【醫(yī)麥客】2023-2024基因治療藥物行業(yè)發(fā)展白皮書

罕見病、慢病及其他難治性疾病提供了新的治療理念和手段，具備了一般藥物可能無法企及的長期性、治愈性療效。（備注：本文所描述的基因療法不含CAR-T等免疫細(xì)胞療法、溶瘤病毒療法、小核酸藥物。）基因療法通過修飾、操作或刪除基因從而改變基因組的變化，有望解決傳統(tǒng)小分子、抗體藥成藥性差或無法根治疾病的問題。在過去的十年間，基因療法在癌癥、遺傳性疾病以及傳染性疾病等多個領(lǐng)域的臨床治療中取得了突破性的進(jìn)展。目前，針對傳統(tǒng)方法無法治療、預(yù)防或治愈的疾病，基因療基因療法旨在解決疾病的根本原因，如我們基因的變化。它利用遺傳物質(zhì)來治療或預(yù)防疾病。被遞送進(jìn)入細(xì)胞的基因物質(zhì)，如DNA或RNA，包含指導(dǎo)細(xì)胞如何合成特定蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)組的指令。對于某些疾病而言，這可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生出現(xiàn)過量、不足或功能異常，從而影響細(xì)胞的正基因療法優(yōu)勢顯著，可以克服傳統(tǒng)藥物調(diào)控蛋白質(zhì)水平的局限，已成為破解疑難疾病的重要手段，在遺傳、非遺傳疾病領(lǐng)域的應(yīng)用價值日益凸顯，2023年美國FDA批準(zhǔn)了5款基因療法（含基因編輯療法）上市，分別療鐮刀型細(xì)胞貧血病、血友病A、杜氏肌營養(yǎng)不良和營養(yǎng)不良性大皰性表皮以及AAV載體、脂質(zhì)納米顆粒（LNP）、病毒樣顆粒（VLP）等遞送技術(shù)快速發(fā)展，基因療法研發(fā)加速，并受到資本市場的持續(xù)關(guān)注。國內(nèi)多家基因藥物開發(fā)公司加碼基因療法賽道，在研管線覆蓋罕見病、眼科、中樞神經(jīng)系統(tǒng) 基因療法是一種通過將正?；蛴兄委熥饔玫耐庠椿?qū)氚屑?xì)胞，置換或糾正患者的致病基因的方法。使用介導(dǎo)載體將目的基因?qū)氚屑?xì)胞，這些或者位于染色體外但仍能在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯。這種治療方法能夠改變細(xì)胞原有的基因表達(dá)，從而達(dá)到治療疾病的目的。其核心在于精準(zhǔn)打擊疾病根源——異常DNA，實現(xiàn)“一《柳葉刀》發(fā)表的一篇綜述（PMID:37699417）指出，基因療法整體上可以分為基因增補(bǔ)▲基因療法分類：A為基因增補(bǔ)療法，B為基因編輯療法基因增補(bǔ)療法主要用于治療由單一基因缺陷引起的性纖維化、血友病和某些遺傳性視網(wǎng)膜病變），基因編輯療法通過編輯技術(shù)（如CRISPR/Cas9）直接在患者的DNA層面上修改或修復(fù)缺陷基因，這種方法不是添加新基因，而是更改現(xiàn)有的基因序列。該療法在或是與相應(yīng)的基因結(jié)合，影響原有基因的功能。基因增補(bǔ)是目前已上市和臨床在研階段的載體的選擇尤為重要，載體主要有兩個重要功能：一個是保護(hù)殼內(nèi)的“脆弱貨物”，二個根據(jù)技術(shù)方式的不同，F(xiàn)DA又將基因治療產(chǎn)品分為質(zhì)粒DNA基因治療產(chǎn)品、病毒載體基細(xì)胞基因治療產(chǎn)品一般指的細(xì)胞療法不在本文探討范圍，本文不做探討，細(xì)菌載體基因治療產(chǎn)品目前處于臨床早期研發(fā)階段，在本文第一章也不做更多介紹。此外，質(zhì)粒DNA、病毒載體多應(yīng)用于基因增補(bǔ)療法，其中質(zhì)粒DNA屬于一種非病毒載體。病毒載體有腺相關(guān)病毒(AAV)、腺病毒（Ad）、慢病毒（LV）和逆轉(zhuǎn)錄病毒（RV）。下面將簡要介紹這的線狀單鏈DNA基因和蛋白質(zhì)衣殼的無包膜病毒，最早在恒河猴腎細(xì)胞的培養(yǎng)物中首次▲AAV基因組結(jié)構(gòu)AAV是目前發(fā)現(xiàn)的一類結(jié)構(gòu)最簡單的單鏈DNA缺陷型病毒，所以無自主復(fù)制能力，需要與輔助病毒(腺病毒或皰疹病毒)進(jìn)行共感染以便復(fù)制。目前的科學(xué)界共識是AAV不會導(dǎo)致任何人類疾病，大多數(shù)成年人都感染過AAV病毒，但尚未發(fā)現(xiàn)該病毒是任何疾病的AAV基因組中唯一被保留的部分是包裝信號的反式DNA序列（即ITR它起到指導(dǎo)基因組的復(fù)制和病毒載體組裝的作用。將編碼病毒蛋白的部分完全刪除的優(yōu)點(diǎn)是：一方面可以最大化重組AAV攜帶轉(zhuǎn)基因的容量，另一方面減小體內(nèi)遞送轉(zhuǎn)基因時產(chǎn)生的免疫原性已經(jīng)有幾款使用AAV載體的藥物相繼獲批。2012年獲歐盟批準(zhǔn)上市的Glybera是第一款A(yù)AV有13種常見的血清型AAV1~13，還存在AAV-DJ、AAV-DJ/8等血清型，不同的血清型對組織或器官有著不同的親和性，其中AAV2、AAV3、AAV9源自人類本身，是迄今研究最為徹底、應(yīng)用最為廣泛的腺相關(guān)病毒載體。在小鼠肝臟轉(zhuǎn)導(dǎo)效率影響的實驗中，發(fā)現(xiàn)效率最高的是AAV8血清型載體；AAV9型病毒載體能夠有效轉(zhuǎn)染中樞神經(jīng)；在視網(wǎng)膜的轉(zhuǎn)染實驗中，AAV5血清型載體轉(zhuǎn)染效率優(yōu)于AAV2血清型載體；在對肌肉組織進(jìn)行基因治療時，AAV1和AAV7型血清型載體要優(yōu)于AAV2、AAV3、AAV4、AAV5血清型載體。表2不同血清型AAV的受體及靶向目標(biāo)基因治療中所用的是不需要輔助病毒的重組腺相關(guān)病毒（RecombinantAAV，rAAV和相關(guān)功能片段，僅保留兩端反向末端重復(fù)序列，在質(zhì)粒中表達(dá)rAAV感染細(xì)胞。病毒編碼序列的完全去除一方面可以最大化重組AAV攜帶轉(zhuǎn)基因的容量，另一方面可減小在體內(nèi)遞送時的免疫原性和細(xì)胞毒性。這也就是我們所說的AAV載體。rAAV與AAV的區(qū)別在于內(nèi)部基因不同，外殼相同。由于AAV根據(jù)不同的衣殼蛋白有不同的血清型，所以rAAV作為基因治療的遞送載體也有不同血清型。目前文獻(xiàn)中使用最多目前大多數(shù)基因治療用rAAV以AAV2基因組為骨架，基因組全長為4679bp，兩端為碼區(qū)，含有兩個開放閱讀框（ORF），左側(cè)ORF編碼4種序列相互重疊的基因，分別編碼Rep78、Rep68、Rep52、Rep40等四種參與病毒基因復(fù)制的蛋白，右側(cè)ORF編碼3種▲AAV重組示意圖的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。在內(nèi)吞形成的內(nèi)體(endosome)酸化之后，病毒衣殼的VP1/VP2部分構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致病毒從內(nèi)體中脫離，并且通過核孔進(jìn)入細(xì)胞核。進(jìn)入細(xì)胞核后，單鏈DNA從衣殼中釋放出來。這時單鏈DNA還不能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，它們需要變成雙鏈DNA。單鏈DNA可以利用宿主細(xì)胞的DNA聚合酶來合成互補(bǔ)鏈，或者兩條從不同AAV顆粒中雙鏈形式的AAV基因組然后利用ITRs進(jìn)行分子內(nèi)或分子間基因組重組，這一過程讓AAV基因組成為穩(wěn)定的游離DNA(episomalDNA)，導(dǎo)致基因組能夠在不再進(jìn)行有絲分裂▲重組AAV載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達(dá)rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞主要有識別細(xì)胞表面受體、內(nèi)吞、逃離內(nèi)體、入核、脫衣殼、雙鏈轉(zhuǎn)化、1）rAAV被靶細(xì)胞表面糖基化修飾的受體識別；3）rAAV在細(xì)胞骨架蛋白網(wǎng)絡(luò)的幫助下由細(xì)胞胞漿向細(xì)胞核運(yùn)輸；4）在內(nèi)體的酸性環(huán)境下，rAAV的衣殼蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，暴露出VP1和VP2的N末端，rAAV病毒粒子從晚期內(nèi)體中釋放出來；5）逃離內(nèi)體后的rAAV或者由蛋白酶體進(jìn)行蛋白降解，或者進(jìn)入細(xì)胞核；6）rAAV病毒粒子一旦進(jìn)入細(xì)胞核，就會脫殼并釋放其單鏈基因組，并復(fù)制形成雙鏈DNA(dsDNA)模板；7）在雙鏈DNA模板上進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯為治療性蛋白質(zhì)。腺病毒（Ad）是一種無包膜的雙鏈DNA病毒，其直徑為70至90nm，可容納26-45kb的線性雙鏈DNA基因組。到目前為止，人們已經(jīng)開發(fā)了三代腺病毒載體。第一代腺病毒載力下降，總體產(chǎn)量仍然很低。第三代腺病毒載體，除ITR和均被剔除。與第一代和第二代腺病毒載體相比，這些病毒載體的免疫毒性大大降低，但仍如上所述，腺病毒載體的優(yōu)勢在于其載體容量大，另外，其制備及純化過程相對簡單，且能感染分裂和非分裂細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的效率高，從而讓目標(biāo)細(xì)胞獲得目的基因的高效表達(dá)。研究表明，腺病毒載體是適用于各種細(xì)胞和組織類型的有效的基因遞送系統(tǒng)為人類大多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞膜表達(dá)有兩個必要的受體，即負(fù)責(zé)腺病毒與細(xì)胞粘附接觸的柯薩奇腺病毒受體(CAR)和負(fù)責(zé)將腺病毒內(nèi)化的整合素型受體。腺病毒載體在基因治療臨床應(yīng)用方向上，可被改造為復(fù)制缺陷型腺病毒載體或選擇性復(fù)制的溶瘤腺病毒。目前，有幾款基于腺病毒載體的基因治療藥物獲批上市，例如基于非復(fù)制型腺病毒載體用于治療卡介苗（BCG）無響應(yīng)的高風(fēng)險非肌層浸潤性膀胱癌（NMIBC）的Adstiladrin。