第十章-青霉素的生產(chǎn)

第十章青霉素的生產(chǎn)第一節(jié)概述第二節(jié)生產(chǎn)原理第三節(jié)青霉素的生產(chǎn)工藝過(guò)程第四節(jié)其他工藝技術(shù)及技術(shù)改造方向化學(xué)工業(yè)出版社學(xué)習(xí)目標(biāo)了解青霉素的藥效作用、應(yīng)用范圍、其它有關(guān)工藝技術(shù)及技術(shù)改造方向；熟悉青霉素的理化性質(zhì)、重要化學(xué)反應(yīng)；掌握青霉素生產(chǎn)原理、生產(chǎn)工藝過(guò)程及生產(chǎn)控制要點(diǎn)。第一節(jié)

概述認(rèn)識(shí)青霉素青霉素是一族抗生素的總稱(chēng)，它們是由不同的菌種或不同的培養(yǎng)條件所得的同一類(lèi)化學(xué)物質(zhì)，其共同化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：

青霉素本身是一種游離酸，能與堿金屬或堿土金屬及有機(jī)氨類(lèi)結(jié)合成鹽類(lèi)。青霉素游離酸易溶液于醇類(lèi)、酮類(lèi)、醚類(lèi)和酯類(lèi)，但在水溶液中溶解度很小；青霉素鉀、鈉鹽則易溶于水和甲醇、微溶于乙醇、丙醇、丙酮、乙醚、氯仿，在醋酸丁酯或戊酯中難溶或不溶。青霉素的吸濕性與內(nèi)在質(zhì)量有關(guān)。純度越高，吸濕性越小，也就易于存放。因此制成晶體就比無(wú)定形粉末吸濕性小。青霉素是一種不穩(wěn)定的化合物，在水溶液里很快地分解或異構(gòu)化，因此青霉素應(yīng)盡量縮短在水中存放時(shí)間，特別由于溫度、酸、堿性的影響，成為晶體狀態(tài)的青霉素還是比較穩(wěn)定的。青霉素對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，部分革蘭氏陰性細(xì)菌，各種螺旋體及部分放線菌有較強(qiáng)抗菌作用。青霉素的毒性低微，但最易引起過(guò)敏反應(yīng)。凡應(yīng)用青霉素藥物都必須先作皮試，皮試陽(yáng)性者禁用。第二節(jié)生產(chǎn)原理

青霉素是產(chǎn)黃青霉菌株在一定的培養(yǎng)條件下發(fā)酵產(chǎn)生的。生產(chǎn)上一般是將孢子懸液接入種子罐經(jīng)二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)后，移入發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，所制得的含有一定濃度青霉素的發(fā)酵液經(jīng)適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，再經(jīng)提煉、精制、成品分包裝等工序最終制得合乎藥典要求的成品。青霉素產(chǎn)生菌的培養(yǎng)菌體的生長(zhǎng)發(fā)育①分生孢子的Ⅰ期；②菌絲繁殖，原生質(zhì)嗜堿性很強(qiáng)，有類(lèi)脂肪小顆粒產(chǎn)生為Ⅱ期；③原生質(zhì)嗜堿性仍很強(qiáng)，形成脂肪粒，積累貯藏物為Ⅲ期；④原生質(zhì)嗜堿性很弱，脂肪粒減少，形成中、小空泡為Ⅳ期；⑤脂肪粒消失，形成大空泡為Ⅴ期；⑥細(xì)胞內(nèi)看不到顆粒，并有個(gè)別自溶細(xì)胞出現(xiàn)為Ⅵ期。其中Ⅰ～Ⅳ期稱(chēng)為菌絲生長(zhǎng)期，菌絲的濃度增加很多，但產(chǎn)生的青霉素較少，處于該時(shí)期的菌絲體適用于做發(fā)酵種子。Ⅳ～Ⅴ期是青霉素分泌期，此時(shí)菌絲體生長(zhǎng)緩慢，并大量生產(chǎn)青霉素。Ⅵ期是菌絲體自溶期。菌種的培養(yǎng)

