食品生物技術期末重點

食品生物技術

生物產(chǎn)業(yè)：將最新的科學技術應用于生物體及其部分，為改變生物及非生物體而

創(chuàng)造出新技術、新產(chǎn)品和新的服務領域而形成的生產(chǎn)經(jīng)營活動，亦稱生物技術產(chǎn)

業(yè)。

第一章緒論

第一節(jié)生物技術的概況

1.生物技術：又稱生物工程，指人們以現(xiàn)代生命科學為基礎結(jié)合其他基礎學科的

科學原理，采用先進的工程技術手段，按照預先的設計，改造生物體或加工生物

原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達到某種目的。

2..生物技術的種類：基因工程、細胞工程、酶工程、發(fā)酵工程和蛋白質(zhì)工程（基

因工程是維系現(xiàn)代生物技術各個研究領域的橋梁和樞紐）

3.生物技術的形成與發(fā)展：

傳統(tǒng)生物技術：微生物發(fā)酵現(xiàn)代生物技術：基因工程為首要標記

4.生物技術的應用與展望

應用：農(nóng)業(yè)領域、醫(yī)藥領域、能源、環(huán)保、食品

展望：（1）基因操作技術日新月異，不斷完善（2）生物治療突飛猛進（3）轉(zhuǎn)

基因植物和動物有重大突破（4）人體基因組圖譜（5）基因治療出乎意料的取

得重大進展。

第二節(jié)食品生物技術的概況

1.食品生物技術（FoodBiotechnology）通過生物技術手段，用生物程序，生產(chǎn)

細胞或其代謝物質(zhì)來制造食品，改進傳統(tǒng)生產(chǎn)過程，以提高人類生活質(zhì)量的科學

技術。

2.食品生物技術的應用

（1）利用基因工程、細胞工程技術對食品資源的改造與改良

（2）利用發(fā)酵工程、酶工程技術將農(nóng)副原材料加工成商品

（3）利用生物技術進行產(chǎn)品的二次開發(fā)，形成新的產(chǎn)品

（4）利用酶工藝、發(fā)酵技術、生物反應器等對傳統(tǒng)食品加工工藝進行改造，降

低能耗，提高產(chǎn)率，改善食品品質(zhì)

3.我國食品工業(yè)領域中食品生物技術應用現(xiàn)狀

（1）對食品資源的改造（重組DNA技術和采用細胞生物學方法，建立細胞融

合技術和動植物細胞大量控制性培養(yǎng)技術，按照預定的設計改造遺傳物質(zhì)和進行

細胞培養(yǎng)）

（2）對食品加工過程和食品品質(zhì)的改良

（3）在食品處理及分析過程中的應用

（4）利用生物技術獲得功能性保健食品素材

（5）利用生物技術開發(fā)新食品材料

（6）在農(nóng)副產(chǎn)品深加工和綜合利用的應用

4.存在的主要問題

（1）安全性問題

（2）生物技術水平不高，應用范圍較窄

（3）新技術、新產(chǎn)品的科研開發(fā)力量不足

5.食品生物技術的發(fā)展前景

（1）大力開發(fā)食品添加劑新品種

（2）發(fā)展微生物的保健食品

（3）螺旋藻食品

（4）開發(fā)某些蟲類高蛋白食品

第二章基因工程與食品產(chǎn)業(yè)

第一節(jié)基因工程的分子生物學基礎

1.遺傳信息傳遞的方向一中心法則

2.DNA的復制：對遺傳物質(zhì)的關鍵性要求是它必須能夠準確地復制。

DNA復制特點：

（1）自在復制：DNA復制從特定的位點開始，這個特定位點就稱做復制起始點

（2）半保留復制：雙鏈DNA分子在復制過程中，DNA的兩條鏈各自作為新鏈

合成時的模板

（3）DNA復制具有高度的忠實性：與DNA聚合酶所具有的自我校正功能密不

可分

3.DNA聚合酶：以脫氧核甘三磷酸（dNTP）作為底物催化合成DNA的一類酶。

4.DNA的轉(zhuǎn)錄和加工

轉(zhuǎn)錄是以DNA為模板進行RNA合成的過程，是基因表達的第一步，最終導致

變編碼蛋白的合成

&.RNA合成的基本特點：

（1）RNA聚合酶是RNA合成的關鍵酶

（2）RNA合成是以ATP、GTP、CTP、UTP四種核糖核昔酸為底物

（3）RNA轉(zhuǎn)錄是以一條DNA為模板，按照堿基互補的原則（A=U,G=C）進行轉(zhuǎn)

錄。

（4）RNA的合成過程包括：1）RNA聚合酶結(jié)合于DNA分子上的特定位點2）

使DNA雙鏈解旋，起始RNA合成3）RNA鏈的延伸4）RNA合成的終止和釋

放

&.RNA的轉(zhuǎn)錄包括三個階段：轉(zhuǎn)錄開始、轉(zhuǎn)錄的延伸、轉(zhuǎn)錄的終止

這里主要講原核生物中RNA轉(zhuǎn)錄的起始過程。主要步驟為：封閉二元復合體的

形成一開放二元復合體的形成一三元復合體的形成一RNA合成起始

&.RNA轉(zhuǎn)錄后加工［一個典型的初級RNA轉(zhuǎn)錄：5'端含有帽子，3'端有Poly（A）］

mRNA5'加帽的功能：（1）保護mRNA5'端不被降解（2）提高翻譯效率（3）

作為進出細胞核的識別標記（4）提高mRNA的剪切效率

Poly（A）的功能：（1）協(xié)助成熟的mRNA從細胞核向細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運（2）提高

mRNA在細胞質(zhì)中的穩(wěn)定性（3）作為特糖體的識別信號，使mRNA得以有

效翻譯?，F(xiàn)在認為Poly（A）對基因的表達調(diào)控有重要作用

5.逆轉(zhuǎn)錄和逆轉(zhuǎn)錄酶

逆轉(zhuǎn)錄是對于轉(zhuǎn)錄而言的，即以RNA為模板在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成DNA的

過程。

逆轉(zhuǎn)錄酶是一種特殊的DNA聚合酶，可以以RNA或DNA為模板。

6.翻譯一蛋白質(zhì)的生物合成

翻譯：將以核甘酸形式編碼在mRNA中的信息轉(zhuǎn)變成多肽鏈中特定的氨基酸順

序。

&.UAA、UAG、UGA不為氨基酸編碼

&.遺傳密碼的特性：（1）遺傳密碼的通用性（2）遺傳密碼的簡并性（一個氨基

酸有一個以上的密碼子為其編碼）（3）遺傳密碼使用的偏倚性（4）密碼子的

不重疊性和閱讀方向（5）應注意到在酵母、無脊椎動物、脊椎動物的線粒體

中的遺傳密碼同遺傳密碼表相比出現(xiàn)一些偏離。

7.基因表達的調(diào)控：（1）轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控（2）轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，也就是初級轉(zhuǎn)

錄物的剪接或加工（3）RNA轉(zhuǎn)運調(diào)控，即在細胞核中加工好的mRNA的細

胞質(zhì)轉(zhuǎn)運的調(diào)控（4）翻譯水平上的調(diào)控

（5）mRNA降解的調(diào)控（6）翻譯后的加工，即蛋白質(zhì)活性控制

第二節(jié)基因工程概述

1.定義

&.基因：也稱遺傳因子，指攜帶有遺傳信息的DNA序列，其產(chǎn)物為各種RNA

或蛋白質(zhì)，是控制性狀的基本遺傳單位（現(xiàn)代遺傳學認為，基因是DNA分子上

具有遺傳效應的特定的核甘酸序列的總稱，是具有遺傳效應的DNA分子片段。

&-基因工程：將一種供體生物體的目的基因與適宜的載體在體外進行拼接重組，

然后轉(zhuǎn)入另一種受體生物體內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達出新的基因

產(chǎn)物或產(chǎn)生新的遺傳性狀的DNA體外操作程序。

&.基因工程又稱為遺傳工程、重組DNA技術、分子克隆、基因克隆

&.基因工程實施要有四個必要條件：工具酶、供體基因、載體、受體細胞

2.基因工程的誕生和發(fā)展

&.基因工程誕生的理論基礎

理論上的三大發(fā)現(xiàn)；（1）證實了DNA是遺傳物質(zhì)（2）提示了DNA分子的雙

螺旋結(jié)構模型和半保留復制（3）遺傳密碼的破譯和遺傳信息傳遞方式的確定

技術上的三大發(fā)明：（1）限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)與DNA的切割

（2）DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)與DNA片段的連接（3）基因工程載體的研究與應用

