吉林大學(xué)生物基礎(chǔ)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心

·1·T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)于彬E-mail：yubin@淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，受到刺激物的刺激后可表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大、代謝旺盛、蛋白質(zhì)和核酸合成增加，即向淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖。此現(xiàn)象稱為淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化現(xiàn)象（簡(jiǎn)稱為淋轉(zhuǎn)）。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的高低可以反映機(jī)體的免疫水平，因此可作為測(cè)定機(jī)體免疫功能的指標(biāo)之一。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化概念·3·檢查患者細(xì)胞免疫功能估計(jì)疾病的療效及預(yù)后細(xì)胞配型抗原的檢查：移植免疫免疫藥理學(xué)：具有免疫調(diào)節(jié)的藥物、保健品、中草藥及生物制品衛(wèi)生毒理學(xué)的研究淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用·4·實(shí)驗(yàn)分組及材料實(shí)驗(yàn)原理主要操作步驟檢測(cè)方法實(shí)驗(yàn)主要內(nèi)容·5·實(shí)驗(yàn)分組及材料器材75%酒精 若干無(wú)菌紗網(wǎng) 1塊/組無(wú)菌平皿 1塊/組無(wú)菌96孔培養(yǎng)板 1塊/組細(xì)胞計(jì)數(shù)板 1套/組顯微鏡 1臺(tái)/組可調(diào)微量加樣器 1套/4人無(wú)菌吸頭（大、中、?。?套/4人EP管 25個(gè)/4人眼科剪、小鑷子 1飯盒/4人5ml注射器1個(gè)/組100ml燒杯1個(gè)/組細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃5%CO2)酶標(biāo)儀1臺(tái)離心機(jī) 2個(gè)/room超凈臺(tái) 2個(gè)/room分組：每組4人

動(dòng)物及試劑小鼠1只/組培養(yǎng)液(1640)無(wú)FCS10ml/組

培養(yǎng)液(1640)10%FCS10ml/組

50ml滅菌離心筒1個(gè)/組ConA(200ug/ml)200ul/組MTT（5mg/ml)

0.7ml/組濾紙一塊二甲亞砜（DMSO) 3ml/組·6·Lymphocytes(B/T)mitogensSpecificityAgProliferationtransformationlymphoblastNucleic

Acid↑Protein↑T細(xì)胞、B細(xì)胞表面具有識(shí)別抗原的受體和有絲分裂原受體，在特異性抗原刺激下可使相應(yīng)淋巴細(xì)胞克隆發(fā)生增殖。原理·7·有絲分裂原（mitogen）來(lái)自植物蛋白或細(xì)菌產(chǎn)物，它能與多種細(xì)胞膜糖類及寡糖基分子結(jié)合，后者為絲分裂原受體、結(jié)合后能促使細(xì)胞活化和誘導(dǎo)細(xì)胞分裂。T和B細(xì)胞表面都有絲裂原受體，在體外可非特異性刺激靜止淋巴細(xì)胞向淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化。這種轉(zhuǎn)化細(xì)胞DNA合成增加，出現(xiàn)細(xì)胞體積增大，胞漿增多，嗜堿性以及產(chǎn)生有絲分裂等形態(tài)變化。有絲分裂原·8·Tcellproliferation植物血凝素（phytohemagglutinin,PHA)(人T）刀豆素A（concanavalin,ConA）（鼠T）美洲商陸（pokeweedmitogen,PWM)B

cellproliferation脂多糖（lipopolysaccharide,LPS)(鼠B）金黃色葡萄球菌A蛋白（staphylococcalproteinA,SPA)（人B）美洲商陸（pokeweedmitogen,PWM)常用的絲裂原·9·形態(tài)學(xué)觀察法3H-TdR（3H-胸腺嘧啶核苷）摻入法MTT法(四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法）本次實(shí)驗(yàn)采用MTT法常用的檢測(cè)方法·10·淋巴母細(xì)胞主要表現(xiàn)有體積明顯增大，是成熟淋巴細(xì)胞的3~4倍；染色質(zhì)疏松，核仁清晰可見(jiàn)；胞漿豐富并形成空泡。根據(jù)細(xì)胞的大小，核與胞漿的比例，胞漿的染色性和核結(jié)構(gòu)以及有無(wú)核仁等特征，分別計(jì)數(shù)淋巴母細(xì)胞、過(guò)渡型母細(xì)胞和核絲分裂相細(xì)胞以及成熟的小淋巴細(xì)胞，以前三者為轉(zhuǎn)化細(xì)胞，每份標(biāo)本計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，按下式計(jì)算轉(zhuǎn)化率：