利用菌體進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)青霉素的關(guān)鍵是要篩選高產(chǎn)菌種，另外要通過(guò)不斷地分離純化來(lái)保證高產(chǎn)菌種的純度，避免生產(chǎn)波動(dòng)。高產(chǎn)菌種選育和培養(yǎng)還要采用嚴(yán)格的無(wú)菌操作，防止污染雜菌。供日常生產(chǎn)的高產(chǎn)純種還必須用良好的方法妥善保藏，以維持其優(yōu)良性能，保證生產(chǎn)穩(wěn)定。種子培養(yǎng)階段以產(chǎn)生豐富的孢子（斜面和米孢子培養(yǎng)）或大量健狀菌絲體（種子罐培養(yǎng)）為主要目的。在培養(yǎng)基中應(yīng)加入比較豐富易代謝的碳源（如葡萄糖或蔗糖）、氮源（如玉米漿）、緩沖pH的碳酸鈣以及生長(zhǎng)所必需的無(wú)機(jī)鹽，并保持最適生長(zhǎng)溫度25～26℃和充分的通氣攪拌，使菌體量倍增達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。青霉素的生物合成

產(chǎn)黃青霉菌在發(fā)酵過(guò)程中首先合成其前體，即α-氨基己二酸、半胱氨酸、纈氨酸，再在三肽合成酶的催化下，L-α-氨基己二酸（α-AAA）與L-半胱氨酸形成二肽，然后再與L-纈氨酸形成三肽化合物，三肽化合物在環(huán)化酶的作用下閉環(huán)形成異青霉素N，異青霉素N中的α-AAA側(cè)鏈可以在?；D(zhuǎn)移酶作用下轉(zhuǎn)換成其它側(cè)鏈，形成青霉素類(lèi)抗生素。如果在發(fā)酵液中加入苯乙酸，就形成青霉素G。產(chǎn)黃青霉生產(chǎn)青霉素中受下列方式調(diào)控：受碳源調(diào)控、受氮源、受終產(chǎn)物調(diào)控、受分支途徑調(diào)控。發(fā)酵發(fā)酵的基本原理青霉素發(fā)酵屬于好氧發(fā)酵過(guò)程，需不斷通入無(wú)菌空氣并攪拌，以維持一定的罐壓和溶氧。整個(gè)發(fā)酵階段分為生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成兩個(gè)階段。發(fā)酵過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格控制發(fā)酵溫度、發(fā)酵液中殘?zhí)橇俊H值、排氣中的CO2和氧氣量等。一般殘?zhí)橇靠赏ㄟ^(guò)控制氮源的補(bǔ)加量來(lái)控制；pH值可通過(guò)控制補(bǔ)加的葡萄糖量、酸或堿量來(lái)調(diào)節(jié)；通過(guò)控制攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量來(lái)調(diào)節(jié)供氧量及液相中的氧含量；至于發(fā)酵溫度一般可通過(guò)調(diào)整冷卻介質(zhì)量來(lái)加以調(diào)節(jié)。還要加入消泡劑（如豆油、玉米油或環(huán)氧乙烯聚醚類(lèi)）以控制泡沫。在發(fā)酵期間為檢測(cè)生產(chǎn)是否染菌，每隔一定時(shí)間應(yīng)取樣進(jìn)行分析、鏡檢及無(wú)菌試驗(yàn)，檢測(cè)生產(chǎn)狀況，分析或控制相關(guān)參數(shù)。發(fā)酵過(guò)程經(jīng)濟(jì)指標(biāo)發(fā)酵單位即抗生素在發(fā)酵液中的濃度，一般用u/ml或μg/ml表示。u為抗菌活性單位，又稱(chēng)效價(jià)。青霉素效價(jià)單位：為能在50ml肉湯培養(yǎng)基中完全抑制金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株發(fā)育的最小青霉素劑量。發(fā)酵總億單位發(fā)酵單位與發(fā)酵液體積的乘積稱(chēng)為發(fā)酵總億單位，以億單位（108u）或十億單位（109u或Bu）表示。發(fā)酵總億單位代表批發(fā)酵產(chǎn)量。發(fā)酵指數(shù)發(fā)酵指數(shù)是每小時(shí)、每立方米發(fā)酵罐容積發(fā)酵產(chǎn)生的抗生素量。一般以108u/(m3·h)表示，能反映固定成本的效益，即發(fā)酵指數(shù)越高，固定成本效益也越高?；|(zhì)轉(zhuǎn)化率發(fā)酵過(guò)程消耗的主要基質(zhì)（一般為碳源、能源或其它成本較高的基質(zhì)）轉(zhuǎn)化為抗生素的得率，稱(chēng)為基質(zhì)轉(zhuǎn)化率，以g（抗生素）/g（基質(zhì)）或Bu/kg（基質(zhì)）表示。發(fā)酵液預(yù)處理和過(guò)濾