將目的基因整合進(jìn)宿主基因組，且又不能像重組AAV病毒載體基因組那樣以附加體的形式存在，因此，非復(fù)制型腺病毒載體搭載的目的基因在目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)只能獲得短暫的瞬時表達(dá)，因此，在大部分單基因遺傳病基因治療方面應(yīng)用較少。此外，腺病毒載體的免疫原性LV是基因治療中廣泛使用的基因遞送載體，可在高度分化的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中穩(wěn)定整合并長期表達(dá)。LV是由單鏈RNA組成的球形結(jié)構(gòu)，封裝體積約為8kb。LV可以將外源片段隨機(jī)插入細(xì)胞基因組，因此可以在體內(nèi)長期表達(dá)目的基因，同時LV載體具有表達(dá)時間長、安LV基因組進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)胞漿中反轉(zhuǎn)錄為DNA，形成DNA整合前復(fù)合體，進(jìn)入細(xì)胞核后，DNA整合到細(xì)胞基因組中。整合后的DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA，回到細(xì)胞漿中，表達(dá)目的蛋白或產(chǎn)生小RNA。LV介導(dǎo)的基因表達(dá)或小RNA干擾作用持續(xù)且穩(wěn)定，并隨細(xì)胞基因組▲LV作為CGT遞送載體的作用機(jī)制LV主要用于體外基因療法，使用基因修飾的造血干/祖細(xì)胞治療各種遺傳疾病。目前有一百多項使用LV的基因治療試驗正在進(jìn)行中，幾種基于LV的基因治療藥物（如并且在感染能力上有了巨大的提升。但是這并不代表著慢病毒體系的絕對安全。慢病毒在LV已成為基因治療中一個很有前景的選擇。盡管存在插入突變、低滴度、高成本等諸多挑戰(zhàn)，但LV治療在白血病、血友病、帕金森病等多種疾病上已取得突破性進(jìn)展。未來，在提高其治療用途的安全性和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率之后，新一代的LV應(yīng)該有望成為人類基因治療的逆轉(zhuǎn)錄病毒（RV）是第一個在體內(nèi)基因治療的臨床試驗中被研究的病毒載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種有包膜的球形病毒，以RNA的形式攜帶其遺傳物質(zhì)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以將其遺傳物質(zhì)(單鏈RNA)反向轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，并整合到宿主細(xì)胞的基因組中。并由于它們整合到宿主基因組中而導(dǎo)致基因的長期表達(dá)。然而，幾個主要缺點(diǎn)限制了它們的應(yīng)用。首先，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體需要細(xì)胞分裂才能將其DNA整合到宿主基因組中，因此它們只能轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂中的細(xì)胞。此外，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有將其DNA隨機(jī)插入宿主染色體并導(dǎo)致插入突變的風(fēng)險。為了降低插入突變的風(fēng)險，已開發(fā)出具有長末端重復(fù)序列啟動子或療法，其腫瘤靶向能力歸因于病毒載體上展示的一種冷凍SIG結(jié)合肽，盡管病毒載體通過細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)有效地傳遞基因治療藥物，但它們的高免疫原性和高突變風(fēng)險?使用非病毒載體更容易實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)和化學(xué)表征，能夠大規(guī)非病毒載體主要有裸露的DNA、質(zhì)粒、脂質(zhì)體納米粒（LNPs）、微球粒，以及內(nèi)源性的但目前工程化、量產(chǎn)化的CMC、純化等工藝問題還存在不少瓶頸。LNP是由磷脂生物分子定向形成的，可以包裹脂溶性和水溶性藥物，通過與細(xì)胞膜融合將遺傳藥物輸送到體內(nèi)。LNP具有藥物靶向性和良好的生物相容性、降低藥物毒性、克服耐藥性、促進(jìn)內(nèi)體逃逸等優(yōu)點(diǎn).因此，LNPs已廣泛應(yīng)用于基因治療藥物的遞送，其中性脂質(zhì)形成的陽離子脂質(zhì)體是傳遞基因治療藥物的主要力量。陽離子脂質(zhì)體攜帶的正電荷可以與靶基因上的負(fù)電荷相互作用形成穩(wěn)定的復(fù)合物并且增加循環(huán)時間從而提高轉(zhuǎn)染效包括外泌體-脂質(zhì)體雜化納米顆粒、DOTAP脂質(zhì)體，透明質(zhì)酸修飾的陽離子niosomes。外泌體是細(xì)胞分泌的一種納米級（40-100nm）的囊泡，在細(xì)胞間物質(zhì)運(yùn)輸和信號通延長循環(huán)時間、穿透深層組織等優(yōu)點(diǎn)。由于不同細(xì)胞來源的外泌體的潛在生物學(xué)功能差異較大，因此外泌體的來源存在爭議，存在促進(jìn)腫瘤生長和免疫抑制的風(fēng)險。Gyorgy等人構(gòu)建了外泌體AAV通過將外泌體與腺相關(guān)病毒偶聯(lián)來進(jìn)行載體。引人注目的是，exo-AAV9轉(zhuǎn)導(dǎo)了幾乎95%的內(nèi)毛細(xì)胞(IHC)和外毛細(xì)胞(OHC)。常規(guī)AAV1-GFP載體轉(zhuǎn)導(dǎo)約20%的IHC和OHC，而exo-AAV1-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)高達(dá)65%的IHC和50%的OHC，表明exo-AAV1-GFP比常規(guī)AAV1-GFP更有效，并且它可能是一種重要的耳聾轉(zhuǎn)基因載體。外目前市場上有2種非病毒載體的基因療法產(chǎn)品。Neovasculogen是第一個非病毒基因治療產(chǎn)品，由人類干細(xì)胞研究所（俄羅斯）開發(fā)。它由編碼血管內(nèi)皮生長因子（VEGF-165）長因子（HGF）基因的質(zhì)粒DNA。因原位替換病變細(xì)胞內(nèi)的致病基因，或定點(diǎn)導(dǎo)入外源正常基因替代缺陷基因（點(diǎn)特異性修復(fù)），使細(xì)胞內(nèi)的DNA完全恢復(fù)正常狀態(tài)。這種治療方法在設(shè)計上最為理想，但技術(shù)上自20世紀(jì)70年代重組DNA技術(shù)發(fā)展以來，有關(guān)位點(diǎn)特異性核酸酶的基礎(chǔ)理論研究取得了突破性進(jìn)展，使精準(zhǔn)基因編輯技術(shù)快速普遍應(yīng)用于各個領(lǐng)域。較早被廣泛應(yīng)用于基因工程技術(shù)中的兩種基因編輯技術(shù)是鋅指核酸酶（ZFN）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALENs）。但這兩種核酸酶存在結(jié)構(gòu)復(fù)雜、不易操作、耗時長、易脫靶等諸多局限，而CRISPR/Cas是繼ZFN、TALENs之后的第三代編輯技術(shù)，自2012年科學(xué)家們利用位點(diǎn)特異性人工核酸內(nèi)切酶Cas9系統(tǒng)在原核、真核生物的基因組編輯中取得成功而正式走進(jìn)科研人員的視野。CRISPR/Cas9作為一種全新的技術(shù)具有在基因組中定點(diǎn)編輯的能力，具▲CRISPR基因編輯系統(tǒng)發(fā)展歷程對于基因編輯機(jī)制來說，其核心來源于三個要素，即人體的DNA修復(fù)機(jī)制、基因編輯基因編輯過程是通過在預(yù)定的目標(biāo)序列上引入DNA雙鏈斷裂（DSB）來啟動的。隨后，細(xì)胞DNA修復(fù)機(jī)制會感知DSB，并通過特定的修復(fù)機(jī)制達(dá)成基因編輯治療的目標(biāo)。DNA修復(fù)機(jī)制具體可分為兩大類，即非同源末端連接（NHEJ）和同源定向修復(fù)（HDR）?！鳱HEJ和HDR修復(fù)示意圖NHEJ是指在沒有供體模板的情況下DNA雙鏈斷裂的末端會通過細(xì)胞自我修復(fù)機(jī)制重新連接在一起。但這個過程中會導(dǎo)致一些額外的堿基插入到連接處，稱為引入插入最終導(dǎo)致基因的序列發(fā)生改變，進(jìn)而可能會影響蛋白質(zhì)編碼區(qū)的氨基酸序列。因此，NHEJ是一種快速但不精確的修復(fù)方式，其通常用于由特定基因異?；顒踊虍惓１磉_(dá)引起的疾病（例如癌癥、傳染病等）。具體來說，通過對該基因引入額外片段或刪除部分片段從而導(dǎo)致基因的失活或“敲除”。HDR是指DNA斷裂修復(fù)過程中借助供體DNA修復(fù)模板（同源DNA序列所需序列的修復(fù)模板可以單鏈寡脫氧核苷酸（ssODN）或雙鏈DNA（dsDNA）的形式提供。斷裂的DNA鏈與同源DNA序列進(jìn)行配對，形成一個DNA復(fù)合體。在復(fù)合體中，供體導(dǎo)向性地合成新的DNA鏈，替換斷裂的片段。與NHEJ相比，其是一種相對更精確的修復(fù)。通常用于將突變的基因修復(fù)為正常的基因，以逆轉(zhuǎn)由于基因突變而導(dǎo)致的疾病類DNA能夠進(jìn)行修復(fù)的前提是需要進(jìn)行DNA鏈的斷裂，而這需要人工設(shè)計用來斷鏈DNA雙鏈的工程內(nèi)切酶和單鏈向?qū)NA（sgRNA）。對于sgRNA的設(shè)計是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，設(shè)計出與需要編輯DNA序列相匹配的序列，從而為工程酶提供指引工作。整體上，sgRNA的設(shè)計較為簡潔明了。而對于工程內(nèi)切酶來說，由于包含了很多復(fù)雜的類型和作用機(jī)制，因此，整個系統(tǒng)較為復(fù)雜。科研人員探索了許多類型的工程內(nèi)切酶，目前主?大范圍核酸酶(MegN)是天然存在的內(nèi)切脫氧核糖核酸酶，存在于所有形式的微生物?鋅指核酸酶是人工設(shè)計的限制性內(nèi)切酶，用于定制位點(diǎn)特異性基因組編輯。鋅指本身是轉(zhuǎn)錄因子，每個鋅指識別3-4個堿基。