【課件】DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定課件高二下學(xué)期生物人教版（2019）選擇性必修3

探究·實(shí)踐：DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定

DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定實(shí)踐探究一、實(shí)驗(yàn)原理1.DNA體外擴(kuò)增的原理PCR利用了DNA熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的

與

。PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器，一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。PCR的產(chǎn)物一般通過

來鑒定。2.DNA片段電泳鑒定的原理瓊脂糖凝膠電泳解聚結(jié)合

DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定實(shí)踐探究一、實(shí)驗(yàn)原理1.DNA體外擴(kuò)增的原理PCR利用了DNA熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的

與

。PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器，一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。PCR的產(chǎn)物一般通過

來鑒定。2.DNA片段電泳鑒定的原理DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷

的電極移動(dòng)，這個(gè)過程就是電泳。瓊脂糖凝膠電泳相反解聚結(jié)合在電場的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。凝膠電泳原理示意圖

DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定實(shí)踐探究一、實(shí)驗(yàn)原理1.DNA體外擴(kuò)增的原理PCR利用了DNA熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的

與

。PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器，一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。PCR的產(chǎn)物一般通過

來鑒定。2.DNA片段電泳鑒定的原理DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷

的電極移動(dòng)，這個(gè)過程就是電泳。在凝膠中DNA分子的遷移速率與

等有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過

，可以在波長為300nm的

下被檢測出來。瓊脂糖凝膠電泳相反解聚結(jié)合凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象紫外燈加樣孔→PCR儀、微量離心管、微量移液器、一次性吸液槍頭電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽、電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液等）4種脫氧核苷酸的等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA擴(kuò)增緩沖液、無菌水、瓊脂糖和核酸染料等二、材料用具

DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定實(shí)踐·探究用于向微量離心管中轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，每吸取一種試劑后，其上的槍頭都必須更換自動(dòng)調(diào)控溫度，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增微量移液器一次性吸液槍頭二、材料與用具三、方法步驟用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分。移液

DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定實(shí)踐探究PCR技術(shù)PCR反應(yīng)體系的配方10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液5ul20mmol/l的4種脫氧核苷酸的等量混合液1ul20umol/l的引物I2.5ul20umol/l的引物II2.5ulH2O28-33ul1-5U/ul的TaqDNA聚合酶1-2U模板DNA5-10ul總體積50ul注：模板DNA的用量為1pg-1ug

DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定實(shí)踐探究實(shí)際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場所PCR技術(shù)三、方法步驟用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分。待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使

。移液離心

DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定實(shí)踐探究PCR技術(shù)反應(yīng)液集中在離心管的底部三、方法步驟用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分。待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使

。參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性940C，5min30次940C,30s550C,30s720C，1min最后一次940C，1min550C,30s720C，1min移液離心擴(kuò)增

DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定實(shí)踐探究PCR技術(shù)反應(yīng)液集中在離心管的底部使DNA充分變性，以利于引物更好地與模板結(jié)合PCR實(shí)驗(yàn)操作過程

注意：1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。2.該實(shí)驗(yàn)所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20℃儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4.在進(jìn)行操作時(shí)，一定要戴好一次性手套。5.PCR擴(kuò)增不能隨意加大試劑用量。

DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定實(shí)踐探究根據(jù)待分離DNA片段的大小，用

配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的

混勻。將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子，以形成

。三、方法步驟：配制瓊脂糖溶液制備瓊脂糖凝膠

DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定實(shí)踐探究電泳核酸染料加樣孔電泳緩沖液根據(jù)待分離DNA片段的大小，用

配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的

混勻。將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞撸⒉迦牒线m大小的梳子，以形成

。三、方法步驟：將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與

混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的

內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的。配制瓊脂糖溶液制備瓊脂糖凝膠加樣

DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定實(shí)踐探究電泳核酸染料加樣孔電泳槽電泳緩沖液凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）加樣孔標(biāo)準(zhǔn)參照物（Marker）填充電泳槽待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入

內(nèi)。將

加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。電泳緩沖液根據(jù)待分離DNA片段的大小，用

配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的

混勻。將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子，以形成

。三、方法步驟：將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與

混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的

內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的。配制瓊脂糖溶液制備瓊脂糖凝膠加樣電泳觀察接通電源，根據(jù)電泳槽

來設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待

前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳。取出凝膠置于

觀察和照相。

DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定實(shí)踐探究電泳核酸染料加樣孔電泳槽電泳緩沖液凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）加樣孔標(biāo)準(zhǔn)參照物（Marker）陽極至陰極之間的距離紫外燈下指示劑填充電泳槽待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入

內(nèi)。將

加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。電泳緩沖液思考：1.影響瓊脂糖凝膠遷移率的影響因素有哪些？分別有怎樣的影響？

DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定實(shí)踐探究2.緩沖液中溴酚藍(lán)起到什么作用？1、DNA的分子大小2、瓊脂糖濃度3、DNA分子的構(gòu)象

4、電源電壓5、離子強(qiáng)度影響作為指示劑，因?yàn)殇宸铀{(lán)呈藍(lán)色，而蛋白質(zhì)（DNA）是白色，在SDS-凝膠（瓊脂糖凝膠）中不明顯，且溴酚藍(lán)的相對分子量比蛋白質(zhì)(絕大部分、DNA)小，電泳時(shí)速度比蛋白質(zhì)稍快，因此當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)電泳槽底部(可看藍(lán)色調(diào)帶)，則電泳結(jié)束。

DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定實(shí)踐·探究

可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶（根據(jù)條帶的分布及粗細(xì)程度來評價(jià)擴(kuò)增的結(jié)果）一條條帶1.你是否成功擴(kuò)增出DNA片段？判斷的依據(jù)是什么？2.本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果應(yīng)該是幾條條帶？3.如圖所示，該片段大小約為

。750bp0次12次12次30次30次Marker四、結(jié)果分析與評價(jià)四、結(jié)果分析與評價(jià)

DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定實(shí)踐探究漏加了PCR反應(yīng)成