&-基因工程的的發(fā)展：（1）基因工程的艱難階段（2）逐漸成熟

（3）迅速發(fā)展

3.基因工程研究的內(nèi)容

&.研究的內(nèi)容：（1）基礎研究（2）基因工程克隆載體的研究

（3）基因工程受體系統(tǒng)的研究（4）目的基因研究（5）生物基因組學研究（6）

基因工程應用研究

&基因工程的基本流程：（1）目的基因的分離、獲取與制備（2）基因育載體連

接構建成為重組載體分子（3）重組DNA分子導入到受體細胞（4）外源目的基

因陽性克隆的鑒定和篩選（5）外源目的基因的表達

4.基因工程的意義：（1）大規(guī)模生產(chǎn)生物大分子（2）設計構建新物種（3）搜

尋、分離、鑒定生物體尤其是人體內(nèi)的遺傳信息資源

第三節(jié)基因工程的工具酶與載體

1.基因工程的工具酶分類（按用途分三類）：限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、修飾

酶。

&.限制性核酸內(nèi)切酶：能夠識別雙鏈DNA分子中特異的序列并在識別序列內(nèi)部

或兩側(cè)特異切割雙鏈DNA分子的核酸內(nèi)切酶。

一在細菌中發(fā)現(xiàn)，主要從原核生物中分離純化出來

—限制性核酸內(nèi)切酶的類型：（1）1型：由三個基因構成，限制酶需要ATP、Mg2+、

SAM（5-腺苜甲硫氨酸）（2）II型：限制與修飾基因產(chǎn)物，獨立起作用（3）

III型：修飾酶與工具酶相同，限制酶是獨立存在

—在以上三種酶中，只有11型限制核酸酶具有相當高的核甘酸識別特異性，被

廣.泛應用。

—H型限制性內(nèi)切酶的基本特性：（1）每一種酶都有各自特異的識別序列，通常

識別序列為4、5或6個堿基對（2）限制性核酸內(nèi)切酶識別序列具有180°旋轉(zhuǎn)

對稱的回文結(jié)構（3）限制性核酸內(nèi)切酶都在識別序列內(nèi)部或兩側(cè)特異位點切割。

—雙鏈DNA被酶切后可出現(xiàn)三種形式的末端：（1）5'突出末端

（2）3'突出末端（3）平末端【其中1、2為粘性末端】

&.DNA連接酶：將兩段乃至數(shù)段DNA片段拼接起來的酶

—基因工程中最常用的DNA連接酶為T4DNA連接酶和大腸桿菌連接酶

—腌：（1）連接帶匹配黏末端的DNA分子（2）使平端的雙鏈DNA分子互

相連接或合成的寡核甘酸接頭相連接。

（4）-DNA連接酶的連接方式（不同末端連接策略）：相同粘性末端的連接，

平頭末端的的連接分為：（1）單酶切產(chǎn)生的相同粘性末端【最常見】（2）雙酶

切產(chǎn)生的粘性末端（3）雙酶切產(chǎn)生的不同酶酶切載體（4）雙酶切產(chǎn)生的3'

突出末端（5）雙酶切產(chǎn)生的5'突出末端和3'突出末端。

&.DNA聚合酶：能在引物和模板的存在下，把脫氧核糖核甘酸連續(xù)的加到雙鏈

DNA分子引物鏈的3'—0H末端，催化核甘酸的聚合作用，合成方向?qū)诒?/p>

合成鏈而言是從5'到3'端，并且合成的產(chǎn)物與模板互補。

-目前常用的DNA聚合酶是：大腸桿菌DNA聚合酶I、大腸桿菌DNA聚合酶

I大片段、T4噬菌體DNA聚合酶、T7噬菌體DNA聚合酶、耐高溫DNA聚合

酶等。

2.基因工程載體：基因工程中攜帶外源基因進入受體細胞的運載工具，本質(zhì)是

DNAo

一載體的構建和選擇是基因工程的重要環(huán)節(jié)之一。

一作為載體的必備條件：（1）能在宿主細胞內(nèi)進行獨立和穩(wěn)定的自我復制（2）

具有合適的限制性核酸內(nèi)切酶位點（3）具有合適的選擇標記基因

—基因工程載體分類：（1）來源與性質(zhì)：質(zhì)粒載體、噬菌體載體、粘性載體、噬

菌粒載體、病毒載體、人工染色體（2）功能與用途：克隆載體、表達載體、測

序載體、轉(zhuǎn)化載體、穿梭載體和多功能載體

（3）受體細胞不同：原核生物載體、真核生物載體、大腸桿菌載體、酵母載體、

植物基因工程載體、動物基因工程載體

&.質(zhì)粒載體：以細菌質(zhì)粒的各種元件為基礎組建而成的基因工程載體

一質(zhì)粒：染色體外能自我復制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子

一天然質(zhì)粒：沒有經(jīng)過以基因克隆為目標的體外修飾改造的質(zhì)粒

—質(zhì)粒的生物學特：（1）獨立于細菌染色體外的雙鏈環(huán)狀DNA分子（2）質(zhì)

粒的復制和拷貝數(shù)：嚴緊型和松弛型（3）質(zhì)粒的不親和性：兩種不同質(zhì)粒不能

在同一宿主細胞中穩(wěn)定共存（4）質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性：質(zhì)粒從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個

細胞的特性。

—理想質(zhì)粒載體的必備條件：（1）具有較小的分子質(zhì)量和較高的拷貝數(shù)（2）具

有若干限制性核酸內(nèi)切酶的單一酶切位點（3）具有兩種以上的選擇標記基因

（4）具有復制起始點

&.常用的質(zhì)粒載體的類型：

（1）PBR322質(zhì)粒：1）最早應用于基因工程的載體之一2）4.36kb的環(huán)狀雙

鏈DNA,其堿基序列已經(jīng)全部清楚3）把PBR322用限制性內(nèi)切酶切去某片段，

換上合用的表達組件，就可以構建成工作所需的新載體4）許多實用的質(zhì)粒載體

都是在PBR322的基礎上改建而成。

（2）PBR322的優(yōu)點：1）具有較小的分子量2）具有兩種選擇標記

3）具有相當高的拷貝數(shù)

