植物器官培養(yǎng)講課資料

2024/9/261第四章植物器官培養(yǎng)第一節(jié)概述

第二節(jié)營養(yǎng)器官培養(yǎng)第三節(jié)繁殖器官培養(yǎng)

2024/9/262植物器官培養(yǎng)（OrganCulture）是指對(duì)植物某一器官的全部、部分或器官原基進(jìn)行離體培養(yǎng)的技術(shù)。分為營養(yǎng)器官（根、莖、葉）和繁殖器官（胚胎、種子、花器官）培養(yǎng)。第一節(jié)概述

外植體形態(tài)發(fā)生形成完整植株的途徑（一）外植體-愈傷組織-完整植株。具體又可分為三種：1、愈傷組織-同時(shí)長芽和根-植株。2、愈傷組織-莖-根-植株。3、愈傷組織-根-芽-植株。4、愈傷組織-體細(xì)胞胚-植株第二節(jié)營養(yǎng)器官培養(yǎng)2024/9/266一、離體根的培養(yǎng)二、莖尖的培養(yǎng)*三、莖段的培養(yǎng)四、離體葉的培養(yǎng)*一、離體根的培養(yǎng)

（一）意義：①生理代謝研究的優(yōu)良實(shí)驗(yàn)體系②研究器官分化形態(tài)建成的良好體系③建立快速生長的根無性系④進(jìn)行誘變育種2024/9/2671.培養(yǎng)基選擇

White培養(yǎng)基；2/3或1/2MS和B5培養(yǎng)基注：離體根生長要求提供全部必需元素，蔗糖、硝態(tài)氮效果好，加入VB1、VB6最重要，生長素對(duì)離體根影響不一致。培養(yǎng)溫度25－27℃，暗光培養(yǎng)。2024/9/268（二）培養(yǎng)方法離體根生長的營養(yǎng)要求1、無機(jī)成分要求培養(yǎng)基中有全部必要元素，因?yàn)樗请x體生長所需要的，一般的為MS、B5培養(yǎng)基。2、氮源氮源有銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和可溶性有機(jī)氮如氨基酸或酰胺等，其中以硝態(tài)氮的效果最好。加入含各種氨基酸的水解酪蛋白，能促進(jìn)離體根的生長。3、碳源以蔗糖的效果最佳，幾乎為葡萄糖的10倍。蔗糖的濃度為2—3%。4、維生素維生素以B1和B6最為重要，缺少它根的生長受到阻礙，而加入它可使根的生長成倍的加快。B1的使用濃度為0.1-1.0mg/L為宜。5、生長物質(zhì)對(duì)離體根的生長而言，生長素的效應(yīng)最為明顯，在一般情況，加入適量的生長素能促進(jìn)根的生長，其反應(yīng)和需要量因植物種而異：6、溫度和光照黑暗有利于根的形成，溫度一般在16-25℃7、PH根發(fā)生和生長所需的PH范圍一般為5.0-6.02.無性繁殖系的建立

種子消毒→→接種→→待根伸長后從根尖一端切取長1.2cm的根尖→→接種于培養(yǎng)基→→發(fā)育出側(cè)根→→待側(cè)根生長約1周后切取側(cè)根的根尖進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)→→又迅速生長并長出側(cè)根→→切下進(jìn)行培養(yǎng)，如此反復(fù)→→得到從單個(gè)根尖衍生而來的離體根的無性系。

3.培養(yǎng)條件

暗光和溫度25-27℃。2024/9/26114、根的間接增殖第一步在脫分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成愈傷組織，如胡楊的根段培養(yǎng)，可誘導(dǎo)形成白色愈傷組織。第二步在再分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成芽的分化，如胡楊從綠色愈傷組織分化出小植株。一、離體根的培養(yǎng)

胡蘿卜根培養(yǎng)5、培養(yǎng)方式離體根的培養(yǎng)方式有三種類型。第一種固體培養(yǎng)法，即將根尖接種在固體培養(yǎng)基上，根依靠培養(yǎng)基中的養(yǎng)分和生長物質(zhì)而不斷生長。第二種是液體培養(yǎng)法，把根尖接種在無瓊脂的液體培養(yǎng)基中，經(jīng)常振蕩使根獲得充足的氧氣。第三種是固體-液體培養(yǎng)法，就是把根基部插入固體瓊脂培養(yǎng)基中，根尖浸在液體培養(yǎng)基中，根尖生長而根不斷的伸長和分枝。2024/9/2615二、莖尖的培養(yǎng)*（一）莖尖培養(yǎng)概念及類型（二）病毒在植物體內(nèi)的分布（三）莖尖培養(yǎng)方法及步驟