青霉素發(fā)酵液中雜質(zhì)很多，其中對(duì)青霉素提純影響最大的是高價(jià)無(wú)機(jī)離子（Ca2+、Mg2+、Fe3+）和蛋白質(zhì)。用離子交換法提純時(shí)，高價(jià)無(wú)機(jī)離子和蛋白質(zhì)的存在，會(huì)影響樹(shù)脂對(duì)抗生素的吸附量。用溶劑萃取時(shí)，蛋白質(zhì)的存在會(huì)產(chǎn)生乳化，使溶劑相和水相分層困難。因此，應(yīng)根據(jù)所采用的提純方法進(jìn)行預(yù)處理除去無(wú)機(jī)離子或蛋白質(zhì)。經(jīng)過(guò)預(yù)處理的發(fā)酵液便可進(jìn)行過(guò)濾去除菌絲體及沉淀的蛋白質(zhì)。青霉素發(fā)酵液過(guò)濾宜采用鼓式真空過(guò)濾機(jī)。青霉素的提取

青霉素發(fā)酵液經(jīng)過(guò)預(yù)處理和過(guò)濾后得到的濾液，濾液中含有不到4%的青霉素及一些與水親和的雜質(zhì)存在，因此需經(jīng)提取和精制加以去除。提取要達(dá)到提純和濃縮兩個(gè)目的。生產(chǎn)上采用的方法主要有：吸附法、溶媒萃取法、離子交換法和沉淀法。究竟采用哪一種方法，要視產(chǎn)品的性質(zhì)。青霉素的提取一般采用溶媒萃取法。這種方法主要基于青霉素游離酸易溶于有機(jī)溶劑，而青霉鹽易溶于水的特性，反復(fù)轉(zhuǎn)移而達(dá)到提純和濃縮。采用溶媒時(shí)要考慮對(duì)青霉素有較高的分配系數(shù)，另外在水中的溶解度要小，不和青霉素起作用，在5～30℃間的蒸汽壓較低，回收時(shí)溫度不超過(guò)120～140℃。生產(chǎn)上采用的溶媒主要是醋酸丁酯和戊酯。

青霉素在酸性條件下極易水解破壞，生成青霉素酸，但要使青霉素在萃取時(shí)轉(zhuǎn)入有機(jī)相，又一定要在酸性條件下。這一矛盾要求在萃取時(shí)選擇合理的pH及適當(dāng)濃度的酸化液。而從有機(jī)相轉(zhuǎn)入水相中時(shí)，由于青霉素在堿性較強(qiáng)的條件下極易堿解破壞，生成青霉噻唑酸，但要使青霉素在反萃取時(shí)轉(zhuǎn)入水相，又一定要在堿性條件下。這一矛盾要求在萃取時(shí)選擇合理的pH及適當(dāng)濃度的堿性緩沖液。

多級(jí)逆流萃取有助于提高青霉素的收得率。生產(chǎn)上一般采用二級(jí)逆流萃取。濃縮比選擇很重要，如果丁酯用量太多，雖然萃取較完全，收率高，但達(dá)不到結(jié)晶濃度要求，反而增加溶媒的用量；如果丁酯用量太少，則萃取不完全，影響收率。發(fā)酵濾液與丁酯的體積比一般為1.5～2：1。從丁酯相反萃取時(shí)為避免pH波動(dòng)，常用緩沖液?？捎昧姿猁}緩沖液、碳酸氫鈉或碳酸鈉溶液等。反萃取時(shí)，因分配系數(shù)之值較大，濃縮倍數(shù)可以較高，一般3～4倍。在一次萃取丁酯中，由于濾液中有大量蛋白質(zhì)等表面活性物質(zhì)存在，易發(fā)生乳化，這時(shí)可加入去乳化劑。通常用PPB，加入量為0.05%～0.1%。