（2）PUC質(zhì)粒系列

—優(yōu)點：1）具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)2）重組子檢測更方便3）具有

多克隆位點MCS［人工合成的多個單一酶切位點構成］

（3）人噬菌體載體

一人噬菌體載體的生活周期：裂解周期［溶菌性周期］、溶原性周期、構建人噬菌

體的基本過程。

一構建人噬菌體的基本過程：1）除去多余的限制性核酸內(nèi)切酶識別位點2）切

除掉入DNA的非必需區(qū)3）引入適當?shù)倪x擇標記

（4）粘性載體：又稱柯斯質(zhì)粒載體

一粘性載體的基本特點：1）具有人噬菌體的體外包裝，高效感染等特性2）具

有質(zhì)粒載體的易于克隆操作，選擇及高拷貝等特性3）具有高容量的克隆能力

第四節(jié)目的基因的獲取

一對已知序列的獲取：化學合成法、從基因文庫中釣取目的基因、應用mRNA逆

轉(zhuǎn)錄合成cDNA、PCR擴增法等。

一對未知序列基因的分離：染色體步移法、雜交捕捉和釋放法、mRNA的差異顯

示分析法

L化學合成法

—適用范圍：1）已知目的基因核甘酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列

2）分子量較小目的基因的制備

2.從基因文庫中釣取目的基因

一基因文庫：又稱DNA文庫，指在細菌中增值來自某一生物染色體DNA或cDNA

片段克隆的集合體。

-cDNA文庫：某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA片段

分別與克隆載體重組，貯存在一種受體菌克隆子群體之中，這樣的群體稱之為

cDNA文庫。

一基因文庫構建的基本步驟：1）細胞染色體大分子DNA的提取和大片段DNA的

制備2）載體DNA的制備3）載體與外源大片段DNA的連接4）體外包裝及基因

組DNA文庫的擴增5）重組DNA的篩選和鑒定

一cDNA文庫構建的基本步驟：1）mRNA的提取和分離2）第一鏈cDNA合成3）

第二鏈cDNA合成（自身引導法、引導合成法、置換合成法）4）雙鏈cDNA克隆

進質(zhì)粒或噬菌體載體并導入宿主細胞中繁殖

一適用范圍：1）根據(jù)目的基因已知核甘酸序列進行篩選分離2）根據(jù)目的基因

異性表達進行分離

3.PCR法獲取與擴增目的基因

—已知目的基因的序列組成；知道目的基因的部分DNA序列；知道其同源基因的

序列。

4.利用限制性內(nèi)切酶法直接分離目的基因

一用限制性內(nèi)切酶把基因組DNA切成不同大小的片段

第五節(jié)DNA體外重組與基因轉(zhuǎn)移

1.重組DNA分子的構建

—重組DNA：將目的基因（外源DNA分子）用DNA連接酶在體外連接到適當?shù)妮d

體上，即DNA分子的體外重組，這種新組合的DNA稱為重組DNA。

一載體DNA與外源基因片段的連接：1）粘性末端DNA分子間的連接：同一限制

性內(nèi)切酶切割位點連接；不同限制性內(nèi)切酶切割位點連接

2）平頭末端DNA分子間的連接：同聚物加尾連接；人工接頭（連接子）連接。

2.基因轉(zhuǎn)移（重組DNA分子導入受體細胞）

—受體細胞：也稱為宿主細胞或寄主細胞等，從實驗技術上講是能攝取外源DNA

并使其穩(wěn)定維持的細胞；從實驗目的上講是有應用價值和理論研究價值的細胞。

—基因工程中常用的受體細胞類型：原核生物細胞和真核生物細胞（真菌細胞、

植物細胞、動物細胞）

一作為基因工程的受體細胞必須具備以下特征：1）便于重組DNA分子的導入和

篩選克隆子2）重組DNA分子在受體細胞內(nèi)能穩(wěn)定維持3）適于外源基因的高效

表達4）遺傳性穩(wěn)定5）易于擴大培養(yǎng)或發(fā)酵生長6）安全性

一原核生物細胞優(yōu)點：1）大部分原核生物細胞沒有堅硬的細胞壁2）沒有核膜

3）基因組小，遺傳背景簡單，不含線粒體和葉綠體基因組4）多數(shù)為單細胞生

物

一至今被用作受體細胞內(nèi)的原核生物有大腸桿菌、枯草桿菌、藍細菌等。

真菌受體細胞：

酵母菌細胞：單細胞真核微生物，外源真核基因最理想的表達系統(tǒng)

—優(yōu)點：1）基因結(jié)構相對比較簡單便于基因工程操作2）培養(yǎng)簡單

3）外源基因表達產(chǎn)物便于提取和加工4）不產(chǎn)生毒素

植物受體細胞

一優(yōu)點：全能性，即一個分離的活細胞在合適的培養(yǎng)條件下，較容易再分化成植

株。

—缺點：植物細胞有纖維素參與組成的堅硬細胞壁，不利于攝取重組DNA分子。

一現(xiàn)在用作轉(zhuǎn)基因受體植物有水稻、棉花、玉米、馬鈴薯、煙草等經(jīng)濟作物和擬

南芥等模式植物

動物受體細胞

—優(yōu)點：能抑制和除去外源真核基因中的內(nèi)含子，剪切和加工成熟的mRNA；真

核基因的表達蛋白在翻譯后能被正確加工或修飾，產(chǎn)物具有較好的蛋白質(zhì)免疫原

性，約為酵母細胞的16—20倍；易于被重組DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，具有遺傳穩(wěn)定性和

可重復性；經(jīng)轉(zhuǎn)化的動物細胞可將表達產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，便于提純和加工，

成本低，

一缺點：組織培養(yǎng)技術要求高，難度較大。

&?目的基因?qū)胧荏w細胞的方法：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染

—重組DNA的細菌細胞轉(zhuǎn)入方法：化學轉(zhuǎn)化法和高壓電穿孔法等。

&.化學轉(zhuǎn)化法

細菌的感受態(tài)細胞

一轉(zhuǎn)化：以質(zhì)粒為載體的重組DNA分子引入受體細胞的過程。

一轉(zhuǎn)染：以噬菌體或病毒為載體的重組DNA分子引入受體細胞的過程

—感受態(tài)細胞：受體細胞處于攝入外源DNA的狀態(tài)。一般用0.01—0.05mol/L

氯化鈣處理受體細胞，可以引起細胞膨脹，增大細胞的通透性，使重組DNA進入

細胞，提高轉(zhuǎn)化率。

細菌轉(zhuǎn)化機制：1）細菌感受態(tài)的形成2）轉(zhuǎn)化因子的吸收3）整合復合物前體

的形成4）單鏈DNA轉(zhuǎn)化因子的整合5）轉(zhuǎn)化子的形成

—將重組體DNA導入感受態(tài)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化實驗是一種十分有效的導入外源DNA

的手段，整個過程包括制備感受態(tài)細胞和轉(zhuǎn)化處理。

—感受態(tài)細胞的制備：1）將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中，冰上放置lOmin,然后于4℃

下3000g離心10min2）棄去上清,，用預冷的的0.05mol/L的Cacl2溶液10mL

輕輕懸浮細胞，冰上放量15—30min后，4℃下3000g離心10min3）棄去上

清，加入4mL預冷含15%甘油的0.05mol/L的Cacl2溶液，輕輕懸浮細胞，冰

上放置幾分鐘，即成感受態(tài)細胞懸液4）感受態(tài)細胞分裝200mL的小份，貯

存于70℃可保存半年。

&.高壓電穿孔轉(zhuǎn)化法：又稱為電擊轉(zhuǎn)化法，最初應用于將DNA導入真核細胞，

自1998年起被Dower等人用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌

—基本原理：利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細胞膜上進行電穿孔，形成可逆

的瞬間通道，從而促進外源DNA的有效吸收。

優(yōu)點：導入比Cacl2法方便

&.重組DNA向真核細胞轉(zhuǎn)入

一借助于載體的基因轉(zhuǎn)移：以重組的動植物病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒直接轉(zhuǎn)染受體細

