DNA的粗提取與鑒定公開課一等獎(jiǎng)?wù)n件省賽課獲獎(jiǎng)?wù)n件

課題1DNA的粗提取與鑒定課題目的:理解DNA的理化性質(zhì)理解DNA的粗提取以及DNA鑒定的原理重點(diǎn)難點(diǎn):DNA的粗提取和鑒定的原理課題1DNA的粗提取與鑒定一.基礎(chǔ)知識(shí)一)提取DNA的辦法2、DNA粗提取的基本思路：1、提取生物大分子的基本思路：選用一定的物理或化學(xué)辦法分離含有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子（如蛋白質(zhì)、核酸）。運(yùn)用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差別，提取DNA，去除其它成分。3.DNA的理化性質(zhì)在NaCl溶液濃度在0.14mol/L時(shí),DNA溶解度最??；低于(或高于)0.14mol/L時(shí)，DNA的溶解度隨NaCl溶液濃度的減少(或增加)而逐步增大。DNA的不溶于酒精，某些蛋白質(zhì)溶于酒精（1）溶解性看圖思考：1、在什么濃度下，DNA的溶解度最??？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何變化的？2、如何通過控制NaCl溶液的濃度使DNA在鹽溶液中溶解或析出？1）DNA在NaCl溶液中的溶解度2）DNA在酒精溶液中的溶解度4.DNA的其它特性①蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對(duì)DNA沒有影響②大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60－80℃的高溫，而DNA在80℃以上才會(huì)變性③洗滌劑能夠崩潰細(xì)胞的細(xì)胞膜，但對(duì)DNA沒有影響二)DNA的鑒定原理DNA＋二苯胺試劑沸水浴溶液變藍(lán)色二苯胺試劑的配制稱取1.5g二苯胺，溶于100ml冰醋酸中，再加入1.5ml濃硫酸，用棕色瓶保存。臨用前，在10ml的上述溶液中再加入0.1ml體積分?jǐn)?shù)為0.2%的乙醛溶液。參考資料（教材57頁）一)實(shí)驗(yàn)材料的選用選材原則：DNA含量高、材料易得、便于提取二)破碎細(xì)胞，獲取DNA的濾液1、動(dòng)物細(xì)胞加蒸餾水讓細(xì)胞吸水脹破,過濾得濾液攪拌可加速細(xì)胞破裂想一想：1、如何避免血液凝固？2、為什么不是使用的雞全血？二.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思考：教材55頁提供的材料，這些材料與否都適合做實(shí)驗(yàn)？哪些材料成功的可能性較大？如選擇雞血細(xì)胞液洗滌劑能溶解細(xì)胞膜，使膜崩潰，利于釋放DNA食鹽重要成分是NaCl，有助于DNA的溶解細(xì)胞內(nèi)的DNA釋放不完全,提取的DNA量變少；造成看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色。二)破碎細(xì)胞，獲取DNA的濾液1、動(dòng)物細(xì)胞加蒸餾水讓細(xì)胞吸水脹破,過濾得濾液2、植物細(xì)胞加洗滌劑和食鹽,充足攪拌研磨,過濾得濾液旁欄思考：1、這里洗滌劑和食鹽分別起什么作用？2、如果研磨不充足，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)成果產(chǎn)生如何的影響？三)去除濾液中的雜質(zhì)1.雜質(zhì)可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)2.去除辦法閱讀P55方案一：為什么重復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？答：用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過重復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多個(gè)雜質(zhì)。討論：方案二與方案三的原理有什么不同？答：方案二是運(yùn)用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開；方案三運(yùn)用的是DNA和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離四)DNA的析出與鑒定DNA的析出用的是與濾液體積相等的冷卻的酒精溶液(體積分?jǐn)?shù)為95％)，靜置2-3min，溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物，這就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一種方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水。1、DNA的析出2、DNA的鑒定鑒定DNA時(shí)在試管中先加入2mol/L的NaCl溶液5mL于兩只試管中，其中一只加入DNA絲狀物，各加入二苯胺4mL試劑?；旌暇鶆蚝?，將試管置于沸水中加熱5min,待試管冷卻后，比較兩只試管中溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液與否有藍(lán)色。DNA析出其它辦法實(shí)驗(yàn)普通規(guī)定采用預(yù)冷的95％的乙醇，從理論上分析，預(yù)冷的乙醇溶液含有下列優(yōu)點(diǎn)。一是克制核酸水解酶活性，避免DNA降解；二是減少分子運(yùn)動(dòng)，易于形成沉淀析出；三是低溫有助于增加DNA分子柔韌性，減少斷裂。此時(shí)懸浮于溶液中的DNA絲狀物相對(duì)含雜質(zhì)較少，如果出現(xiàn)的絲狀物較少，能夠?qū)⒋嘶旌弦涸俜湃氡渲欣鋮s幾分鐘。DNA的純化尚有許多其它辦法。例如，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25％的十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液，使蛋白質(zhì)變性后與DNA分開。隨即，加入氯仿-異丙醇混合液（體積比為24∶1），通過離心將蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)除去,取上清液?？芍貜?fù)上述操作幾次，直至上清液變成透明的黏稠液體。另外苯酚能夠快速使蛋白質(zhì)變性，克制核酸酶的活性。運(yùn)用苯酚解決后，離心分層，DNA溶于上層水相，蛋白質(zhì)變性存在于酚層中，這時(shí)可用分液漏斗或吸管等儀器將兩者分開。DNA的鑒定辦法（1）二苯胺法（2）紫外燈照射法：紫外燈照射法用蒸餾水配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的溴化乙錠(EB)溶液，將玻璃棒上纏繞的白色絮狀物抹到蠟紙上，再滴1滴EB溶液染色。將蠟紙放在紫外燈(260nm)下照射(暗室中)，可呈現(xiàn)橙紅色的螢光(DNA的紫外吸取高峰在260nm處)。（3）電泳法（詳見課題二）此辦法適合鑒定純度較高的DNA。1.以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，每100ml血液中需要加入3g檸檬酸鈉，避免血液凝固。2.加入洗滌劑后，動(dòng)作要輕緩、柔和，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫，不利于后續(xù)環(huán)節(jié)的操作。加入酒精和玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，造成DNA分子不能形成絮狀沉淀。3、二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用,否則會(huì)影響鑒定的效果操作提示方法步驟