鋅指核酸酶是雜合異二聚體蛋白，其中每個亞基包含一個由多個鋅指組成的結(jié)構(gòu)域和一個Fok1核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，二者共同DSB形成。?TALEN與ZFN相似，它是一種人工嵌合蛋白，是通過將非特異性FokI限制性核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域與識別任意堿基序列的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合而產(chǎn)生的工具酶。?II型CRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用最為廣泛，該系統(tǒng)僅包含作為核酸酶的Cas9蛋白，Cas9蛋白由CRISPRRNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）組成的雙RNA分子靶向引導(dǎo)至其DNA靶序列。sgRNA引導(dǎo)的Cas9蛋白在靶序列定位后，由Cas9蛋白的兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域引入DSB，分別裂解兩條DNA鏈中的一條。四種工程酶對比來看，TALEN具有相對更好的靶向特異性和低脫靶效應(yīng)，但遞送難度相對較難。而CRISPR/Cas最為突出的方面是設(shè)計難度低，且具有成本效益。與MegNs、ZFN和TALEN不同，CRISPR/Cas系統(tǒng)的DNA識別是基于RNA-DNA互動，而并非基于人工蛋白質(zhì)的序列識別，這種特點(diǎn)帶來了多個優(yōu)勢，例如任何基因組靶標(biāo)的輕松設(shè)計、脫靶位點(diǎn)的輕松預(yù)測以及同時修改多個基因組位點(diǎn)的可能性。同時也使得DNA識別部分的基因編輯技術(shù)是指用可編輯的核酸酶識別基因組特定位點(diǎn)并介導(dǎo)DNA雙鏈斷裂（double-strandbreaks,DBS），隨后誘發(fā)內(nèi)源性DNA修復(fù)機(jī)制，從而實現(xiàn)對DNA序列的定點(diǎn)修飾的技術(shù)，包括靶向敲除或插入基因。目前，基因術(shù)：ZFN技術(shù)、TALEN技術(shù)、CRISPR/Cas9技術(shù)及其衍生技術(shù)。然DNA轉(zhuǎn)錄因子衍生而來，其功能實現(xiàn)基于特異性識別DNA的鋅指蛋白（ZFP）和FokI內(nèi)切酶的核酸酶結(jié)構(gòu)域組成。每個鋅指蛋白可識別3個堿基序列，研究者可通白的排列組合進(jìn)行不同靶向指定編輯。通常使用的鋅指蛋白篩選手段是噬菌體展示，以達(dá)特別是在第二、三代基因編輯技術(shù)被開發(fā)出來之后，鋅指蛋白的研究和臨床使用頻率大為▲ZFNs基因編輯技術(shù)而來。與ZFNs不同的是，該技術(shù)使用兩個氨基酸組合來識別單個堿基序列，從而大大減少了ZFNs容易脫靶的問題。得益于其低脫靶率，TALENs技術(shù)常被細(xì)胞治療平臺用于體外細(xì)胞堿基的編輯，特別是在嵌合抗原受體T細(xì)胞治療平臺開發(fā)中。然而依舊高昂▲TALENs基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas技術(shù)基于原核生物抵御外來病毒及質(zhì)粒DNA的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)開發(fā)的第三代基因編輯技術(shù)。通過人工設(shè)計的sgRNA（guideRNA）識別目的基因組序列，引導(dǎo)Cas蛋白酶有效切割DNA雙鏈，最終達(dá)到對基因組DNA進(jìn)行修飾的目的。其中Cas9蛋白和Cpf1蛋白是最常用的蛋白酶。作為當(dāng)今最廣泛使用的基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas平臺較ZFNs和TALENs具有低價格、高靈活性、多靶向等優(yōu)勢，促使從科研到臨床的快速除了基因編輯本身的眾多機(jī)制研究，如何將所需要的目標(biāo)序列/編輯系統(tǒng)遞送至細(xì)胞核內(nèi)也十分重要。同樣，這對于基因增補(bǔ)治療來說也非常重要。通常，基因增補(bǔ)療法遞送物通常是所需要的DNA序列；而對于CRISPR基因編輯來說，其可以以編碼的質(zhì)粒DNA（pDNA）、mRNA、或直接作為核糖核蛋白復(fù)合體（RNP）三種形式通過病毒（如AAV、LV）或非病毒載體（LNP、VLP等）遞送到細(xì)胞中，歷經(jīng)不同的胞內(nèi)過程，在sgRNA的導(dǎo)向下，完成靶基因的編輯進(jìn)而發(fā)揮作用。在臨床應(yīng)用中，由于質(zhì)粒DNA、mRNA以及RNP復(fù)合體三者本質(zhì)不同，并具備不同的胞內(nèi)過程，因此三者的生產(chǎn)難度、穩(wěn)定性、起效時間、編輯效率、脫靶效應(yīng)和安全性等方面pDNA介導(dǎo)的CRISPR基因編輯pDNA介導(dǎo)的CRISPR/基因編輯，即將Cas9蛋白和sgRNA編碼進(jìn)單個或多個質(zhì)粒DNA載體中，該策略由于質(zhì)粒DNA易于構(gòu)建、操作簡單且成本低等優(yōu)勢而成為一種極具吸引然而，這方式也存在一些局限性，如編碼后pDNA的尺寸過大會顯著增加CRISPR/Cas9系統(tǒng)遞送和表達(dá)的難度；pDNA進(jìn)入細(xì)胞核后的轉(zhuǎn)錄過程會降低基因編輯的效率并且還會導(dǎo)致治療過程的延遲；此外，基于pDNA的表達(dá)通常會導(dǎo)致這可能會導(dǎo)致更高的脫靶效應(yīng)和強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答等。因pDNA形式，以AAV為載體，將Cas9蛋白編碼基因和向?qū)NA編碼基因遞送至體內(nèi)。EDIT-101、EDIT-103此前公布的臨床療效均可圈可點(diǎn)，但遺憾的是，在2023年1月該公司公布的戰(zhàn)略調(diào)整中，由于疫情、患者群體少以及未來商業(yè)模式等因素，公司已將這兩款mRNA介導(dǎo)的CRISPR基因編輯mRNA介導(dǎo)的CRISPR基因編輯是指將Cas9mRNA和sgRNA共同遞送至靶細(xì)胞。該方法與質(zhì)粒DNA相比，mRNA在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)換速度更快，可以較快啟動基因編輯；與此同時，由于mRNA不需要再進(jìn)入細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄，因此能夠?qū)┝窟M(jìn)行精確控制，同時限制了蛋白質(zhì)的持久性，有助于降低CRISPR系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)。但相較而言，mRNA的穩(wěn)定性相對較差，為了實現(xiàn)對mRNA高效且精準(zhǔn)的遞送，在載體的設(shè)計方面必須保護(hù)mRNA免受胞外核酸酶的降解。目前，從臨床布局管線來看，以mRNA形式介導(dǎo)的CRISPR基因編輯是目前應(yīng)用最多的策用了mRNA形式進(jìn)行編輯工具的遞送。RNP介導(dǎo)的CRISPR基因編輯對于CRISPR/Cas系統(tǒng)來說，最高效的打開方式就是跳過pDNA或mRNA在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄或翻譯，而是將Cas9蛋白和sgRNA直接進(jìn)行遞送，這可以最大程度地降低脫靶效應(yīng)。目前大部分基于Cas9蛋白的遞送體系都是以RNP（核糖核蛋白）的形式進(jìn)行遞送。RNP復(fù)合體由Cas9蛋白和sgRNA組成，該方法具有以下優(yōu)勢：?Cas9-gRNA復(fù)合體可遞送到多種類型的細(xì)胞中，包括難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如免疫細(xì)胞和干細(xì)胞，這一優(yōu)勢很大程度上決定了Cas9-gRNARNP的臨床治療潛質(zhì)；?將RNP直接遞送至細(xì)胞，可以解決某些罕見真核啟動子導(dǎo)致的蛋白質(zhì)表達(dá)困難，如許多CRISPR質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)的CMV或EF1A啟動子，保證較高的基因編輯效率；?Cas9RNPs轉(zhuǎn)染后很快就能檢測到高水平的Cas9RNPs，隨后通過蛋白質(zhì)降解途徑迅速但與此同時，RNP介導(dǎo)的CRIPR基因編輯也面臨一定的挑戰(zhàn)。首先，Cas蛋白注入血液后易被蛋白酶降解；其次，RNP分子較大，可能限制其穿透細(xì)胞膜。因此，目前RNP形式的應(yīng)用多限于體外，通過電穿孔等物理手段可實現(xiàn)較高效率的入胞入核，但要應(yīng)用于體內(nèi)，需要開發(fā)合適的遞送載體解決以上難題。另一方面，生產(chǎn)過程中需保證基于RNP遞送方式的CRISPR基因編輯技術(shù)已受到一定程度的認(rèn)可并展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用形成RNP復(fù)合物，通過使用Cas9蛋白在體外對患者造血干細(xì)胞的BCL11A增強(qiáng)子位點(diǎn)進(jìn)行編輯，提高胎兒血紅蛋白（HbF）的表達(dá)量從而達(dá)到治療目的。通過對比來看，DNA形式的遞送對于治療多基因病RNP形式的遞送能夠在編輯速度、安全性方面有較大的優(yōu)勢。但無論是DNA/RNA形式還是RNP形式，都要克服一些進(jìn)入細(xì)胞的障礙：?由于基因的磷酸基重復(fù)鏈構(gòu)成的聚陰離子特性，其表面帶有負(fù)電荷。同時，細(xì)胞膜也呈現(xiàn)負(fù)電性。因此，在靜電排斥的作用下，基因難以與細(xì)胞膜產(chǎn)生有效的相互作用。?RNP形式則由于更大的分子量以及導(dǎo)向RNA的陰離子屬性，同樣存在入胞困難的問題。因此，為了解決入胞障礙，目前產(chǎn)生了三大類解決方送、物理遞送。其中病毒載體因其自然進(jìn)化感染宿主細(xì)胞并將其遺傳物質(zhì)傳送到細(xì)胞核的在基因療法中的發(fā)展較為緩慢，但其也有較為突出的優(yōu)勢，隨著技術(shù)地不斷改進(jìn)，未來仍有潛力成為具有商業(yè)化價值的遞送工具。對于物理遞送來說，各類細(xì)分技術(shù)容易對細(xì)胞造成損傷，此外，物理遞送對于設(shè)備、場所、遞送操作均有一定要求，因此并不適合作為一種常規(guī)藥物治療的方式，而更多是賦能于細(xì)胞療法的體外編輯操作，亦或是實驗室科研場經(jīng)長期科研和臨床實踐及探索,基因療法按治療途徑又可劃分為體內(nèi)基因療法是指將攜帶治療性基因的載體工具直接遞送到患者體內(nèi)，以糾正或補(bǔ)和異常基因引起的疾病。