形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法·11·G0G1有絲分裂原特異性抗原SPr,RNA,DNA前體物質(zhì)DNA↑↑NewDNA3H-TdRTdR3H-TdRcpm3H-TdR摻入法·12·T細(xì)胞在PHA或ConA刺激下轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，同時(shí)DNA和RNA合成明顯增加，此時(shí)將同位素3H標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR），加入培養(yǎng)液內(nèi)，則被作為DNA原料攝入到轉(zhuǎn)化的細(xì)胞內(nèi)，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)摻入DNA中的3H-TdR的放射性相對(duì)數(shù)量（以脈沖數(shù)cpm表示）可用來(lái)表示轉(zhuǎn)化率的高低。測(cè)定低能量3H的放射性需用液體閃爍計(jì)數(shù)器。3H-TdR摻入法·13·活/增殖期的細(xì)胞線粒體能量代謝琥珀酸脫氫酶MTTMTT摻入還原甲臢顆粒formazan細(xì)胞內(nèi)/周圍溶解測(cè)OD490值MTT法DMSO·14·MTT法即四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法。MTT是一種噻唑鹽，化學(xué)名3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑，水溶液為黃橙色。小鼠脾細(xì)胞受到ConA作用后發(fā)生增殖活化，其胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶活性相應(yīng)升高，MTT作為其底物參與反應(yīng)，形成藍(lán)色的甲臜（Formazan）顆粒沉積于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周圍，用二甲亞砜(DMSO)溶解所生成的甲臜顆粒，其生成量與細(xì)胞數(shù)目和/或細(xì)胞活性呈正相關(guān)，通過(guò)檢測(cè)490nm處光密度值變化，可間接反映細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖活性。MTT法·15·第一天殺鼠取脾搗碎獲得細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞稀釋（1×107）上樣（100ul/孔）ConA的梯度稀釋上樣（100ul/孔）將96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱，做好標(biāo)記，5%CO237℃培養(yǎng)48小時(shí)第三天取出96孔板加入MTT(5mg/ml)20ul/孔5%CO237℃，繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)。2000rpm，離心10min。小心棄去上清，加入100ul/孔DMSO振蕩，使顆粒全部溶解。酶標(biāo)儀測(cè)吸光度值：OD490nm結(jié)果判定：SI=ConA孔OD值/對(duì)照孔OD值實(shí)驗(yàn)步驟·16·1W無(wú)菌取脾研磨成單細(xì)胞懸液+1640（無(wú)FBS)細(xì)胞計(jì)數(shù)【?/ml】取20ul細(xì)胞+980ul的1640混勻后取出20ul細(xì)胞+20ul臺(tái)盼藍(lán)加板(三復(fù)孔)(加法見(jiàn)附圖)調(diào)細(xì)胞濃度1×107個(gè)/ml5%CO237℃培養(yǎng)48小時(shí)培養(yǎng)終止前2小時(shí)加入MTT(5mg/ml)20ul/孔5%CO237℃繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)2000rpm10min小心棄去上清，加入100ul/孔DMSO振蕩，使顆粒全部溶解酶標(biāo)儀測(cè)吸光度值：OD490nm結(jié)果判定：SI=ConA孔OD值/對(duì)照孔OD值實(shí)驗(yàn)流程·17·單細(xì)胞懸液的制備小鼠脫臼處死，75%酒精浸泡消毒2-3分鐘。于超凈臺(tái)內(nèi)取出脾組織，放入預(yù)先盛有5ml無(wú)血清1640培養(yǎng)液的平皿內(nèi)。用紗網(wǎng)包裹住脾組織，將脾剪成小塊，用5ml注射器塞輕壓使脾細(xì)胞透過(guò)紗網(wǎng)。然后用1000ul加樣器隔著紗布將脾細(xì)胞懸液吸出，放入50ml無(wú)菌離心管中，再分別用1ml培養(yǎng)液沖洗紗網(wǎng)和平皿，并將細(xì)胞懸液吸出，放入同一50ml離心管中，剩余3ml培養(yǎng)液備用。2000rpm，常溫離心6分鐘，棄上清，加3ml含血清1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)取上述制備好的細(xì)胞懸液混勻后取出20ul，加到盛有980ul計(jì)數(shù)液的EP管中，混勻后取出20ul到一個(gè)新的EP管中，再向其中加入20ul臺(tái)盼藍(lán)染料，混勻后取20ul計(jì)入到細(xì)胞計(jì)數(shù)版上，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)方法見(jiàn)后。用含血清1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度至1×107/ml，每組所需總量為4ml（此步可使用之前裝無(wú)血清培養(yǎng)液的離心管）。詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟·18·細(xì)胞計(jì)數(shù)板查出四個(gè)大方格（16個(gè)小方格/大格）的總細(xì)胞數(shù)(X)；算出每個(gè)大方格的細(xì)胞數(shù)：A=X/4每個(gè)大方格的體積為：V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml制備的細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度（/ml)=A×104×稀釋倍數(shù)(100)4·19·細(xì)胞培養(yǎng)按圖所示加板。將板做好標(biāo)記，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，然后放于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48小時(shí)。MTT摻入：在終止培養(yǎng)前2小時(shí)，在顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況。每孔內(nèi)加入MTT（5mg/ml)20ul，加完后輕輕搕板，使MTT和細(xì)胞混勻。在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，取出板，觀察顏色變化，然后離心2000rpm，10min，輕輕吸去上清，注意不要將孔底部的顆粒物吸出）觀察板底是否有藍(lán)色的顆粒。加入100ul二甲亞砜（DMSO)，輕輕晃板，將顆粒完全溶解。結(jié)果測(cè)定：結(jié)果測(cè)量：用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm處光密度值（OD490nm），記錄結(jié)果。結(jié)果判定：SI（刺激指數(shù)）=ConA刺激孔值/對(duì)照孔值詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟·20·100μL

ConA200ug/mlConA的倍比稀釋400μL含10%血清的1640400μL400μL400μL400μL400μL400μL1234567900μL含血清的1640201052.51.250.6250.3130.157ug/ml0400μL含10%血清的1640·21·12354760111每個(gè)樣品設(shè)置三復(fù)孔

100ulspleen

Cell+100ul

ConA20ug/ml100ulspleencell+100ulConA10ug/ml100ulspleenCell+100ulConA5ug/ml100ulspleenCell+100ulConA2.5ug/ml100ulspleenCell+100ulConA1.25ug/ml100ulspleenCell+100ulConA0.625ug/ml100ulspleenCell+100ulConA0.313ug/ml100ulspleen

Cell+100ul10%1640“0”