(一)莖尖培養(yǎng)概念及類型

莖尖培養(yǎng)：切取莖的先端部分或莖尖分生組織部分，進(jìn)行無菌培養(yǎng)。莖尖培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)目的和取材大小可分為：

①微莖尖培養(yǎng):帶有1-2個(gè)葉原基的生長點(diǎn),其長度不超過0.5mm。

2024/9/2616②普通莖尖培養(yǎng)：較大的莖尖(如幾mm到幾十mm)、芽尖及側(cè)芽。這里主要講普通莖尖培養(yǎng)。這種培養(yǎng)技術(shù)簡單，操作方便，莖尖容易成活，成苗所需時(shí)間短。莖尖培養(yǎng)的意義：普通莖尖培養(yǎng)技術(shù)簡單，操作方便，易成活，成苗時(shí)間短，加快繁殖。微莖尖培養(yǎng)可獲得脫毒苗；2024/9/2617病毒侵染植株的葉片后，經(jīng)過一段時(shí)間，即向附近的細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移速度很慢，每小時(shí)只有幾微米。當(dāng)葉片內(nèi)病毒濃度增大到一定量時(shí)，就轉(zhuǎn)移到韌皮部，隨后通過維管束轉(zhuǎn)移到其它部分。由于病毒轉(zhuǎn)移速度慢，加上莖尖分生組織無維管束，病毒只能通過胞間連絲傳遞，趕不上細(xì)胞分裂和生長的速度，所以生長點(diǎn)的病毒數(shù)量極少，幾乎檢測不出。莖尖培養(yǎng)時(shí)，切取的莖尖越小，帶病毒的可能性就越小?！o尖脫毒的基本原理

(二)病毒在植物體內(nèi)的分布（三）莖尖培養(yǎng)方法及步驟2024/9/2620取材材料處理及消毒培養(yǎng)接種馴化移栽①直接取材：在生長旺盛、枝條健壯、無病的母株上選生長不久、雜菌污染少的頂梢（1－2cm）（取前可噴殺菌藥，可頂芽或側(cè)芽）。②從試管苗獲取。2024/9/26211、取材取1-2㎝頂梢2024/9/26222、材料處理及消毒

將采集到的莖尖切成0.5-1.0cm長→→去葉（休眠芽預(yù)先剝除鱗片）→→流水沖洗2-4h→→75％的酒精中處理30s→→稀釋20倍的次氯酸鈉中浸5-8min(取自老枝條上的可適當(dāng)延長時(shí)間）→→用無菌水沖洗數(shù)次，準(zhǔn)備接種。

3、接種

接種前再剝掉一些葉片，使莖尖0.5cm→→接種要求：隨切隨接，動(dòng)作迅速。亦可將切下莖尖材料在1－5%VC液中浸一下。2024/9/26234、培養(yǎng)的方法和程序（1）培養(yǎng)基①基本培養(yǎng)基MS、White、B5、

Heller培養(yǎng)基。

②蔗糖作碳源效果好，濃度2－3%。③激素（2，4-D，IAA，NAA）和有機(jī)添加物有明顯影響。但激素濃度以0.1mg/L為宜，不要太高。2024/9/2624生長太慢：莖尖不增大→→變綠→→細(xì)胞逐漸老化→→休眠原因:生長素濃度太低；溫度過低或過高；生長太快：莖尖迅速增大→→愈傷組織→→喪失成苗能力原因:生長素濃度過高；光照太弱或溫度太高；生長正常：莖尖基部稍增大并形成少量愈傷組織，莖尖顏色逐漸變綠，并伸長，葉原基發(fā)育成可見的小葉，進(jìn)而形成小苗。2024/9/2625莖尖生長狀態(tài)（2）初代培養(yǎng)條件

每天光照16h，光強(qiáng)度1500-30001x，

溫度25±2℃

2024/9/2626（3）繼代培養(yǎng)

莖尖長成的新梢→→切成小段→→增殖培養(yǎng)基中→→1個(gè)月左右→→新梢又可切成小段→→再轉(zhuǎn)入新培養(yǎng)基→→建立和維持了莖尖無性系。（即微型扦插）