胞，把外源DNA引入

一不需載體的基因轉(zhuǎn)移

&.磷酸鈣沉淀法：最早應用于哺乳動物培養(yǎng)細胞基因轉(zhuǎn)移的一種傳統(tǒng)方法。

&.脂質(zhì)體介導法：將DNA或RNA包裹于脂質(zhì)體內(nèi)，然后進行脂質(zhì)體與細胞膜

融合，通過融合將基因?qū)爰毎?/p>

一植物細胞轉(zhuǎn)化技術：將重組DNA通過生物、物理、化學等方法導入植物細胞

以獲得轉(zhuǎn)基因植株的技術

一重組DNA載體轉(zhuǎn)化法：將目的基因連接于某一個載體DNA上，然后通過宿

主感染受體植物而將外源基因轉(zhuǎn)入植物細胞的方法。

一方法：土壤根癌農(nóng)桿菌介導和病毒衍生載體轉(zhuǎn)化。

&.Ti質(zhì)粒的作用和改造：

優(yōu)點：Ti質(zhì)粒的T—DNA能夠自發(fā)整合到植物染色體DNA上，誘導植物形成腫

瘤；T—DNA上的opine合成酶基因具有一個強啟動子，能啟動外源基因在植物

細胞中高效表達

缺點：分子質(zhì)量；限制酶位點多；含有許多編碼氨基酸；沒有復制起始點和篩選

標記基因；存在一些對于T—DNA轉(zhuǎn)移不起任何作用的基因。

改造原則：保留T—DNA的轉(zhuǎn)移功能，取消T—DNA的致瘤性；通過簡并的手

段可使外源DNA插入T-DNA中，并隨著T-DNA整合到植物染色體上

-目前應用最廣，最有效的植物基因工程載體是PGV3850（一種經(jīng)改造的Ti

質(zhì)粒）

一載體轉(zhuǎn)化的具體方法：1）創(chuàng)傷植物感染法：在植株上形成新傷口，并使用生

活力強的細菌培養(yǎng)物2）原生質(zhì)體共培養(yǎng)法：適用于為數(shù)不多的幾種植物3）

葉盤法：目前植物轉(zhuǎn)化基因應用最廣泛的方法。葉片一清水沖洗一滅菌一打孔一

葉盤一感染一無菌濾紙吸于表面一共培養(yǎng)一篩選一愈傷組織一生根一發(fā)芽一完

整植株一檢驗

植物細胞外源基因的直接轉(zhuǎn)化法

1）電擊法：原生質(zhì)體與外源基因混合置于電擊儀的樣品小室中，然后在一定電

壓下進行短時間直流電脈沖，再培養(yǎng)。

2）基因槍法3）離子束介導法4）多聚物介導法（PEG）5）花粉管通道法

第六節(jié)DNA重組子的篩選

1.遺傳表型檢測法

一根據(jù)載體表型特征的篩選

表型：生物體遺傳組成同環(huán)境相互作用所產(chǎn)生的外觀或其他特征

—抗藥性標記插入失活篩選法：檢測外源DNA插入作用的一種通用方法

常用的遺傳標記基因及其作用機制:

—四環(huán)素抗性基因：四環(huán)素克結(jié)合在核糖體30s亞基中的一種蛋白質(zhì)分子上，

抑制核糖體的轉(zhuǎn)位過程。

—氨葦青霉素抗性基因：氨葦青霉素可抑制細菌細胞膜上參與細胞壁合成酶類的

活性。

一氯霉素抗性基因：氯霉素可結(jié)合在核糖體50s亞基上，阻止蛋白質(zhì)合成。

-卡那霉素、新酶素和G418抗性基因：卡那霉素、新酶素和G418均屬脫氧鏈

霉胺氨基葡萄糖甘類抗生素，可結(jié)合在核糖體上阻止蛋白質(zhì)的合成。

根據(jù)插入基因遺傳性狀的篩選

2.核酸分子雜交

原理：帶有互補的特定核甘酸序列的單鏈DNA或RNA,當它們混合在一起

時，其相應的同源區(qū)段將會退火形成雙鏈的結(jié)構。

雜交雙方：待測的核酸序列；插入片段基因制備的DNA或RNA探針。

探針：帶有特殊標記的核酸片段，能夠與待測的核酸片段互補結(jié)合，可用于檢測

核酸樣品中存在的特定基因。它即可是人工合成的寡核甘酸片段基因組DNA片

段，cDNA片段全長或部分片段，還可以是RNA片段。

一菌落印記原位雜交：

生長在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑，按照原位不變地轉(zhuǎn)移到濾膜上，然后

在原位上溶菌，DNA變性和雜交作用（探針），篩選出克隆菌落的方法。

檢測對象：RNA,DNA和蛋白質(zhì)

步驟：

（1）將被篩選的菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維濾膜上，同時保藏原來的菌落平板作為參

，昭、、、

（2）菌落的裂解及DNA結(jié)合與硝酸纖維濾膜

（3）膜上的DNA烤干固定后加入探針，同濾膜上的菌落所釋放的變性DNA雜

交

（4）用放射自顯影技術進行檢測

（5）含有與探針互補序列的菌落DNA,就會在X光膠片上出現(xiàn)曝光點。

一斑點印記雜交(與菌落原位雜交的原理相同)

將DNA或RNA變性后直接點樣于NC膜或尼龍膜上

優(yōu)點：簡單、快速，可同時檢測多個樣品

—Sourthern印記雜交

DNA與DNA的雜交，即將DNA電泳，轉(zhuǎn)印到固相支持物上，用探針進行檢測

的方法(即用DNA或RNA探針檢測DNA樣品)

只有帶有插入片段的重組載體才能與探針雜交

步驟：

(1)提取重組體總DNA

(2)利用限制性酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳

(3)在堿性溶液中使DNA變性

(4)經(jīng)毛細管虹吸作用被原位轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或尼龍膜上

(5)將膜上的DNA烤干固定后加入雜交液和標記探針進行雜交，洗去多余探

針

(6)在X光片上放射自顯影

3.物理檢測法

—直接凝膠電泳檢測法：利用插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量

大

從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒、電泳比較其分子量

一限制性核酸內(nèi)切酶片段分析法

原理：根據(jù)已知的外源DNA序列的限制酶切圖譜，選擇一兩種限制性核酸內(nèi)切

酶切割質(zhì)粒，電泳后比較電泳結(jié)果(DNA帶數(shù)和長度)

4.免疫化學檢測法

對表達產(chǎn)物的檢測：利用抗體作為探針來檢測轉(zhuǎn)入受體菌并且表達出相應的蛋白

質(zhì)的外源基因

一放射性抗體檢測法

一免疫沉淀檢測法(檢測分泌型產(chǎn)物)

原理：抗原一抗體凝集反應

方法：把非放射性抗體加到平板培養(yǎng)基中，當插入基因的表達產(chǎn)物被細菌分泌到

菌落周圍時就會與抗體形成沉淀圈

—Western印記分析法

檢測對象：外源基因在轉(zhuǎn)化細胞中的表達情況，主要是檢測表達產(chǎn)生的蛋白質(zhì)

步驟：

(1)提取重組體蛋白

(2)用SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)

(3)將蛋白質(zhì)從聚丙烯酰胺凝膠上原位轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上

(4)進行抗體與抗原結(jié)合反應

5.核酸序列分析及其他方法

一核酸序列分析：測定結(jié)果直接反應了重組子中有無目的基因的存在

—PCR法：以載體或目的基因的序列設計擴增引物進行檢測

—Northern印記雜交：與sourthern雜交原理基本相同，只是檢測對象是RNA

步驟：

(1)提取重組總體RNA或mRNA

(2)在強變性劑存在的情況下，進行瓊脂糖凝膠電泳

(3)將電泳分離的RNA原位吸印到經(jīng)化學處理過的紙或硝酸纖維素膜上

(4)用同位素標記的探針進行雜交

(5)在X光片上放射自顯影

第七節(jié)反義基因技術

1.基本概念

反義RNA：指有義DNA鏈轉(zhuǎn)錄成的、與特異的靶RNA互補結(jié)合并能抑制靶RNA

表達的一段序列

反義基因：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反義RNA的基因

反義RNA技術：把一段DNA序列以反義方向插入到合適的啟動子和終止子之

間，然后把此基因構建體轉(zhuǎn)化到受體細胞中去，通過選擇培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)化生物體的