加入物質(zhì)

目的

1.制備雞血細(xì)胞液

檸檬酸鈉溶液

①

2.提取雞血細(xì)胞細(xì)胞核物質(zhì)

20m1蒸餾水

②

3.溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA

2m1／L的NaCI溶液40mL

③

4.析出含DNA的黏稠物

蒸餾水

④

5.濾取含DNA的黏稠物

⑤

6.將DNA的黏稠物再溶解

2mol／L的NaCl溶液20mL

⑥

7.過濾含DNA的NaCl溶液

⑦

8.提取含有雜質(zhì)較少的DNA

冷卻的95％的酒精50mL

⑧

A:(1)向試管中加入0.015mol／L的NaCl溶液5mL

(2)加入DNA

(3)4mL二苯胺試劑

9.DNA的鑒定

B:(1)向試管中加入0.015mol／L

的NaCl溶液5mL

(2)4mL二苯胺試劑

⑨

以雞血為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行DNA的粗提?、偌尤霗幟仕徕c溶液的目的是避免血凝固②加速血細(xì)胞破裂

③溶解DNA

④使2mol/L的NaCl溶液稀釋至0.14mol/L使得DNA最大程度地釋出

⑤使含DNA的黏稠物被留在紗布上⑥使含DNA的黏稠物盡量多的溶解于溶液中⑦除去含DNA的濾液中的雜質(zhì)⑧提取DNA⑨A出現(xiàn)藍(lán)色B無變化四.成果分析與評(píng)價(jià)可能仍然含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)（二）分析DNA中的雜質(zhì)（三）不同實(shí)驗(yàn)辦法的比較①選用不同的實(shí)驗(yàn)材料，②同種材料采用不同辦法，多方面比較實(shí)驗(yàn)成果，如DNA純度、DNA顏色、二苯胺顯色深淺等，看哪種實(shí)驗(yàn)材料或提取辦法的效果更加