載體工具主要分為非病毒載體（如質(zhì)粒DNA病毒載體，細(xì)菌載體等，病毒載體在臨床應(yīng)用中最為廣泛。病毒載體是通過改造病毒自身片段并借助其高效率侵染機(jī)制攜帶治療性基因進(jìn)入特定組織或者全身，以達(dá)到治療疾病的目的，具有高效，光譜，長期穩(wěn)定表達(dá)，生物相容性高等優(yōu)點(diǎn)。目前使用最廣泛的兩種病毒載體是腺相體內(nèi)基因療法的原理是通過基因工程技術(shù)將正?；?qū)氲交颊叩募?xì)胞中，這些基因可以替代、糾正、失活、缺陷或缺失的基因，從而達(dá)到治療目的。其優(yōu)勢在于操作簡單、無需載體是一類天生有復(fù)制缺陷，免疫原性極低，安全性好，幾乎不整合進(jìn)基因組的病毒，表達(dá)穩(wěn)定持久，且不同血型有不同的組織向性的病毒載體。獲批藥物如2019年經(jīng)FDA批準(zhǔn)體內(nèi)基因編輯療法的優(yōu)勢是：適應(yīng)癥更多樣化——覆蓋更多適應(yīng)癥、靶細(xì)胞和靶器官，例如解決了神經(jīng)元體外培養(yǎng)失去功能等問題，適用于一些神經(jīng)系統(tǒng)遺傳疾病；周期與成本更優(yōu)——產(chǎn)品為納米顆粒或者病毒載體等通用型藥物，無須細(xì)胞制備流程，成本可控，有望將基因編輯系統(tǒng)直接注入體內(nèi)后，控制脫靶風(fēng)險難度更高；載體開發(fā)問題——需開發(fā)滿足1、編輯策略選擇：RNA編輯不會引起基因組序列改變，相對于DNA編輯更加安全可控，例如：輝大基因發(fā)現(xiàn)了Cas13X/Y，由于其僅靶向切割單鏈RNA，不會造成基因組改變，同時可避免Cas9專利限制；銳正基因同樣布局RNA編輯技術(shù)。2、編輯系統(tǒng)優(yōu)化：開發(fā)更精準(zhǔn)更緊湊的基因編輯酶工具，例如：中科院神經(jīng)所開發(fā)的高保真Cas13突變體（hfCas13d），高效降解靶標(biāo)RNA，同時顯著降低旁系切割活性；劉如謙團(tuán)隊開發(fā)的緊湊型腺嘌呤堿基編輯器，使用單AAV載體，編輯效率優(yōu)于雙AAV載體。3、遞送體系調(diào)整：探索瞬時性、組織特異性、高效安全的遞送方案，例如：本導(dǎo)基因選擇的VLP-mRNA遞送，實現(xiàn)瞬時性通過VLP遞送Cas9mRNA，通過修飾VLP的表面蛋病毒載體LNP。體外基因療法則將病人的靶細(xì)胞分離出來，經(jīng)過體外培養(yǎng)、擴(kuò)增和基因操作后，再將細(xì)胞輸回體內(nèi)。其原理是通過基因工程技術(shù)將正?；?qū)氲交颊叩募?xì)胞中，這些基因可以在細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，從而改變細(xì)胞原有的基因表達(dá)情況，達(dá)到治療目的。其優(yōu)勢在于技術(shù)難度較小，對于載體的要求較低，安全性較好，但需選擇合適的可移植細(xì)胞，且面臨如何長根據(jù)載體細(xì)胞類型的不同可分為兩大類：造血干細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等血液細(xì)胞和其他類型?血液細(xì)胞：收集分離病人血液中特定類型的細(xì)胞后，利用基因改造的方式對細(xì)胞錯誤?其他類型的細(xì)胞：以遺傳性大皰性表皮松解癥為例，治療時獲取病人小塊的皮膚，對皮膚細(xì)胞基因改造后，利用細(xì)胞自身的增殖能力，體外培養(yǎng)出較大的皮膚組織，再移截至2023年12月底已有20款基因療法產(chǎn)品獲批上市，基因療法迎來快速發(fā)展階段。尤其是近五年來，獲批上市的基因療法數(shù)量顯著增長。基因療法相關(guān)技術(shù)快速發(fā)展，AAV載體產(chǎn)品快速涌現(xiàn)，國內(nèi)多家基因療法領(lǐng)域公司已布局CRISPR、單堿基編輯（BE）、先導(dǎo)編輯（PE）等基因編輯技術(shù)，已有體內(nèi)基因編輯療法進(jìn)入臨床試驗，未來有望上市更多基因療法是全球突破性技術(shù)之一，《科學(xué)》雜志公布的2020年十大科學(xué)突破中也有基因療法的身影：通過CRISPR技術(shù)，首次在臨床上成功治療了兩種遺傳性血液疾病?；虔煼ǖ难芯糠秶h(yuǎn)遠(yuǎn)超出了傳統(tǒng)藥物，已成為治療單基因遺傳疾病的重要新方法。也是眾多因工程和藥物遞送技術(shù)的快速發(fā)展加速基因療法研發(fā)，應(yīng)用領(lǐng)域除遺傳病外還覆蓋到了惡近年來，基因療法在多個疾病領(lǐng)域取得了令人矚目的進(jìn)展。在遺傳性疾病方面，基因療法已成功應(yīng)用于治療先天性失明、血友病、杜氏肌營養(yǎng)不良癥等疾病。通過向患者體內(nèi)導(dǎo)入正常的基因，替代或修復(fù)缺陷基因，基因療法能夠恢復(fù)患者的正常生理功能，提高他基因療法可以實現(xiàn)對癌癥的有效控制和治療，同時減少對正常細(xì)胞的損傷。此外，在心血隨著基因療法技術(shù)的不斷成熟和臨床數(shù)據(jù)的積累，越來越多的國家和地區(qū)納入醫(yī)保體系，為患者提供了更為便捷和經(jīng)濟(jì)的治療選擇。這一舉措不僅體現(xiàn)了政府對基隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展和科研人員的不斷努力，基因療法的技術(shù)手段也在不斷創(chuàng)新和完善。從最初的基因替代到現(xiàn)在的基因編輯、基因調(diào)控等多樣化手段，基因療法的應(yīng)用領(lǐng)域正在不斷拓寬。然而，盡管基因療法展現(xiàn)出了巨大的潛力和廣闊的應(yīng)用前景，但其在實際療法，大部分適應(yīng)癥重要集中于單基因突變的罕見疾病。2023年12月8日，F(xiàn)DA批全球首款基因編輯療法CASGEVY，該療法使用CRISPR/Cas9技術(shù)，這一技術(shù)是利用電穿外基因編輯）的范疇。但該技術(shù)從原創(chuàng)基礎(chǔ)研究到臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的突破，是其基因治療發(fā)公司：由葛蘭素史克（GSK）公司研發(fā)。適應(yīng)癥：用于重癥聯(lián)合免疫缺陷癥（簡稱SCID）治療。備注：該療法大致流程是首先獲得患者自身的造血干細(xì)胞，在體外進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，用逆轉(zhuǎn)錄病毒將功能性ADA（腺苷脫氨酶）基因拷貝導(dǎo)入其造血干細(xì)胞，最后將修飾后的造血干細(xì)胞回輸?shù)奖救梭w內(nèi)。臨床結(jié)果顯示，Strimvelis治療的ADA-SCID患者3年存公司：由意大利MolMed公司生產(chǎn)。法使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對同種異體來源的T細(xì)胞進(jìn)行基因改造，使基因修飾后的T細(xì)胞表達(dá)1NGFR和HSV-TKMut2自殺基因，使得人們可以隨時使用更昔洛韋（ganciclovir）藥物殺死引起不良免疫反應(yīng)的T細(xì)胞，防止可能出現(xiàn)的GVHD進(jìn)一步惡化，為半相合HSCT患者術(shù)后免疫功能重建保駕護(hù)航。備注：Invossa-K是一種涉及人軟骨細(xì)胞的同種異體細(xì)胞基因療法，同種異體細(xì)胞經(jīng)體外白基因(βA-T87Q-珠蛋白基因）的功能性拷貝導(dǎo)入到從患者體內(nèi)取出的造血干細(xì)胞中，再將這些基因修飾的自體造血干細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，一旦患者擁有正常的βA-T87Q-珠蛋白基因，他們就有可能產(chǎn)生正常的HbAT87Q蛋白，即可有效降低或消除輸血需求。備注：Libmeldy是一款基于慢病毒體外基因修飾的自體CD34+細(xì)胞的基因療法。臨床數(shù)據(jù)顯示，單次靜脈輸注Libmeldy可以有效地改變早發(fā)型MLD的病程，未接受治療的同年適應(yīng)癥：用于治療早期腦腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良（CALD）。備注：Skysona基因療法是唯一一個獲批用于治療早期腦腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良（CALD）毒體外基因療法Lenti-D。療法大致流程為：從患者體內(nèi)取出自體造血干細(xì)胞，體外經(jīng)搭載人ABCD1基因的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)修飾后，回輸給患者。用于治療年齡在18歲以下、攜帶ABCD1基因突變、CALD患者。（7）CASGEVY上市時間：2023年12月8日獲FDA批準(zhǔn)上市，這是FDA批準(zhǔn)上市的首款CRISPR基因編備注：ExagamglogeneAutotemcel（Exa-cel，CASGEVY?)是一種一次性單劑細(xì)胞基因治療藥物，由經(jīng)過CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯的自體CD34+人類造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞(hHSPC)組成，發(fā)揮基因編輯作用的CRISPR-Cas9蛋白與sgRNA在體外經(jīng)電穿孔的方式被遞送到患者的離體細(xì)胞內(nèi)，CRISPR復(fù)合體會結(jié)合在位于BCL11A基因內(nèi)含子上的紅細(xì)胞特異性增強(qiáng)子中--轉(zhuǎn)錄因子GATA1的結(jié)合區(qū)域，在引入DSB后，利用NHEJ產(chǎn)生突變，破壞該增強(qiáng)子，降低BCL11A在紅細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平，從而特異性提高HbF在紅細(xì)胞中的表達(dá)，HbF水平的升高能夠緩解或消除SCD患者的疼痛及血管閉塞性危象(VOC)，并且能緩解輸血依賴性β-地中海貧血（TDT）患者的輸血需求，使TDT患者擺脫長期輸（8）LYFGENIA通過慢病毒載體將功能性β珠蛋白基因永久添加到患者自身的造血干細(xì)胞（HSC）中，可持久產(chǎn)生具有抗鐮狀細(xì)胞特性的血紅蛋白（HbAT87Q型HbAT87Q型與野生型HbA具有相似的氧結(jié)合能力，限制紅細(xì)胞鐮狀化，并有可能減少血管閉塞事件（VOE這是一種一次性療法。