青霉素的精制及烘干

對(duì)產(chǎn)品精制、烘干和包裝的階段要符合GMP的規(guī)定。精制包括脫色和去熱原質(zhì)、結(jié)晶和重結(jié)晶等。重結(jié)晶可制備高純度成品。熱原質(zhì)是多糖磷類(lèi)脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的結(jié)合體，為大分子有機(jī)物質(zhì)，能溶于水，在120℃加熱4小時(shí)，它能被破壞90%；180～200℃加熱半小時(shí)或150℃加熱2小時(shí)能徹底被破壞。它也能被強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化劑等所破壞，它能通過(guò)一般過(guò)濾器，但能被活性炭、石棉濾板等吸附。青霉素的生產(chǎn)中常用活性炭脫色去除熱原質(zhì)，青霉素的生產(chǎn)中一般采用結(jié)晶及洗滌法進(jìn)行精制。

（1）青霉素普魯卡因鹽普魯卡因青霉素G在水中和乙酸丁酯中溶解度都很小，因此，可以在青霉素鹽的水溶液中，加鹽酸普魯卡因或在青霉素游離酸的丁酯萃取液中加普魯卡因堿的丁酯溶液而制得。反應(yīng)如下：

（2）青霉素鉀鹽

①醋酸鉀-乙醇溶液飽和鹽析結(jié)晶

青霉素鉀鹽在醋酸丁酯中溶解度很小，因此，在二次丁酯萃取液中加入醋酯鉀—乙醇溶液，使青霉素游離酸與高濃度醋酸鉀溶液反應(yīng)生成青霉素鉀，然后溶解于過(guò)量的醋酸鉀乙醇溶液中呈濃縮液狀態(tài)存在于結(jié)晶液中，當(dāng)醋酸鉀加到一定量時(shí)，近飽和狀態(tài)的醋酸鉀又起到鹽析作用，使青霉素鉀鹽結(jié)晶析出，反應(yīng)如下：

②青霉素醋酸丁酯提取液減壓共沸結(jié)晶與飽和鹽析結(jié)晶法一樣也是由青霉素游離酸與醋酸鉀反應(yīng)，生成青霉素鉀。所不同的是控制結(jié)晶前提取液的初始水分，使反應(yīng)劑加入后，不能像飽和鹽析結(jié)晶那樣立即產(chǎn)生晶體，而是使反應(yīng)生成的青霉素鉀先溶于反應(yīng)液的水組份中，而后隨著減壓共沸蒸餾脫水的進(jìn)行，使反應(yīng)液中水分不斷降低，形成過(guò)飽和溶液，晶核產(chǎn)生并逐漸成長(zhǎng)并在反應(yīng)液中析出，得到青霉素鉀。

③青霉素水溶液-丁醇減壓共沸結(jié)晶將青霉素游離酸的醋酸丁酯提取液用堿（碳酸氫鉀或氫氧化鉀）水溶液抽提至水相中，形成青霉素鉀鹽水溶液，調(diào)節(jié)pH后加入丁醇進(jìn)行減壓共沸蒸餾。蒸餾是利用丁醇—水二組份能夠形成共沸物，使溶液沸點(diǎn)下降，且二組份在較寬的液相組成范圍內(nèi)，蒸餾溫度穩(wěn)定等特點(diǎn)。進(jìn)行減壓共沸蒸餾是為了進(jìn)一步降低溶液沸點(diǎn)，減少對(duì)青霉素鉀鹽的破壞。在共沸蒸餾過(guò)程中以補(bǔ)加丁醇的方法將水分分離，使溶液逐步達(dá)到過(guò)飽和狀態(tài)而結(jié)晶析出。

（3）青霉素鈉鹽青霉素的鈉鹽生產(chǎn)方法有多種，現(xiàn)舉例如下：①?gòu)亩味□ポ腿∫褐苯咏Y(jié)晶在二次丁酯萃取液中加醋酸鈉—乙醇溶液反應(yīng)，直接結(jié)晶得鈉鹽。②從鉀鹽轉(zhuǎn)鈉鹽在二次丁酯中先結(jié)晶出鉀鹽，然后將鉀鹽溶于水，再加酸將青霉素提取至丁酯中，加醋酸鈉—乙醇溶液結(jié)晶出鈉鹽。③從普魯卡因鹽轉(zhuǎn)鈉鹽一次丁酯萃取液加普魯卡因丁酯溶液反應(yīng)，結(jié)晶出青霉素普魯卡因鹽。然后將此鹽懸浮于水中，加丁酯再以硫酸調(diào)pH至2.0，則普魯卡因鹽分解成青霉素游離酸而轉(zhuǎn)入丁酯中，加醋酸鈉—乙醇溶液結(jié)晶出鈉鹽。④青霉素水溶液—丁醇減壓共沸結(jié)晶同該法青霉素鉀鹽的生產(chǎn)，只是在水溶液抽提時(shí)用碳酸氫鈉或氫氧化鈉。成品的檢驗(yàn)及分包裝