技術

2.反義基因的表達載體構建方法：

(1)分離得到mRNA,并以其為模板合成反義DNA

(2)以此反義鏈為模板合成有義DNA鏈

(3)以細菌質(zhì)粒(DNA)為載體，用限制性酶切靠近啟動子處，產(chǎn)生切口

(4)將有義DNA插入表達載體的切口中，若插入的表達載體酶切后以相反的

方向插入載體DNA環(huán)中，即表達載體轉(zhuǎn)錄形成反義RNA

3.反義基因技術的應用

(1)果實性狀及品質(zhì)的調(diào)控【轉(zhuǎn)基因番茄；PG基因；水解果膠；多聚半乳糖

醛酸酶基因】

(2)對觀賞性植物性狀的調(diào)控

(3)植物抗病毒

(4)控制油料種子中脂肪酸的合成

(5)降低或去除食品中有害化學成分

(6)其他方面的應用

第八節(jié)基因操作的主要技術原理

1.電泳技術

基本概念：

電泳：指帶電的顆?；蛏锓肿釉谕饧与妶鲎饔孟?，向帶相反電荷的電極作定向

移動的現(xiàn)象

電泳技術分類：根據(jù)有無支持物將其分為無支持物的自由電泳和有支持物的區(qū)帶

電泳兩類

區(qū)帶電泳包括以濾紙作為支持物的紙電泳，以醋酸纖維素等薄膜為支持物的薄層

電泳，以及與凝膠為支持物的凝膠電泳

基本理論：

不同帶電顆粒在同一電場中泳動的速度不同。常用泳動度(或遷移率)來表示

泳動度：指帶電顆粒在單位電場強度下泳的速度

影響泳動度的主要因素：決定于顆粒的性質(zhì)；電泳強度；溶液pH值；溶液的離

子強度

瓊脂糖凝膠電泳：

優(yōu)點：（1）瓊脂含液體量大，可達98~99%（2）瓊脂作為支持體均勻（3）

電泳速度快（4）透明而不吸收紫外線（5）區(qū)帶易染色，樣品易回收

2.聚合酶鏈式反應（PCR）技術

定義：在DNA聚合酶催化下，以DNA為模板，特定引物為延伸起點，通過變

性、退火、延伸等步驟；在體外復制DNA的過程，又稱基因擴增技術

PCR技術的基本原理：（PCR反應原理類似于DNA的天然復制過程）

一種在模板DNA、弓物和4種脫氧核甘酸存在的條件下利用DNA聚合酶的酶促

反應，通過3個溫度依賴步驟完成反復循環(huán)，反應共分變性、退火、延伸3步

進行。

PCR技術步驟：（1）高溫變性（2）低溫退火（3）適溫延伸

PCR技術的反應體系：（1）PCR操作程序：反應體系、反應參數(shù)、其實模板（2）

PCR反應的5大要素：引物、DNA聚合酶、四種dNTP、Mg2+、模板（3）

PCR反應條件：變性的時間和溫度、引物的退火，延伸的時間和溫度、平臺效

應

PCR技術引物設計原則：

（1）引物長度在15~30bp,常為20bp左右

（2）引物中堿基的分布應當是隨機的，避免出現(xiàn)一連串的單一堿基或產(chǎn)生二級

結(jié)構

（3）GC堿基的含量在45~55%

（4）兩個引物在3'端必須與模板互補，5'端可不互補

（5）引物自身連續(xù)互補堿基小于4個

（6）引物之間連續(xù)互補堿基亦應小于4個

PCR技術在食品科學領域中的應用：

（1）在食品微生物檢測方面的應用

（2）在轉(zhuǎn)基因食品檢測方面的應用

（3）食品成分檢測方面的應用

（4）鑒定食品的原料種類和原產(chǎn)地

第九節(jié)基因工程在食品工業(yè)中的應用

第三章細胞工程

第一節(jié)細胞工程的基本原理

1.細胞工程的概念和分類

細胞工程：也稱細胞技術，以細胞為對象，應用生命科學理論，借助基因工程原

理與技術，有目的地利用或改造生物遺傳特性，以獲得特定的細胞，組織產(chǎn)品或

新型物種的一門綜合性科學技術

分類（研究對象）：動物細胞工程、植物細胞工程、微生物細胞工程

核心技術：細胞培養(yǎng)與繁殖

目的：獲得新性狀、新個體、新物質(zhì)

2.細胞工程的發(fā)展歷史

細胞工程的理論基礎是細胞學說和細胞全能性學說

幼胚培養(yǎng)和胚胎拯救技術是最早應用的植物細胞工程技術

3.細胞工程的基本操作和技術

無菌操作技術：無菌室，超凈工作臺

細胞培養(yǎng)技術：動物、植物和微生物

細胞融合技術：細胞工程的重要基本技術

細胞標記、制備原生質(zhì)體、誘導細胞融合。篩選雜合細胞

4.細胞全能性

定義：在適宜條件下，細胞具有潛在的發(fā)育成完整植株或個體的能力

細胞全能性是細胞工程科學的理論核心

菌體培養(yǎng)之所以能夠成功，首先是由于植物細胞具有全能性的緣故

第二節(jié)細胞培養(yǎng)技術

細胞培養(yǎng)技術：動物細胞培養(yǎng)、植物細胞培養(yǎng)和微生物細胞培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)技術是生物技術中最核心、最基礎的技術

1.微生物細胞的培養(yǎng)

—培養(yǎng)基的組成：一般培養(yǎng)基包括：碳源、氮源、無機鹽、維生素

一培養(yǎng)基的種類和應用：

（1）按成分不同：天然培養(yǎng)基【牛肉膏蛋白質(zhì)培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基】合成

培養(yǎng)基【高I號培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基】

（2）按物理狀態(tài)：固體、半固體、液體培養(yǎng)基

（3）按用途：基礎培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基）、加富培養(yǎng)基（也稱營養(yǎng)培養(yǎng)

基）、鑒別培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基

一培養(yǎng)方法：

（1）固體培養(yǎng)：多用于菌種的分離純化、保藏和種子的制備。在工業(yè)生產(chǎn)中，

固體培養(yǎng)基常用來制曲以及進行食用菌絲的培養(yǎng)

（2）液體培養(yǎng)：基本上克服了固體培養(yǎng)規(guī)模小、不均一和不便監(jiān)控的缺點，是

大量微生物培養(yǎng)的一個重要方法

可觀察到微生物在生長繁殖過程中的四個階段：延滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡

期

分類：連續(xù)培養(yǎng)、中間補料培養(yǎng)、同步培養(yǎng)、混合培養(yǎng)

——連續(xù)培養(yǎng)，也稱開放培養(yǎng)，相對分批培養(yǎng)或密閉培養(yǎng)而言，指能將細胞種子

和培養(yǎng)液不斷加入反應器內(nèi)，另一方面又將新鮮培養(yǎng)液不斷加入反應器內(nèi)，另一

方面又將反應液連續(xù)不斷的取出，使反應條件處于一種恒定狀態(tài)。

分類：恒濁培養(yǎng)、恒化培養(yǎng)

一恒濁培養(yǎng)：菌體濃度、生長濃度恒定

—恒化培養(yǎng)：營養(yǎng)物質(zhì)濃度基本恒定。如；酒精發(fā)酵、丙酮、丁醇發(fā)酵

一一中間補料培養(yǎng)，也稱半連續(xù)培養(yǎng)、流加培養(yǎng)、補料分批培養(yǎng)等。指在微生物

培養(yǎng)過程中放出部分培養(yǎng)液進入提煉加工工序，在剩余的培養(yǎng)液中加體積的、新

的未接種的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，如此反復。

優(yōu)點：（1）可以消除底物抑制（2）可以達到高濃度細胞培養(yǎng)

（3）延長次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)時間（4）稀釋有毒代謝物

（5）降低染菌和避免遺傳不穩(wěn)定性

——同步培養(yǎng)：使所有細胞都處于大體相同的分裂周期的處理后，才使增殖同時

開始進行的微生物培養(yǎng)法

分類：選擇法（均一化法）、誘導法（如低溫、限制性營養(yǎng)成分、光照等）

—混合培養(yǎng)；

極端關系：（1）互不相干，不存在相互作用（2）互生關系

較常見關系：競爭關系

2.植物細胞培養(yǎng)

廣義上：在無菌條件下，將離體的單個游離細胞在人工控制的環(huán)境里培養(yǎng)，以獲

得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟價值的其他生物產(chǎn)品的一種技術

食品工業(yè)意義上：細胞懸浮培養(yǎng)，即使游離的植物細胞或一些小的細胞團在液體

培養(yǎng)中增殖并分離提取細胞產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物

植物細胞培養(yǎng)基的組成及種類：

——培養(yǎng)基成分：無機鹽類、碳源、維生素、植物生長激素、有機碳源、一些混

合物

—植物細胞培養(yǎng)體系建立過程：整體植株一植物組織或器官一外植體一愈傷

組織誘導一愈傷組織繼代培養(yǎng)一懸浮培養(yǎng)

——植物細胞培養(yǎng)和次生代謝物的生產(chǎn)

植物次生代謝產(chǎn)物：植物中一大類非植物生長發(fā)育所必須的小分子有機化合物，

其生產(chǎn)和分布通常有種屬、器官組織和生長發(fā)育的特異性

植物細胞培養(yǎng)方法：單細胞的培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)、液體培養(yǎng)（搖瓶