在藍(lán)鳥生物公布的一項為期24個月、涉及12至50歲鐮刀型細(xì)胞貧血病和VOE病史患者的單臂多中心研究中，表明Lyfgenia的安全性與有效性良好，該臨床研究對Lyfgenia輸注后6至18個月內(nèi)實現(xiàn)VOE完全消退（VOE-CR）的患者進(jìn)行其中的28位（88%）成功達(dá)到了VOE-CR，這其中包括了8例青少年患者。適應(yīng)癥：治療嚴(yán)格限制脂肪飲食卻仍然發(fā)生嚴(yán)重或反復(fù)胰腺炎發(fā)作的脂蛋白脂酶缺乏癥AAV作為載體，將治療基因LPL轉(zhuǎn)導(dǎo)入肌細(xì)胞，從而使相應(yīng)的細(xì)胞能夠產(chǎn)生一定數(shù)量的脂蛋白脂酶，起到緩解疾病的作用，該療法，一次給藥長期（藥效可持續(xù)多年）有效。該藥物于2017年退市，其退市原因可能與定價太高、市場需求受限兩大因素有關(guān)。該藥物司對其報銷了90萬美元，但對于保險公司而言這也是較大的負(fù)擔(dān)。此外，該藥物針對的適應(yīng)癥：用于因雙拷貝RPE65基因突變所致視力喪失但保留有足夠數(shù)量的存活視網(wǎng)膜細(xì)備注：Luxturna是一款基于AAV的基因療法，給藥方式是視網(wǎng)膜下注射。該基因療法以AAV2作為載體，將正常RPE65基因的功能性拷貝導(dǎo)入患者視網(wǎng)膜細(xì)胞，使相應(yīng)細(xì)胞細(xì)胞表達(dá)正常的RPE65蛋白，彌補(bǔ)患者RPE65蛋白缺陷，從而改善患者視力。備注：Zolgensma是一款基于AAV載體的基因療法，該款藥物是全球唯一一款獲批上市的脊髓性肌萎縮癥一次性治療方案，藥物的上市開啟了脊髓性肌萎縮癥治療新的一頁，是一項里程碑式的進(jìn)展。此基因療法用scAAV9載體經(jīng)靜脈輸注將正常SMN1基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，產(chǎn)生正常的SMN1蛋白，從而改善運(yùn)動神經(jīng)元等受累細(xì)胞的功能。相比之下，治療適應(yīng)癥：針對芳香族L-氨基酸脫羧酶(AADC)缺乏癥，被批準(zhǔn)用于治療年齡為18個月及體內(nèi)基因療法，患者由于編碼AADC酶的基因出現(xiàn)突變而致病，AAV2攜帶編碼AADC酶的健康基因，以基因補(bǔ)償?shù)男问竭_(dá)到治療效果，理論上一次給藥長期有效，是第一個直接注入大腦的上市基因療法，上市許可適用于所有27個歐盟成員國，以及冰島、挪威和適應(yīng)癥：用于治療無FVIII因子抑制史且AAV5抗體陰性的嚴(yán)重血友病A成人患者。啟動子HLP驅(qū)動Bdomain刪除了的人凝血因子八（FVIII）的表達(dá)。歐盟委員會批準(zhǔn)上市的決定是基于該藥物臨床開發(fā)項目的整體數(shù)據(jù)，其中，III期臨床試驗GENEr8-1結(jié)果顯示，與入組前一年的數(shù)據(jù)相比，單次劑使用頻率降低，或者體內(nèi)血液中F8活性顯著增加。在接受治療4周后，受試者使用率和需要接受治療的ABR分別降低了99%和84%，統(tǒng)計學(xué)差異顯著（p<0.001）。安全性良好，沒有受試者出現(xiàn)F8因子抑制、惡性腫瘤或血栓副作用，也沒有報告與治療相（6）Hemgenix備注：Hemgenix是一款基于AAV5載體的基因療法，該藥物搭載有凝血因子IX（FIX）基因變體FIX-Padua，通過靜脈給藥，給藥后該基因可在肝臟中表達(dá)FIX凝血因子，分泌后適應(yīng)癥：用于治療4-5歲、可獨(dú)立行走的杜氏肌營養(yǎng)不良（DMD）兒童，此外，該藥品在外顯子8和/或外顯子9上存在缺失突變的DMD兒童中禁用。因療法，其搭載的DNA包含一個截短型抗肌萎縮蛋白基因，該基因受MHCK7啟動子/,是非人類靈長類動物來源的，預(yù)期可以降低患者對載體具有預(yù)存抗體的可能性（大約適應(yīng)癥：用于治療卡介苗（BCG）無響應(yīng)的高風(fēng)險非肌層浸潤性膀胱癌（NMIBC）。），治療方法從而將患者自身的膀胱壁細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樯a(chǎn)干擾素的微型“工廠”，從而增強(qiáng)患者直到對治療產(chǎn)生不可接受的毒性或復(fù)發(fā)高級別NMIBC?？傮w而言，使用Adstiladrin療法的入組患者中有51%獲得了完全緩解（膀胱鏡檢查、活檢組織和尿液中所見的所有癌癥跡備注：Vyjuvek是一款以基因改造后的單純皰疹病毒為載體的基因療法，該藥物被制成凝膠劑型，給藥方式為創(chuàng)口局部涂抹，給藥頻率約為每周一次。該病毒載體搭載COL7A1基因的正?？截?，可將該基因遞送至患者傷口部位的靶細(xì)胞內(nèi)。COL7A1基因可在靶細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)COL7蛋白，COL7蛋白分子可自行排列成細(xì)長的束，將表皮和真皮結(jié)合在一起，上市時間：2005年獲菲律賓食品與藥品管理局（BFAD）批準(zhǔn)上市。備注：Rexin-G是一種載基因的納米顆粒注射劑，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體向靶細(xì)胞引入細(xì)胞周期蛋白G1突變基因，特異地殺死實體瘤，給藥方式為靜脈輸注。作為主動尋找并摧毀轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞的腫瘤靶向藥物，對包括靶向生物制劑藥在內(nèi)的其它癌癥藥品無效的患者具備注：Neovasculgen是一種基于DNA質(zhì)粒的基因療法，將血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）日本本土基因治療藥物。此藥的主要成分是含人體肝細(xì)胞生長因子（HGF）基因序列的裸露質(zhì)粒，若注射該藥物到下肢肌肉，表達(dá)的HGF會促進(jìn)閉塞的血管周圍形成新的血管。中國目前已知的罕見病數(shù)量大約有2000余種。由于罕見病常常確診困難，有大量罕見病多發(fā)病于兒童期，缺乏有效治療手段。而基因療法有望成為一種有效的方法來治療這些疾病。此外，由于中國特有的人口結(jié)構(gòu)，中國擁有豐富的基因組學(xué)數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)可以為基2024年5月20日，CDE發(fā)布2023年中國新藥注冊臨床試驗進(jìn)展年度報告，2023年，藥物臨床試驗登記與信息公示平臺登記臨床試驗總量首次突破4000項。其中，2023年共登目前國內(nèi)基因療法尚處于早期階段，大多項目都處于臨床前和早期臨床階段，預(yù)估到技術(shù)路線匯總公司管線/藥品名載體/技術(shù)路線IND獲批時間適應(yīng)癥AAV等基因療法錦籃基因GC101AAV9-SMN12023.1.13治療SMA1/2錦籃基因GC301AAV-GAA2022/12/202023.3.29早發(fā)型龐貝病（IOPD）晚發(fā)型龐貝病華毅樂健GS1191-0445AAV-FVIII2023.1.16A型血友病紐福斯NFS-02rAAV2-ND12023.4.17ND1突變引起的Leber遺傳性視神經(jīng)病變（LHON）輝大基因HG004non-AAV2-PRE652023.4.18先天性黑蒙2型方拓生物FT-003AAV-VEGF拮抗劑2023.4.262023.8.21nAMD；糖尿病黃斑水腫方拓生物FT-004rAAV-hFIX2023.7.12B型血友病方拓生物FT-002rAAV-PRGR2023.11.6X連鎖視網(wǎng)膜色素變性（XLRP）安龍生物AL-001AAV-抗VEGF蛋白2023.4.28wetAMD嘉因生物EXG102-031rAAV-VEGF/ANG22023.1.19（美）2023.6.1（中）wetAMD至善唯新ZS802AAV-FVIII2023.6.28A型血友病天澤云泰VGM-R02bAAV-GCDH2023.7.13戊二酸血癥I型（GA-I）信念醫(yī)藥BBM-H803AAV-FVIII2023.7.24A型血友病諾潔貝生物NGGT001rAAV2-CYP4V22023.9結(jié)晶樣視網(wǎng)膜變性(BCD)九天生物SKG0106AAV-獨(dú)創(chuàng)抗VEGF2023.7.3（美）23.10.19（中）nAMD九天生物SKG0201AAV-SMN1獨(dú)特啟動子+優(yōu)化的人源SMN12023.12.121型SMA鼎新基因RRG001rAAV-VEGFR2023.11.6nAMD基因編輯療法本導(dǎo)基因BD111VLP-Cas9mRNA2023.4.28HSV-1病毒性角膜炎禾沐基因HGI-001LVV-HSC2023.12.20β-地中海貧血基因增補(bǔ)療法主要通過AAV等方式增補(bǔ)患者缺失的基因，2023年該類企業(yè)在國內(nèi)獲批新藥臨床試驗（IND）的有如下這些候選產(chǎn)品，簡介如下。4月6日，“GC101腺相關(guān)病毒注射液”新藥臨床試驗（IND）申請獲得國家藥品監(jiān)督管理局臨床默示許可，本次獲批適應(yīng)癥為3型脊髓性肌萎縮癥（3型SMA）。這是GC101注射液繼1型SMA及2型SMA獲批臨床試驗后的第三項新增適應(yīng)癥。GC101腺相關(guān)病毒注射液，是一款A(yù)AV載體基因藥物，也是該公司第2款申報IND的新藥。該藥物采用鞘內(nèi)給藥方式直接向中樞神經(jīng)系統(tǒng)遞送和補(bǔ)充SMN蛋白，改善SMA患脊髓性肌萎縮癥（SMA）是由于運(yùn)動神經(jīng)元存活基因1（SMN1）突變導(dǎo)致SMN蛋白功能缺陷所致的遺傳性神經(jīng)肌肉病，是造成嬰幼兒死亡的常染色體隱性遺傳疾病之一，已被納至1/11000之間，基因突變造成SMA患者體內(nèi)的SMN蛋白水平不同程度得降低，影響了3月29日，“GC301腺相關(guān)病毒注射液”新藥臨床試驗(IND)申請正式獲得國家藥品監(jiān)督管理局臨床默示許可。這是GC301注射液繼嬰兒型龐貝病臨床試驗(IND)獲批后的又錦籃基因設(shè)計開發(fā)的GC301注射液是用于治療龐貝病的AAV基因治療藥物，采用了一次性靜脈注射全身廣泛表達(dá)的策略，以期直接補(bǔ)償肝臟、心肌、骨骼肌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等組織的GAA酶基因缺陷。臨床前實驗結(jié)果顯示GC301注射液可以在單次靜脈注射后，在動物體內(nèi)廣泛轉(zhuǎn)導(dǎo)各個組織并表達(dá)具有活性的GAA蛋白，改善骨骼肌、心肌損傷，顯著增龐貝病（又稱糖原貯積?