青霉素是臨床應(yīng)用藥物，使用對(duì)象是人，因此要特別注意藥品的質(zhì)量。純品得到后應(yīng)通過(guò)全面嚴(yán)格檢驗(yàn)才能出廠，檢驗(yàn)的項(xiàng)目和標(biāo)準(zhǔn)一律按藥典規(guī)定?？股匾话阋鬅o(wú)菌，特別是注射劑更應(yīng)滿足嚴(yán)格無(wú)菌要求。因此，成品分包裝必須在無(wú)菌或半無(wú)菌的場(chǎng)所進(jìn)行。注射劑則應(yīng)在無(wú)菌條件下用自動(dòng)分裝機(jī)械分裝。藥品分包裝車(chē)間的整個(gè)生產(chǎn)流程必須納入GMP管理標(biāo)準(zhǔn)，以確保藥品質(zhì)量。第三節(jié)

青霉素生產(chǎn)工藝過(guò)程青霉素的發(fā)酵工藝過(guò)程工藝流程（1）絲狀菌三級(jí)發(fā)酵工藝流程（2）球狀菌三級(jí)發(fā)酵工藝流程工藝控制（1）影響發(fā)酵產(chǎn)率的因素基質(zhì)濃度、溫度、pH值、溶氧、菌絲濃度、菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲形態(tài)（2）工藝控制要點(diǎn)①種子質(zhì)量的控制②培養(yǎng)基成份的控制③發(fā)酵培養(yǎng)的控制加糖控制、補(bǔ)氮及加前體、值控制、溫度控制、溶解氧的控制、泡沫的控制、發(fā)酵液質(zhì)量控制青霉素的提取和精制工藝過(guò)程工藝流程

（1）工業(yè)鉀鹽生產(chǎn)工藝流程

（2）注射用鉀鹽生產(chǎn)工藝流程

（3）工業(yè)鈉鹽生產(chǎn)工藝流程

（4）普魯卡因青霉素工藝流程（接下頁(yè)）工藝控制

青霉素性質(zhì)不穩(wěn)定，在發(fā)酵液預(yù)處理、提取和精制過(guò)程應(yīng)注意條件溫和、速度快、以防止青霉素破壞。預(yù)處理及過(guò)濾、提取過(guò)程是青霉素各產(chǎn)品生產(chǎn)的共性部分，其工藝控制基本相同，只是精制過(guò)程有所差別。青霉素普魯卡因鹽的結(jié)晶控制結(jié)晶過(guò)程中應(yīng)注意控制晶體大小、形態(tài)、純度等。主要采取控制如下條件：晶種、溫度、鹽酸普魯卡因水溶液的加入速度、結(jié)晶液質(zhì)量控制（控制好青霉素鈉鹽結(jié)晶水溶液的質(zhì)量：pH值、濃度、色澤、溫度、丁酯含量等）。

醋酸鉀-乙醇溶液飽和鹽析鉀鹽的結(jié)晶控制在結(jié)晶過(guò)程中溶液中的水分、酸度和溫度、污染數(shù)高低、青霉素與醋酸鉀的配比對(duì)青霉素鉀鹽的溶解度有很大影響，因而應(yīng)控制好。第四節(jié)

其他工藝技術(shù)及技術(shù)改造方向現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用

現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用：如固定化酶技術(shù)、膜分離技術(shù)、基因重組技術(shù)等的應(yīng)用。特別是用現(xiàn)代生物技術(shù)對(duì)抗生素生產(chǎn)菌進(jìn)行改良，如利用突變生物合成技術(shù)、雜交生物合成技術(shù)、細(xì)胞融合技術(shù)及基因重組技術(shù)等手段來(lái)