懸浮培養(yǎng)和大規(guī)模懸浮培養(yǎng)）等

工業(yè)化植物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)主要有兩大類：懸浮細胞培養(yǎng)系統(tǒng)和固定化細胞培養(yǎng)系

統(tǒng)

一一植物細胞懸浮培養(yǎng)

定義：將游離單細胞或細胞團按照一定的細胞密度懸浮在液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)的

方法

能提供同步分裂的、增殖迅速的大量細胞，可用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)

一一封閉式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)：

優(yōu)點：結(jié)構簡單，易于操作

缺點：生產(chǎn)效率不夠高，次生代謝產(chǎn)物積累量也較少

后人改進：半連續(xù)培養(yǎng)方法、連續(xù)培養(yǎng)方法

一個成功的懸浮細胞培養(yǎng)體系必須滿足的條件：

(1)懸浮培養(yǎng)分散性良好，細胞團較小

(2)大小均一性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同

(3)生長速度

一一建立良好的懸浮培養(yǎng)細胞系的關鍵技術(注意瓠)：

(1)選擇合適的外植體

(2)誘導疏松易碎的愈傷組織

(3)選擇合適的培養(yǎng)基

(4)懸浮培養(yǎng)

(5)懸浮培養(yǎng)細胞的繼代與選擇

——植物細胞懸浮培養(yǎng)方法：分批培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)

分批培養(yǎng)：指在新鮮的培養(yǎng)基中加入少量的細胞，在培養(yǎng)過程中既不從培養(yǎng)系統(tǒng)

中放出培養(yǎng)液，也不從外界向培養(yǎng)系統(tǒng)中補加培養(yǎng)基的一種培養(yǎng)方法

特征：培養(yǎng)基的基質(zhì)濃度隨時間而下降，細胞濃度和產(chǎn)物隨時間增長而增加，整

個過程經(jīng)歷了誘導期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期

連續(xù)培養(yǎng)：指在培養(yǎng)過程中不斷加入新鮮培養(yǎng)基，排除用過的培養(yǎng)基，保持培養(yǎng)

物的容積恒定，培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質(zhì)得到不斷補充

類型：開放式連續(xù)培養(yǎng)和封閉式連續(xù)培養(yǎng)(開放式又分為恒濁培養(yǎng)和恒化培養(yǎng))

半連續(xù)培養(yǎng)法：指在反應器中投料和接種培養(yǎng)一段時間后，將部分培養(yǎng)液與新鮮

培養(yǎng)液進行交換的培養(yǎng)方法。

一一植物細胞固定化培養(yǎng)

定義：把細胞固定在一種惰性基質(zhì)(如瓊脂、藻酸鹽等)上面或里面，細胞不能

運動而培養(yǎng)液可以在細胞內(nèi)流動；供應其營養(yǎng)的細胞培養(yǎng)技術

分類：包埋式與附著式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)

植物細胞固定化培養(yǎng)優(yōu)點：

(1)可以較容易地控制培養(yǎng)系統(tǒng)的理化環(huán)境

(2)有利于次生產(chǎn)物的合成

(3)節(jié)省生產(chǎn)細胞所付出的時間和費用

(4)可以進行連續(xù)生產(chǎn)

常見的植物細胞固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：平床培養(yǎng)系統(tǒng)和立柱培養(yǎng)系統(tǒng)

3.動物細胞培養(yǎng)

定義：從動物有機體中取出相關的組織，將它分散成單個細胞，然后放在適宜的

培養(yǎng)基中，讓這些細胞生長和繁殖

分類：原代細胞培養(yǎng)和傳代細胞培養(yǎng)

原代細胞：從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞

傳代細胞：將原代細胞從培養(yǎng)基中取出，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個

以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)

動物細胞培養(yǎng)技術是其他動物細胞工程技術的基礎

動物細胞培養(yǎng)基的組成與種類：

組成：氨基酸、維生素、鹽、葡萄糖、有機添加劑、激素和生長因素

常用培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基

動物細胞培養(yǎng)方法：

懸浮培養(yǎng)：也稱非貼壁依賴性細胞培養(yǎng)

貼壁依賴性細胞培養(yǎng)：也稱鐵壁培養(yǎng)

固定化培養(yǎng)；大規(guī)模培養(yǎng)法

第三節(jié)細胞融合技術

1.細胞融合：又稱細胞雜交，指在外力（人工或自然）作用下，使兩種或兩種以

上易源（種、屬間）細胞或原生質(zhì)體相互接觸，不經(jīng)過有性過程而發(fā)生膜融合，

胞質(zhì)融合和核融合并形成一個雜合細胞的現(xiàn)象。

2.自然融合：在自然條件下，體內(nèi)或體外培養(yǎng)細胞間所發(fā)生的融合

3.人工誘導融合：在體外用人工方法促使相同或不同的細胞間發(fā)生的融合

4.細胞融合方法

⑴生物學方法：以病毒為誘導融合劑，如仙臺病毒

⑵化學融合劑方法：采用化學融合劑如PEG、DMSO及脂類物質(zhì)

（3）電融合法：采用高頻電場脈沖

電融合法：

&.通過雙向電泳使細胞間的接觸變得非常緊密

&.采用高頻交流電在活細胞等微粒的內(nèi)部，誘導去極化，引起細胞聚集，排列

成串珠狀，相互緊密接觸

&.給予短暫的高壓脈沖，引起細胞膜的穿透，隨后細胞膜發(fā)生結(jié)合導致細胞融合

3.微生物的細胞融合：用細胞融合法制成新酵母釀制白葡萄酒

4.融合方法的選擇

(1)誘導動物細胞的融合：仙臺病毒誘導、PEG法、電融合法都適用

(2)植物細胞融合：PEG法和電融合法

(3)微生物細胞的融合：只適用PEG法

第四節(jié)細胞工程在食品工業(yè)中的應用

1.植物細胞工程在食品工業(yè)中的應用

植物細胞工程：以植物細胞為基本單位，在離體條件下進行培養(yǎng)、繁殖成人為的

精細操作，使細胞的一些生物學特性按人們的意愿發(fā)生根本改變，從而達到改良

品種或產(chǎn)生生物產(chǎn)品的一種技術

植物細胞工程在食品工業(yè)中的應用：

(1)利用植物細胞工程生產(chǎn)香料

(2)利用植物細胞培養(yǎng)技術生產(chǎn)食品添加劑

(3)利用植物細胞培養(yǎng)技術生產(chǎn)天然食品

(4)利用植物細胞培養(yǎng)技術生產(chǎn)植物藥

(5)利用植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)抗氧化劑

2.動物細胞工程在食品工業(yè)中的應用

動物細胞工程的應用：利用動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術生產(chǎn)植物和微生物難于生產(chǎn)

的具有特殊功能的蛋白質(zhì)類物質(zhì)

涉及的主要技術：組織培養(yǎng)、細胞融合、細胞拆合、染色體或染色體組轉(zhuǎn)移等

動物細胞工程應用：

(1)疫苗生產(chǎn)：口蹄疫疫苗，乙型肝炎疫苗、狂犬疫苗等

(2)干擾素生產(chǎn)：a一干擾素、B—干擾素、Y一干擾素

(3)單克隆體的生產(chǎn)

(4)干細胞體外誘導分化產(chǎn)生特異細胞或抗體

(5)在其他基因重組產(chǎn)品產(chǎn)生上的應用

第四章酶工程與食品行業(yè)

第一節(jié)酶工程概述

1.基本概念

酶：一類由活細胞產(chǎn)生的，對其特異性底物具有高效催化作用的蛋白質(zhì)

