較省力、簡便。PCR是DNA聚合酶鏈反應(yīng)，可以在細胞外大規(guī)模進行DNA的增殖的新型技術(shù)手段。當(dāng)難以得到傳統(tǒng)Southern雜交所需的DNA數(shù)量時，可以通過PCR技術(shù)進行DNA的擴增（見圖3）來滿足試驗需求。在對微衛(wèi)星、小衛(wèi)星進行測序后，利用PCR技術(shù)對其進行特異性擴增，從而確定其變異程度。采用PCR技術(shù)和局部酶切技術(shù)，可以對多個重復(fù)單位進行多次變異分析。DNA指紋分析技術(shù)不僅能夠有效研究鳥類親緣關(guān)系，在人類親子鑒別中也具有很大的實用意義，排除基因突變，后代DNA指紋圖上的每一條帶都可以在父親或是母親的遺傳圖譜上找到，而在后代中往往會有少數(shù)由遺傳變異所形成的新帶。圖3PCR技術(shù)進行DNA擴增的過程示意圖5結(jié)語所述幾種鳥類親緣關(guān)系生物學(xué)驗證方法各有利弊，要結(jié)合實際情況和實驗?zāi)康?，選用最合適的方法。在不改變試驗參數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)的前提下，為保證試驗的可靠性可