、蛐突蛩嵝喳溠刻敲溉狈ΠY）是一種由于酸性α-葡萄糖苷常在生后數(shù)月內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重癥狀，表現(xiàn)為肥厚性心肌病和重度全身性肌張力低下，病情進(jìn)展注射液獲批臨床，適應(yīng)癥為先天性凝血因子VIII缺乏液是一款用于血友病A的腺相關(guān)病毒（AAV）基因治療在研藥物。GS1191-0445注射液通過靜脈給藥將人凝血因子Ⅷ基因?qū)胙巡患者體內(nèi)，從而提高并長期維持患者體內(nèi)凝血因子水平，以期達(dá)到“一次給藥、長期有效”的對因治療及預(yù)防出血的效果。GS1191-0445注射液的初步臨床研究數(shù)據(jù)顯示了其在成年血友病A受試者中良好的安全性和有效GS1191-0445注射液是國內(nèi)首個開展血友病A臨床試驗的AAV基因治療藥物，從2021年該款藥物獲得美國FDA孤兒藥認(rèn)定（ODD）;目前該產(chǎn)品正處于臨床I期試驗階段。血友?。℉emophilia）是一種X染色體連HA是由F8基因突變導(dǎo)致遺傳性凝血因子Ⅷ缺乏所致。HB的發(fā)病人數(shù)約占全部血友病人的15%，由F9基因突變導(dǎo)致遺傳性凝血因子IX缺乏所致。血友病以自發(fā)性出血或者小創(chuàng)NFS-02獲美國FDA新藥臨床試驗許可，用于治療ND1突變引起的Leber遺傳性視神經(jīng)病變。NFS-02（rAAV2-ND1）是一種重組腺相關(guān)病毒血清型2載體（rAAV2）的新型眼內(nèi)注射基因治療產(chǎn)品，正在開發(fā)用于治療與ND1突變相關(guān)的Leber遺傳性視神經(jīng)病變。NFS-02作用機(jī)制為采用基因治療策略，以重組腺相關(guān)病毒作為載體，通過單次玻璃體內(nèi)注射，將正確的基因通過玻璃體腔注射遞送至患者受損的視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，修復(fù)線粒體生物呼吸鏈，使Leber遺傳性視神經(jīng)病變（LHON）是一種母系遺傳的線粒體疾病，多發(fā)于14-21歲的青年男性，患者表現(xiàn)為雙目視力受損至失明。據(jù)紐福斯生物新聞稿介紹，90%的LHON是由3基因其中ND4的G11778A突變最多，約占5080％。由于該突變使細(xì)胞線粒體生4、輝大基因HG004眼用注射液許可，并將在多國開展用于治療RPE65基因突變引起的相關(guān)性視網(wǎng)膜病變的國際多中心輝大基因HG004注射液是一種新型眼科基因治療藥物，旨在用于治療RPE65基因突變相關(guān)性視網(wǎng)膜病變，已獲得高質(zhì)量的臨床前數(shù)據(jù)來支持即將開展的國際多區(qū)域、多中心臨床試驗。HG004的起始有效劑量（約1/25的載體劑量）遠(yuǎn)低于已批準(zhǔn)的AAV2-hRPE65（LUXTURNA）基因治療產(chǎn)品，并且需要注入視網(wǎng)膜的體積更小，將大大減少AAV載體過250個。其中，RPE65基因突變可能會導(dǎo)致Leber先天性黑蒙(LCA)、嚴(yán)重的早發(fā)性兒童視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良(SECORD)、早發(fā)性嚴(yán)重視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良(EOSRD)或視網(wǎng)膜色素變性(RP)，即這些疾病都被認(rèn)為是RPE65基因突變相關(guān)視網(wǎng)膜病變，代表同一疾病體。RPE65基因突變相關(guān)視網(wǎng)膜病變通常發(fā)病于出生至5歲之間，主要臨床表征包括夜盲臨床試驗申請（IND）獲得中國國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心（CDE）許可，該產(chǎn)品適應(yīng)癥為新生血管性年齡相關(guān)性黃斑變性（nAMD）。FT-003注射液是一種新型重組腺相關(guān)病毒基因治療藥物。臨床前研究數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)T-003注射后可高效感染動物視網(wǎng)膜多層細(xì)胞，使其持續(xù)表達(dá)和分泌抗血管生成因子，降低血管視力嚴(yán)重減退甚至失明的不可逆轉(zhuǎn)的眼病，是全球第三大最常見的導(dǎo)致失明、全球第四大致視力障礙的病因。隨著中國人口老齡化趨勢日益突出，AMD的患病率也將逐年上升，也叫濕性年齡相關(guān)性黃斑變性，約占AMD患者的10%~20%。斑水腫。糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）是糖尿病患者（包括1型和2型）最常見的微血管并發(fā)癥之一，是25-74歲患者視力受損的首要原因。DME是糖尿病視網(wǎng)膜病變患者視力喪失的主要原因。20%的1型糖尿病、14%~25%的2型糖尿病患者會在10年內(nèi)發(fā)生DME。得中國國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心（CDE）臨床試驗批準(zhǔn)，適應(yīng)癥為血友病B（內(nèi)源性FIX活性≤2%）。這是方拓生物獲批臨床的第三款創(chuàng)新AAV基因治療產(chǎn)品。方拓生物研制的FT-004注射液是一種新型重組腺相關(guān)病毒載體基因治療藥物，適應(yīng)癥為血友病B(HemophiliaB，HB)。非臨床數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)T-004注射后可高效轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞，使其FT-002注射液獲得中國國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心（CDE）臨床試驗許可。FT-002注射液是中國XLRP治療領(lǐng)域首個獲得CDE臨床試驗許可及開展人體試驗的基因視網(wǎng)膜色素變性（XLRP）患者。AL-001眼用注射液是國內(nèi)獲批的首款通過脈絡(luò)膜上腔（SCS）注射給藥方式，來實現(xiàn)治療濕性年齡相關(guān)性黃斑變性（wAMD）的基因治療藥物。目前，濕性年齡相關(guān)黃斑病變已成為繼青光眼、白內(nèi)障之后全球第三大致盲因素，全球患病人數(shù)不斷攀升。安龍生物研制的AL-001眼用注射液，以AAV為載體，使得AL-001以視網(wǎng)膜為生物反應(yīng)器，持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)抗VEGF分子，在患者中最大限度地減少癥狀的發(fā)生，而脈絡(luò)膜上腔注射也能夠顯著降年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD）是老年人的主要致盲眼病，AMD分為干性和濕性（wAMD）兩種類型。其中，wAMD進(jìn)程較為迅速，是導(dǎo)致90%以上AMD患者視力損害的主要原因。目前wAMD臨床標(biāo)準(zhǔn)治療是每1個月或2個月進(jìn)行眼內(nèi)注射抗VEGF藥物，頻繁的眼內(nèi)注射會導(dǎo)致潛在的嚴(yán)重眼內(nèi)并發(fā)癥?；蛑委熥鳛橐环N創(chuàng)新性且具有前景的治療方法，有2023年3月9日，杭州嘉因生物EXG102-031眼用注射液IND申請6月1日，EXG102-031眼用注射液再獲中國國家藥品監(jiān)督管理局藥品評審中心（CDE）臨床試驗?zāi)驹S可，同意開展治療濕性年齡相關(guān)性黃斑變性（wAMD）的臨床試驗。EXG102-031眼內(nèi)注射是一種基于rAAV的基因療法，表達(dá)一種治療性融合蛋白，能夠結(jié)合/中和所有已知的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和血管生成素-2（ANG2）亞型，與現(xiàn)有的需要反復(fù)注射的抗體藥物不同，只需要一針注射，就可在體內(nèi)長期表達(dá)并有望有效治療視網(wǎng)膜中異常血管形成和血液滲漏。該藥物是目前首個針對所有已知VEGF和ANG2亞型的nAMD臨床階段的基因療法。EXG102-031的I期臨床試驗將評估EXG102-031在wAMD患者中的安全性和耐受性，同時至善唯新研制的ZS802是一種rAAV基因藥物，臨床適應(yīng)癥為A型血友病，屬于國家1類用至善唯新公司自主研發(fā)的全球最小的肝臟特異啟動子，很大程度解決了病毒載體包裝容量受限的難題，能夠顯著提高藥效。此外，ZS802還添加了至善唯新公司自主改造優(yōu)化的9、上海天澤云泰VGM-R02b2023年4月28日，上海天澤云泰公司申報的VGM-R02b臨床試驗申請（IND）獲CDE受理。7月13日，VGM-R02b獲得國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)同意開展治療戊二酸血癥I型的VGM-R02b是一種防止嬰幼兒及兒童期戊二酸血癥造成嚴(yán)重或危及生命的疾病進(jìn)展的潛在VGM-R02b是一種防止嬰幼兒及兒童期戊二酸血癥造成嚴(yán)重或危及生命的疾病進(jìn)展的潛在10、信念醫(yī)藥BBM-H803注射液限公司和上海勉亦生物科技有限公司申報的“BBM-H803注射液”臨床試驗申請（IND）獲CDE受理。7月25日，BBM-H803注射液的臨床試驗申請(IND)已獲國家藥品監(jiān)督管理局(NMPA)批準(zhǔn)。BBM-H803注射液是信念醫(yī)藥首款適用于治療血友病A的基因治療藥物，也是公司第二款獲得NMPA臨床試驗批準(zhǔn)的藥物，該款產(chǎn)品于2022年12月獲得美國食品藥品監(jiān)督管理Ⅷ,FⅧ)基因?qū)胙巡患者體內(nèi)，從而提高并長期維持患者體內(nèi)凝血因子水平，以11、諾潔貝生物NGGT001注射液NGGT001注射液是一款基于rAAV2的基因療法，通過表達(dá)密碼子優(yōu)化的人CYP4V2，用于治療結(jié)晶樣視網(wǎng)膜變性(BCD)。研究顯示，在BCD相關(guān)細(xì)胞模型中，由NGGT001介導(dǎo)的CYP4V2表達(dá)有效地挽救了由CYP4V2突變引起的表型缺陷，表現(xiàn)出恢復(fù)自噬流活性，減少脂質(zhì)積累和保持細(xì)胞活力，提供了通過CYP4V2基因增強(qiáng)恢復(fù)功能的治療理念。