酶工程：又稱酶技術，是指利用酶的催化作用進行的質(zhì)轉(zhuǎn)化，將酶學基本理論與

化工技術相結(jié)合而形成的技術

2.酶工程研究的分類和內(nèi)容

根據(jù)酶工程研究和解決問題的手段不同，將酶工程分為化學酶工程和生物酶工程

化學酶工程：亦稱初級酶工程，包括自然酶、化學修飾酶、固定化酶及化學人工

酶的研究和應用

自然酶（天然酶）：由生物材料中分離出來的酶，主要指微生物發(fā)酵生產(chǎn)，應用

于工業(yè)與醫(yī)學

化學修飾酶：通過對酶分子實行手術達到構建和改性目的，主要用于基礎酶學研

究和疾病治療

固定化酶：將酶分子通過吸附，交聯(lián)、包埋及共價鍵結(jié)合束縛于某種

特定支持物上而發(fā)揮酶的作用

化學人工酶：根據(jù)酶的催化原理，模擬酶的催化功能，用化學方法合成具有專一

性的催化劑

——生物酶工程（亦稱高級酶工程）

（1）用基因工程技術大量生產(chǎn)酶（克隆酶）

（2）修飾酶基因產(chǎn)生遺傳修飾酶（突變酶）

（3）設計新酶基因，合成自然界不曾有的酶（新酶）

3.食品酶的來源、分類及其作用機理

食品酶的來源：

從自然界中獲得：大部分食品用酶都是從微生物中提取

酶的定向改造：通過酶的定向改造可以獲得新酶或功能改善的酶

固定化酶：酶經(jīng)過固定化后可以長時間、多次利用，提高酶的使用效率

微生物誘變育種：誘變方法進行菌種的改造或轉(zhuǎn)移再生，提高產(chǎn)酶

2.酶的分類:氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構酶、合成醐

3.酶的作用機理：

酶分子組成：單純酶

組成酶（全酶）：酶蛋白、輔助因子（金屬離子、小分子有機物）

酶的活性中心：

定義：結(jié)合并催化一定底物使之發(fā)生化學變化的位于酶分子上的特定空間結(jié)構區(qū)

域。輔助因子參與酶的活性

第二節(jié)食品酶的生產(chǎn)和分離純化

發(fā)展微生物作為酶生產(chǎn)的原因（優(yōu)點）：

（1）微生物生長繁殖快，生活周期短，產(chǎn)量高、單位干重產(chǎn)物的酶比活高

（2）微生物培養(yǎng)方法簡單，所用的原料大多數(shù)為農(nóng)副產(chǎn)品，來源豐富，價格低

廉，機械化程度高，經(jīng)濟效益高

（3）微生物菌株種類繁多，酶的品種齊全

（4）微生物有較強的適應性和應變能力

優(yōu)良產(chǎn)酶菌種應具備的條件：

（1）不能是致病菌

（2）不易退化，不易感染噬菌體

（3）產(chǎn)酶量高，而且最好產(chǎn)生胞外酶

（4）能利用廉價的原料

發(fā)酵方法：固體發(fā)酵和液體深層發(fā)酵

酶的分離純化方法：

（1）根據(jù)酶分子大小和形狀的分離方法：離心分離、凝膠過濾、透析與超濾

（2）根據(jù)酶分子電荷性質(zhì)的分離方法：離子交換層析、層析聚焦、電泳、等電

聚焦電泳

（3）根據(jù)分子專一性結(jié)合的分離方法：親和層析、染料配體親和層析、共價層

析

（4）根據(jù)分配系數(shù)的分離方法：雙水相萃取分離

第三節(jié)酶的固定化及其生產(chǎn)應用技術

固定化酶：通過物理或化學的手段，將酶固載在某種基體上

自由酶：酶直接加入溶液中，酶自身的空間結(jié)構不發(fā)生改變，保持自己的生物特

性

固定化酶的特點

優(yōu)點：

（1）易于將酶與底物及產(chǎn)物分離，產(chǎn)物相對容易提純

（2）酶能夠重復利用，使用效率提高，成本低

（3）大多數(shù)情況下可以提高酶的穩(wěn)定性

（4）可以增加產(chǎn)物的效率，提高產(chǎn)物質(zhì)量

（5）有利于實現(xiàn)管道化、連續(xù)化以及自動化操作，易于與各種分離手段聯(lián)用

缺點：

（1）存在大量酶失活現(xiàn)象

（2）消耗固定化材料

（3）增加底物和產(chǎn)物的傳質(zhì)阻力

（4）只能用于可溶性小分子底物，與完整的菌體細胞相比，較不

適宜多酶反應

酶的固定化方法：吸附法、共價結(jié)合法、交聯(lián)法、包埋法

吸附法：

分類：物理吸附法和離子交換吸附法

優(yōu)點：酶活力損失少

缺點：酶和載體間的結(jié)合力不強，會導致催化活力的喪失和玷污反應產(chǎn)物，實用

價值少

包埋法：將聚合物的單體與酶溶液混合，再借助于聚合助進劑（包括交聯(lián)劑）的

作用進行聚合，酶被包埋在聚合物中以達到固定化

分類：凝膠包埋法和微囊化法

優(yōu)點：操作簡單，可制得較高活力的固定化酶，大多數(shù)粗酶、粗酶制劑、完整微

生物細胞都適用

缺點：只有小分子底物和產(chǎn)物可以通過凝膠網(wǎng)絡；對大分子底物不適宜；凝膠網(wǎng)

絡對物質(zhì)擴散的阻力導致固定化酶動力學行為的變化、活力降低

共價鍵結(jié)合法：酶蛋白的側(cè)鏈基團和載體表面上的功能基團之間形成共價鍵而固

定的方法

優(yōu)點：酶與載體結(jié)合牢固，酶不易脫落

缺點：反應條件比較激烈，酶易失活；制作手續(xù)繁瑣

交聯(lián)法：

交聯(lián)酶法：在一定條件下，加入一定量的戊二醛溶液于酶溶液中，生成不溶性固

定化酶

酶與輔助蛋白交聯(lián)法：用雙功能或多功能試劑是惰性蛋白質(zhì)與酶共交聯(lián)，從而制

備固定化酶

載體交聯(lián)法：用多或雙功能試劑的一部分功能基因與載體交聯(lián)，另一部分功能基

團與酶蛋白交聯(lián)而制備固定化酶法

酶傳感器：

定義：以固定化酶作感受器，以基礎電極作為換能器的生物傳感器

工作原理：把酶電極插入待測溶液中，固定化酶專一催化混合物中目標物質(zhì)發(fā)生

化學反應，產(chǎn)生某種離子或氣體等電極活性物質(zhì)，再由基礎電極給出混合物溶液

中的目標物質(zhì)的溶度數(shù)據(jù)

第五章蛋白質(zhì)與食品行業(yè)

第一節(jié)概述

蛋白質(zhì)工程的概念：

狹義：利用生物技術對蛋白質(zhì)結(jié)構或者對其編碼蛋白質(zhì)的基因進行改造，以便獲

得更適合人類需要的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的新技術

廣義：通過物理、化學、生物和基因重組等技術改造蛋白質(zhì)或設計合成具有特定

功能的新蛋白質(zhì)

第二節(jié)蛋白質(zhì)工程的里了呢設計和基本步驟

蛋白質(zhì)工程基本步驟：

（1）分離純化蛋白質(zhì)及其結(jié)構信息獲得

（2）進行功能研究，確定功能域

（3）進行一級結(jié)構、空間結(jié)構和功能關系研究，尋找關鍵基團和結(jié)構

（4）改造蛋白質(zhì)的功能性測定

第六章發(fā)酵工程與食品產(chǎn)業(yè)

第一節(jié)發(fā)酵工程概述

發(fā)酵：微生物在無氧條件下，分解各種有機物質(zhì)生產(chǎn)能量的方式

工業(yè)發(fā)酵：利用微生物制造或生產(chǎn)某些產(chǎn)品的過程，包括有氧、無氧培養(yǎng)

發(fā)酵工程：利用現(xiàn)代工程技術手段，利用微生物的某些特定功能，為人類生產(chǎn)有

用的產(chǎn)品，或直接把微生物應用于生產(chǎn)過程中

發(fā)酵工程的內(nèi)容（從微生物的性質(zhì)來看，分為：）

（1）以微生物的細胞為產(chǎn)物的發(fā)酵工業(yè)

（2）以微生物的代謝產(chǎn)物為產(chǎn)品的發(fā)酵工業(yè)

（3）以微生物的酶為產(chǎn)品的發(fā)酵工業(yè)

（4）以微生物的生物的生物轉(zhuǎn)化為主的發(fā)酵工業(yè)

（5）微生物廢水處理及其他

發(fā)酵工程的組成部分：發(fā)酵培養(yǎng)基、滅菌、菌種擴繁、代謝產(chǎn)物、發(fā)酵產(chǎn)物萃取、

廢棄物回收與處理

第二節(jié)發(fā)酵設備與基本工藝過程

生物反應器（發(fā)酵罐）：利用酶或生物體（如微生物）所具有的生物功能，在體

外進行生化反應的裝置系統(tǒng)

發(fā)酵罐的設計原則：穩(wěn)定性、控制性、操作性、安全性、可視性

微生物發(fā)酵的類型：分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵、補料分批發(fā)酵

種子：具有一定數(shù)量和質(zhì)量，經(jīng)過活化后的純種培養(yǎng)物

種子的特點：活力高和生長潛勢大、生理狀態(tài)穩(wěn)定、無雜菌污染、生產(chǎn)性能穩(wěn)定

空氣的滅菌：

空氣滅菌方法：加熱滅菌、輻射除菌、靜電除菌、介質(zhì)過濾除菌

提高過濾除菌效率的方法：減少進口空氣的含菌數(shù)、設計和安裝合理的空氣過濾

器、空氣預處理、預先干燥過濾空氣

臨界溶氧濃度（PL臨界）：培養(yǎng)基中不存在其他抑制性基質(zhì)時，影響好養(yǎng)性微生

物生長繁殖的最低溶解氧濃度

攝氧率mmoLO2/L.s單位體積培養(yǎng)液在單位時間內(nèi)的耗氧率

氧傳遞系數(shù)：

空氣中氧進入細胞的三個步驟：空氣中的氧進入發(fā)酵液；溶解氧分子進入微生物

細胞；細胞吸收溶解氧

常用的氧傳遞系數(shù)測定方法：亞硫酸鹽氧化法；復膜電極法

增加溶解氧的工藝措施：

(1)提高通氣速率；

(2)改變攪拌速度；

(3)改變氣體組分中氧分壓

(4)改變罐壓

(5)改變發(fā)酵液的理化性質(zhì)

(6)加入中間傳氧介質(zhì)

第三節(jié)發(fā)酵過程的控制

發(fā)酵過程控制的基本原則：

目的：最佳產(chǎn)量和最佳質(zhì)量

優(yōu)化控制目標：最大量的發(fā)酵產(chǎn)物；最短的發(fā)酵周期；最佳經(jīng)濟效益

發(fā)酵過程pH值的變化：

下降：碳源過多，培養(yǎng)液大量積累有機酸；消泡油加得過多；微生物生理酸性物

質(zhì)的存在

上升：碳源過多，釋放氨基；存在生理堿性物質(zhì)；補料時堿性物質(zhì)加入過多

發(fā)酵過程中pH值的控制：

(1)加入緩沖劑緩沖pH值(EMS)

(2)及時調(diào)節(jié)pH值(加酸、堿)

(3)氨水調(diào)節(jié)

(4)尿素調(diào)節(jié)

(5)碳酸鈣調(diào)節(jié)

泡沫對發(fā)酵過程的影響和控制：

(1)目的：增加溶解氧；及時釋放細胞呼吸作用產(chǎn)生的C02

(2)發(fā)酵過程產(chǎn)生泡沫的原因：外界引進的氣流被機械化地分散形成泡沫；發(fā)

酵過程產(chǎn)生的氣體聚結(jié)；培養(yǎng)液的溫度、酸堿度、濃度

（3）危害：減少灌裝系數(shù)；造成大量逃液、產(chǎn)物損失；泡沫頂罐，增加染菌機

會；影響微生物生長；微生物自溶解；消泡劑的引入

（4）消除和控制泡沫的方法：機械消泡和化學消泡

（5）化學消泡劑要求：較低的表面張力；具有親水性；在水中溶解度較小；安

全無毒；不影響氧氣在發(fā)酵液中的溶解和傳遞；來源方便，價格便宜

第四節(jié)發(fā)酵工程在食品中的應用

對于發(fā)酵工程，微生物發(fā)酵主要應用于：

（1）直接利用微生物作為食品因子

（2）利用微生物發(fā)酵所產(chǎn)生的初級或次級代謝產(chǎn)物作為食品成分

（3）利用微生物分泌的蛋白酶，提高食品質(zhì)量，改進食品加工工藝以及食品成

分分子結(jié)構改性等方面

（4）傳統(tǒng)食品發(fā)酵

單細胞蛋白：

定義：適用于食品和動物飼料應用的微生物細胞，包括藻類、細菌、酵母菌、霉

菌和高等真菌等

原料：單糖、淀粉、蔗糖渣、廢蜜糖、有機碳源、泥炭、烷煌類、纖維素

菌種：酵母菌

第七章食品生物工程下游技術

第一節(jié)概述

?生物工程下游技術：由生物界自然產(chǎn)生的，由微生物菌體發(fā)酵的，動植物細

胞培養(yǎng)的，酶反應產(chǎn)生的，微生物轉(zhuǎn)化的各種生物工業(yè)生產(chǎn)過程獲得的微生

物原料，經(jīng)提取分離，獲得純產(chǎn)品的技術，屬于“物質(zhì)分離”范疇一生物分

離過工程（生物工程下游技術是指從基因工程獲得的動、植物和微生物的有

機體或器官上，從細胞工程、發(fā)酵工程和酶工程產(chǎn)物（發(fā)酵液、培養(yǎng)液）中

把目標化合物分離純化出來，使之達到商業(yè)應用目的的過程。）

生物技術下游加工過程特點:

（1）在原料液中目標成分的含量較低

（2）原料液是復、復雜的多相體系

（3）目標成分的穩(wěn)定性差，在不適宜的分離條件下會分解與失活

（4）要求產(chǎn)品純度高

第二節(jié)原料預處理

發(fā)酵液特點：

①發(fā)酵產(chǎn)物濃度低，處理體積大。

②微生物細胞的顆粒小，相對密度與液相相差不大。

③細胞含水量大，可壓縮性大，一經(jīng)壓縮就會變形。

④液相黏度大，容易吸附在濾布上。

⑤產(chǎn)物性質(zhì)不穩(wěn)定。

1）內(nèi)容：發(fā)酵液的成分極為復雜，包括微生物菌體、殘存培養(yǎng)基、活性酶類、

微生物的代謝產(chǎn)生

2）性質(zhì)：懸浮液狀態(tài)

發(fā)酵液的預處理：

（1）目的：改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，加快沉降速度；使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入以后處理的液

相中；出去部分雜質(zhì)

（2）預處理技術：絮凝、凝聚、釋放、加熱

（3）加熱：提高發(fā)酵液溫度可顯著降低懸浮粘度，提高過濾效率

（4）調(diào)節(jié)pH值：適當調(diào)節(jié)pH值可使蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)處于等電點，不穩(wěn)定

而沉淀出來，也可改變大分子的電荷性質(zhì)

（5）凝聚和絮凝：在化學試劑的作用下，改變發(fā)酵液中的大分子物質(zhì)和細胞碎

片的分散性質(zhì)，使聚結(jié)沉淀

第三節(jié)固液分離和細胞破碎

固液分離方法：

（1）離心分離：

原理：在離心作用的重力作用下顆粒沉降速度加快而沉淀

設備：高速冷凍離心機、碟片式離心機、管式離心機、傾析式離心機

優(yōu)點：分離速度快，分離效率高、液相澄清度好

缺點：設備投資高，耗能大，此外連續(xù)排料時，固相干度不如過濾設備

(2)過濾分離

原理：依據(jù)過濾介質(zhì)的空隙大小進行分離

設備：板框式過濾機、平板過濾機、真空旋轉(zhuǎn)過濾機、管式過濾機、深層過濾機、

涂層過濾機

優(yōu)點：設備簡單、操作容易、適合大規(guī)模工業(yè)應用

缺點：分離速度低、分離效果受物料性質(zhì)變化的影響，勞動強度大

細胞破