結(jié)晶樣視網(wǎng)膜變性（BCD）是一種相對罕見的視網(wǎng)膜變性，典型改變?yōu)辄S白色閃光結(jié)晶樣物質(zhì)沉積于視網(wǎng)膜，伴有視網(wǎng)膜色素上皮和脈絡(luò)膜萎縮，部分患者近角膜緣部角膜基質(zhì)淺臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性視力下降，或夜盲，或兩者兼有。雖然是一類危害嚴(yán)重的致盲性遺傳眼病，但目前針對BCD的基礎(chǔ)和臨床研究都較為匱乏，仍然缺乏十分有效的治療手段，而SKG0106眼內(nèi)注射溶液臨床試驗申請（IND）獲CDE受理。10月16日，SKG0106眼內(nèi)注射溶液臨床試驗申請（IND）獲國家藥監(jiān)局批準(zhǔn)。SKG0106眼內(nèi)注射溶液是一款在研的創(chuàng)新眼科基因治療藥物，由公司自主開發(fā)的新型腺相關(guān)病毒(AAV)衣殼和獨(dú)創(chuàng)的抗新生血管生長的轉(zhuǎn)基因組成，用于治療新生血管性年齡相關(guān)性黃斑變性(nAMD)，其作用機(jī)制是通過單次玻璃體腔注射將SKG0106遞送至眼內(nèi)，在轉(zhuǎn)導(dǎo)視網(wǎng)膜細(xì)胞后表達(dá)抗新生血管生長基因產(chǎn)物，從而抑制眼內(nèi)新生血管增生、阻斷血管滲漏和視網(wǎng)膜水腫，有效治療nAMD，實現(xiàn)長久獲益。公司擁有SKG0106眼內(nèi)注射溶液自主研發(fā)的AAV基因治療藥物SKG0201注射液的臨床試驗申請（IND獲國家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）批準(zhǔn)開展治療I型脊髓性肌萎縮癥(SMA)的I期臨床試驗。SKG0201注射液是一款用于單次靜脈注射給藥治療I型SMA的新一代SMN1基因替代治療藥物，創(chuàng)新設(shè)計的載體由獨(dú)特的中樞神經(jīng)（CNS）特異性啟動子調(diào)控、密碼子全面優(yōu)化的人源SMN1cDNA構(gòu)成，旨在實現(xiàn)更好的組織靶向性，使正常的SMN1基因?qū)塍w內(nèi)后在中樞神經(jīng)區(qū)域?qū)崿F(xiàn)最大治療效果、在低劑量下即可快速恢復(fù)正常的SMN蛋白在運(yùn)動神13、上海鼎新基因RRG001眼內(nèi)注射液RRG001眼內(nèi)注射液是鼎新基因首款適用于新生血管性年齡相關(guān)性黃斑病變（nAMD）的通過視網(wǎng)膜下腔給藥將血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）Fc融合蛋白基因?qū)雗AMD患者眼底，讓眼底細(xì)胞成為蛋白工廠，不斷表達(dá)患者需要的VEGF受體Fc融合蛋白，避免了傳統(tǒng)抗VEGF抗體藥物需要頻繁玻璃體注射給藥的弊端，以期達(dá)到“一次給藥、長期獲基因編輯技術(shù)，尤其是CRISPR-Cas9系統(tǒng)的出現(xiàn)，為我們提供了一種基因的方法。這種技術(shù)能夠精確地定位并修改DNA序列，從而有望根治許多由基因缺陷床試驗（IND）的有如下這些候選產(chǎn)品，簡介如下。注射液臨床試驗申請獲得國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心（CDE）默示許可。階段的體內(nèi)基因編輯治療候選藥物，也是全球首個CRISPR抗病毒基因編輯藥物。BD111已于2022年6月獲得了美國FDA孤兒藥資格批準(zhǔn)。BD111藥物的特點(diǎn)為：(1)VLP遞送單純皰疹病毒(HSV-1)是最常見的人類病毒之一。HSV-1是引起多種疾病的重要病原，比如口腔皰疹、生殖器皰疹、角膜炎和腦膜炎等，甚至帕金森等神經(jīng)系統(tǒng)疾病也被認(rèn)為與其有關(guān)。由于HSV-1潛伏感染的特點(diǎn)，通常這些疾病容易反復(fù)發(fā)作且無法根治。HSV-1感染角膜炎導(dǎo)致病毒性角膜炎，多次發(fā)作后角膜混濁逐漸加重，可導(dǎo)致角膜瘢痕形成、新生血管化、角膜穿孔等，是臨床上較為常見的致盲眼病之一。BD111利用本導(dǎo)基因原創(chuàng)性的新型基因治療載體——類病毒體VLP轉(zhuǎn)導(dǎo)CRISPR基因編輯工具直接靶向切割單純皰疹病毒的基因組，達(dá)到降低甚至清除HSV-1病毒基因組的目的，從而實現(xiàn)對皰疹病毒型角膜主研發(fā)的HGI-001注射液成功獲得中國國家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）的臨床試驗?zāi)驹SHGI-001注射液是基于編碼T87Qβ珠蛋白的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的自體造血干細(xì)胞療法，是通過提取患者自身的造血干細(xì)胞，體外利用慢病毒重新導(dǎo)入具有功能的β珠蛋白基因，幫助該產(chǎn)品技術(shù)原理與藍(lán)鳥生物的相同，生產(chǎn)流程相近，不過在制備工藝上進(jìn)行了優(yōu)化。在），基因治療讓我們能夠治療“無法治愈”的疾病，也為其他疾病帶來新的治療思路。目前基因治療的主要應(yīng)用場景是治療罕見病，隨著AAV遞送系統(tǒng)不斷成熟，基因治療“一次給藥”的特性對病人吸引力越來越大，越來越多的在研管線將應(yīng)用基因編輯領(lǐng)域飛速發(fā)展，特別是2023.12.08，美國FDA批準(zhǔn)了兩項里程碑式治療方法，盡管充滿希望，但對這些治療的安全性和成本效益仍存在擔(dān)憂。雖然大部分基因療法在臨床上展現(xiàn)出了較好的耐受性，但是仍有部分產(chǎn)品在臨床上出現(xiàn)了例，導(dǎo)致研究暫停和被調(diào)查，安全仍是基因治療需要注意的首要風(fēng)險。此外，目前超70%基因遞送藥物均采用腺相關(guān)病毒（AAV）載體遞送，由于AAV基因組不會整合進(jìn)基因組，因此AAV遞送的基因有可能會隨著細(xì)胞的分裂、死亡或者其他原因不斷被稀釋從而導(dǎo)致療目前大多數(shù)基因療法都利用病毒載體進(jìn)行基因遞送，病毒載體可能造成外源基因隨機(jī)整合并破壞基因組，還有潛在致癌或引起細(xì)胞不受控增殖的風(fēng)險。此外，病毒載體還可能引起斯坦利?科恩（StanleyCohen）試圖通過注射含有精氨酸酶的乳頭瘤病毒來治療一對姐妹隨后科學(xué)家們試圖通過引入正?；蚪M替換突療法的早期階段，一直沒有出現(xiàn)將外源基因傳遞給人類細(xì)胞的有效工具。直到20世紀(jì)80年代末，病毒載體興起。相應(yīng)的公共監(jiān)管體制也在那時候建立起來，并在90年代起正式1990年，美國FDA正式批準(zhǔn)了第一個基因療法臨床試驗，美國國立衛(wèi)生研究院進(jìn)行了世經(jīng)過基因療法技術(shù)導(dǎo)入正常的腺苷脫氨酶基因，患兒的免疫能力得以提高，獲得了明顯的治療效果。這項臨床試驗的成功成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)發(fā)展最重要的篇章。此后，世界各國都陷癥的基因療法臨床試驗后，體內(nèi)產(chǎn)生了嚴(yán)重的免疫反應(yīng)，并于4天后去世。這名18歲少年成為了首名死于基因療法臨床試驗的患者?；虔煼ㄒ虼嗽馐苤貏?chuàng)，人們對基因療法隨后的2002年底到2003年，法國巴黎Necker兒童醫(yī)院報道重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合征（SCID-X1）接受基因療法的患者中，有2例出現(xiàn)了類白血病樣癥狀。這次又一次引發(fā)了公眾對基因療法安全性危機(jī)的大討論。從此，人們對基因療法的期望跌到了低谷，基因療腺相關(guān)病毒（AAV）作為新的基因遞送載體，安全隱患和免疫原性已大大降低，幾乎沒有毒性和致病性，在NIH的相關(guān)評級中也是處于最安全等級，這也是為何AAV會成為當(dāng)下基因治療領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的病毒載體。但是在過去幾年中，與AAV療法安全性相關(guān)的比如，諾華已上市的AAV基因療法Zolgensma，在2022年8月被報出兩名患有脊髓性肌治療X連鎖肌小管性肌病的一款A(yù)AV候選藥物AT132曾先后在四名兒童患者中出現(xiàn)了肝毒性問題，并引起了嚴(yán)重的并發(fā)癥。另外，在一項使用AAV8遞送凝血因子FVIII基因治療A型血友病的動物實驗中，10年隨訪結(jié)果發(fā)現(xiàn)5只接受治療的模型犬發(fā)生了AAV整合，且融合后的細(xì)胞出現(xiàn)增殖現(xiàn)象，預(yù)示著致癌的可能。從過往出現(xiàn)的各種不良事件中，人們逐漸總結(jié)出規(guī)律：AAV療法的安全性問題在表面上與劑量相關(guān)，而劑量背后隱藏的本質(zhì)是AAV的免疫原性與組織靶向性。未來仍需進(jìn)一步消除載體毒性和免疫原性，提高基因除了物理屏障外，rAAV還會遇到免疫系統(tǒng)建立的許多生物屏障，包括預(yù)先存在的免疫、a）預(yù)先存在的AAV特異性抗體可以與rAAV相互作用并阻斷其靶細(xì)胞進(jìn)入。細(xì)菌來源的肽內(nèi)切酶IdeS及其同源物能將完整的抗體切割成Fab和Fc片段，或者衣殼可以被EV修b）給予高劑量的rAAV時觀察到補(bǔ)體激活。粘附在細(xì)胞表面的rAAV通過與補(bǔ)體C1qs結(jié)合來激活經(jīng)典途徑，補(bǔ)體C1qs切割C4和C2形成C3轉(zhuǎn)化酶C4b2b，然后C3被切割并形成C5轉(zhuǎn)化酶，該轉(zhuǎn)化酶將C5裂解成C5b，C5b與C6-9結(jié)合形成直接導(dǎo)致細(xì)胞裂解的膜攻擊復(fù)合物（MAC），導(dǎo)致肝臟或腎臟損傷。環(huán)肽APL-9（C1抑制劑，C1inh），依庫珠單抗（C1、C3和C5抑制劑可抑制補(bǔ)體激活級聯(lián)反應(yīng)。c）已被證明與rAAV相互作用的先天受體，包括病毒衣殼激活的TLR2、未甲基化CpG激活的TLR9和傳導(dǎo)dsRNA的RIG-I/MDA5，已被證明可以促進(jìn)炎癥。許多通路成分可以被d）適應(yīng)性免疫是指抗原特異性B細(xì)胞和T細(xì)胞反應(yīng)。B細(xì)胞可以產(chǎn)生靶向rAAV衣殼的抗體，從而消除重新給藥的可能性。細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞可以識別來自轉(zhuǎn)基因和rAAV衣殼的轉(zhuǎn)基因的miRNA結(jié)合位點(diǎn)可以與細(xì)胞miRNA相互作用，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄降解。在抗原呈遞細(xì)胞中，這種設(shè)計可能會阻止轉(zhuǎn)基因衍生肽呈遞給T細(xì)胞。此外，抗CD20抗體利妥昔和mTOR抑制劑雷帕霉素可用于減少適應(yīng)性反應(yīng)。隨著對AAV療法安全性問題的重視，越來越多的改進(jìn)策略也被開發(fā)出來。這些策略主要2020年，UniQure的血友病AAV基因療法被然而經(jīng)過調(diào)查后，發(fā)現(xiàn)這位患者原本就患有慢性乙型和丙型肝炎，本就是肝細(xì)胞癌的高發(fā)對象，因而鑒定腫瘤的發(fā)生與AAV治療無關(guān)。這一事件也提醒了臨床試驗的開展人員，在給藥前務(wù)必對患者的身體健康狀況進(jìn)行更加細(xì)致的評估與分類，并且根據(jù)患者的具體情目前，AAV治療引發(fā)的不良事件主要有肝毒性、血栓性微血管?。═MA）、背根神經(jīng)節(jié)在給藥劑量的設(shè)定上，是否除了患者的體重外，還應(yīng)考慮其他因素，比如年齡、疾病的嚴(yán)重程度，或者設(shè)定一個總載體數(shù)量的上限？由于AAV載體天然對肝臟有著較高的親和力，在目前開展的臨床試驗中，除眼科和CNS這類局部給藥的疾病類型外，基本都會提前檢測受試者體內(nèi)的AAV抗體水平，并對受試者進(jìn)行入組篩選，或者使用合適的免疫抑制劑。但是目前采用的預(yù)先抗體檢測方式和標(biāo)準(zhǔn)并無統(tǒng)一。FDA曾在2020年發(fā)布了一項針對罕見病基因治療的行業(yè)通用指南，在指南中FDA鼓勵臨床試驗的申報者開發(fā)必要的伴隨診斷方法，并將其與AAV基因療法一并進(jìn)行BLA申請。AAV的衣殼蛋白以二十面體的構(gòu)型聚集在一起并且形成刺狀突起，介導(dǎo)與目標(biāo)細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的相互作用，這也就使得不同衣殼蛋白的AAV載體具有不同的組織靶向性，同時也具備不同的免疫原性。在過去，人們往往通過局部定點(diǎn)注射的方式進(jìn)行非肝靶向的組織給藥，以實現(xiàn)AAV在特定區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)散，比如腦立體定位注射、肌肉定點(diǎn)注射、心肌原位注射等。但若要進(jìn)一步實現(xiàn)AAV感染特定組織細(xì)胞，則需要具有組織特異性的血清▲常見AAV血清型與組織親和性近一兩年來，其實各大制藥巨頭都紛紛開啟了對新一代AAV衣殼的爭奪戰(zhàn)，通過對AAV衣殼的合理設(shè)計與工程化改造，或是定向進(jìn)化，或是尋找新型的野生型AAV，以獲得組織靶向更強(qiáng)、轉(zhuǎn)染效率更高、免疫原性更低的新型AAV載體。更特異的組織靶向性不僅可以擴(kuò)大AAV療法的適應(yīng)癥范圍，也可以有效降低對肝臟的毒性；更高的轉(zhuǎn)染效率則支目的基因在體內(nèi)的表達(dá)依托于重組在AAV基因組上的基因表達(dá)盒，包括啟動子、目的基因與轉(zhuǎn)錄終止信號，這些成分的不同設(shè)計將直接影響目的蛋白翻譯的效率、持久性與組織根據(jù)啟動子的表達(dá)特征，啟動子一般可以分為組成型、誘導(dǎo)型和組織特異型三類。其中組成型啟動子在不同組織中的表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異，可連續(xù)不斷地啟動基因表達(dá)，例如巨細(xì)胞病毒（CMV）啟動子；誘導(dǎo)型啟動子則可以在某些特定的物理或化學(xué)信號刺激下，大幅提高基因的轉(zhuǎn)錄水平，如四環(huán)素啟動子TRE；組織特異型啟動子則只在特定的組織器因此，除了開發(fā)新的AAV血清型外，還可以通過選擇合適的啟動子來實現(xiàn)目標(biāo)基因在特定組織細(xì)胞中的表達(dá)，或者避免在非靶標(biāo)組織中表達(dá)，以提高AAV療法的安全性，這在靜脈給藥的AAV療法中顯得尤為重要。例如國內(nèi)企業(yè)至善唯新，在其治療血友病A的AAV候選療法ZS802中，就使用了其自研的全球最小的肝臟特異性啟動子；惟佑基因也建立了一個“安全開關(guān)”的AAV基因治療平臺，可嚴(yán)格控制基因治療高劑量表達(dá)導(dǎo)致的不良反應(yīng)，并可及時關(guān)閉目標(biāo)基因的不良表之處便是利用專有的數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)平臺PromPT?,驅(qū)動啟動子設(shè)計，生產(chǎn)突破性的另外，啟動子上的GC含量、剪接位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止信號、核酸二級結(jié)構(gòu)等，也會影響目的基因的表達(dá)，而表達(dá)效率的高低關(guān)系著載體劑量的使用，更高效的表達(dá)效率意味著僅需要除優(yōu)化啟動子外，直接修改目的基因也可能產(chǎn)生更好的療效。例如去年上友病B的AAV基因療法，來自UniQure/CLS的Hemgenix，則使用了凝血因子IX的變體——者中的療效提升了5-10倍。同時該療法采用了肝臟特異的啟動子，在治療效果與安全性AAV的體內(nèi)給藥（注射）方式分為局部給藥和系統(tǒng)性給藥，一般根據(jù)疾病部位與性質(zhì)選擇合適的給藥方式。比如對于眼科疾病，采用的局部給藥方式有玻璃體腔內(nèi)注射、視網(wǎng)膜下注射；對于肌肉系統(tǒng)疾病，則一般采用肌肉注射，包括心?。粚τ谏窠?jīng)系統(tǒng)疾局部給藥可以有效地使載體在靶組織富集，避免廣泛的生物分布，從而最大限度地減少毒性，但同時對滴度的要求會更高。為了提高給藥效率，同時也減少對患者的傷害，一些新比如在靶向CNS的療法中，有研究人員使用計算機(jī)模型來了解患者個體的腦脊椎流動動置OrbitSDS，可無需切除玻璃體或進(jìn)行視網(wǎng)膜切開術(shù)；圣路易斯華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究團(tuán)隊開發(fā)了一種使用超聲介導(dǎo)的鼻內(nèi)給藥方式（FUSIN以將AAV高效遞送至大腦中。AAV載體的生產(chǎn)過程較為復(fù)雜，可采用的制備方式也有多種，目前對于AAV的生產(chǎn)工藝并無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。但無論采取哪種生產(chǎn)體系，對于終產(chǎn)品的純度與雜質(zhì)檢測，監(jiān)管機(jī)構(gòu)均有▲AAV生產(chǎn)過程涉及的主要雜質(zhì)這些雜質(zhì)在安全性方面或可能引發(fā)致癌風(fēng)險，如宿主細(xì)胞DNA殘留、錯誤包裝的病毒顆粒等；或引起更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，如宿主細(xì)胞蛋白殘留、空衣殼、病毒顆粒聚集體等，因此優(yōu)化上下游生產(chǎn)工藝，以獲得滴度與純度更高的AAV載體終產(chǎn)品，對于AAV療法的安在過去數(shù)年AAV療法的高速發(fā)展推動下，相關(guān)的生產(chǎn)工藝已經(jīng)有了大幅提升。比如在純化過程中用到的親和層析，從早期的肝素發(fā)展到AVBSepharose（AVB瓊脂糖凝膠），現(xiàn)率不斷提高，也讓一些新型的AAV血清型有了更好的選擇。值得一提的是，即便材料與技術(shù)在不斷進(jìn)步，但是依然沒有某一標(biāo)準(zhǔn)的方法流程能夠適用于所有AAV療法，因為血清型、目的基因的不同都會影響載體顆粒等電點(diǎn)，另外上游細(xì)胞系的選擇與原料等因素也會產(chǎn)生不同的下游工藝需求。正是這種復(fù)雜性，使得AAV療法這一領(lǐng)域中的藥物研發(fā)企業(yè)與CDMO服務(wù)商之間形成了緊密合作，雙方共同推動AAV現(xiàn)有基因治療載體的核心話題是基因到達(dá)靶細(xì)胞的效率，理想狀態(tài)下只要能把基因指定的細(xì)胞上，許多疾病基本可以治療，但實現(xiàn)起來有諸多困難。比如，肝臟疾病只有理想的基因治療載體特性：1）具有靶向特異性，能靶向特定的器官、組織、細(xì)胞，且可具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，能感染分裂和非分裂的細(xì)胞；4）缺乏自動復(fù)制載體自身的能力，具有較低的免疫原性的或致病性，不會引起炎癥；5）高度穩(wěn)定、易制備、可濃縮和純化，具AAV療法的器官靶向性主要來源于兩點(diǎn)，衣殼的改造和啟動子的改造。通過定向進(jìn)化和AI設(shè)計，可以將不同血清型的AAV重新組合以增強(qiáng)器官選擇性。組織特異性啟動子和合成啟動子的使用也可以進(jìn)一步提升組織選擇性。AAV的直徑在25nm左右，攜帶的基因組也很小，在5kb左右。所以用AAV載體攜帶大型基因，如Dystrophin基因治療DMD疾病時，CRISPR技術(shù)在治療遺傳性疾病領(lǐng)域顯示出巨大的潛力，此外，這項技術(shù)還能通過靶向與疾病進(jìn)展相關(guān)的特定基因，用于開發(fā)治療慢性病等其他疾病的新療法。然而，基因編輯技術(shù)的應(yīng)用也伴隨著安全隱患。一個主要的擔(dān)憂是脫靶效應(yīng)的風(fēng)險，這可能導(dǎo)致意外突變或其他有害后果。當(dāng)CRISPR-Cas9系統(tǒng)在DNA的非預(yù)期位置進(jìn)行切割時，可能產(chǎn)生無法預(yù)另一個值得關(guān)注的問題是，基因編輯后的細(xì)胞重新注入人體時可能引發(fā)免疫反應(yīng)或其他不良反應(yīng)，尤其是像Casgevy這樣的體外CRISPR療法。使用CRISPR-Cas9進(jìn)行基因編輯的潛在風(fēng)險還包括細(xì)胞毒性和基因組不穩(wěn)定性，在實際臨床應(yīng)用中需要對其進(jìn)行詳細(xì)評估和CRISPR技術(shù)還可能通過逆轉(zhuǎn)錄造成DNA的大范圍重排，理論上可能引發(fā)腫瘤。盡管這種情況較為罕見，但鑒于CRISPR技術(shù)通過編輯數(shù)百萬個細(xì)胞來進(jìn)行某些治療，這意味著此外，基于CRISPR技術(shù)的療法治愈程度和可能產(chǎn)生的長期影響仍需進(jìn)一步研究。雖然有相當(dāng)一部分人將其視為潛在的治愈方法，但需要長期數(shù)據(jù)來支持這一觀點(diǎn)—