繼代培養(yǎng)可用MS培養(yǎng)基。2024/9/2627

（4）誘導(dǎo)生根

采用1／2MS培養(yǎng)基

加入一定的生長素類調(diào)節(jié)物質(zhì)，如NAA、IBA等。新梢基部浸入50或100mg/l的IBA溶液處理4-8h，然后轉(zhuǎn)移到無激素的生根培養(yǎng)基中。2024/9/2628(5)馴化移栽入土

在生根培養(yǎng)1個(gè)月左右→→生長健壯而發(fā)達(dá)的根系→→煉苗→→移栽→→管理（溫、光、濕、氣）2024/9/2629

指不帶芽和帶一個(gè)以上定芽或不定芽（包括塊莖、球莖在內(nèi)）的幼莖切段的無菌培養(yǎng)。

2024/9/2630三、莖段培養(yǎng)莖段培養(yǎng)用于快速繁殖的優(yōu)點(diǎn)培養(yǎng)技術(shù)簡單易行，繁殖速度較快，每年可增殖105-1012株苗；加速良種和珍貴植物的繁殖，芽生芽方式增殖的苗木質(zhì)量好，且無病，性狀均一；解決不能用種子繁殖的無性繁殖植物的快速繁殖的問題，且可節(jié)省種株；試管苗便于運(yùn)輸和防止種苗帶菌傳播，有利于國際種質(zhì)交流；試管苗可用于保存某些難以用種子保存的種質(zhì)資源。

（一）定義：

離體葉培養(yǎng)指包括葉原基、葉柄、葉鞘、葉片、子葉在內(nèi)的葉組織的無菌培養(yǎng)。它大多經(jīng)脫分化形成愈傷組織，再由愈傷組織分化出芽和根。其中葉片培養(yǎng)是一個(gè)典型的代表。

2024/9/2632四、離體葉的培養(yǎng)*（二）意義：

1.是繁殖稀有名貴品種的有效手段；

2.可用于研究形態(tài)建成、光合作用、葉綠素形成等理論問題。2024/9/2633（三）葉片的離體培養(yǎng)方法

發(fā)育方式：葉片培養(yǎng)再生成完整植株有兩種方式：①是直接誘導(dǎo)形成芽和根→→完整植株；

②是先誘導(dǎo)形成愈傷組織，再經(jīng)愈傷組織分化形成芽和根→→完整植株。其中，以第二種方式最為常見。2024/9/2634葉片離體培養(yǎng)發(fā)育方式（成苗途徑）2024/9/2635葉原基葉鞘葉片子葉葉柄愈傷組織芽和根試管苗

不定芽

1.材料選擇及滅菌

取植物的幼嫩葉片，切割成適當(dāng)大?。?—3cm），在流水中沖洗干凈。再用75％酒精浸泡約10s→→飽和漂白粉液中浸3-15min，或在0.1％升汞中浸3-5min→→無菌水沖洗數(shù)次→→無菌的干濾紙上吸干水分→→接種。注：細(xì)嫩與成熟葉片消毒時(shí)間不同2024/9/26362.接種

外植體大?。?.5cm2薄片（葉柄、子葉）上表皮朝上接種培養(yǎng)基。最好帶葉脈，注意極性2024/9/26373.培養(yǎng)

（1）培養(yǎng)基：

MS、B5、White、N6；蔗糖3%；2.4－D利于愈傷組織形成，NAA抑制芽形成，利于根發(fā)生，KT、6-BA利于芽形成。愈傷組織誘導(dǎo)：BA1-3mg/L,NAA0.25-1mg/L；

分化培養(yǎng)：CTK2mg/L；

生根培養(yǎng)：NAA0.5－1.0mg/L2024/9/2638(2)培養(yǎng)過程：

培養(yǎng)約2周至4周→→形成愈傷組織→→再分化培養(yǎng)基上（附加6-BA2mg／L）進(jìn)行分化培養(yǎng)→→約10d左右，愈傷組織開始轉(zhuǎn)綠出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)→→發(fā)育成無根苗→→生根培養(yǎng)基（附加NAA0.5-lmg/L）→→發(fā)育形成完整植株。2024/9/2639(3)培養(yǎng)條件：

溫度：25±2℃

光照時(shí)間：10-12h，光照強(qiáng)度：1500-3000Lx。2024/9/2640

葉的培養(yǎng)比胚，莖尖和莖段培養(yǎng)難度大。首先要選用易培養(yǎng)成功的葉組織，如幼葉比成熟葉易培養(yǎng)，子葉比葉片易培養(yǎng)。其次要添加適當(dāng)?shù)纳L素和細(xì)胞分裂素，保證利于葉組織的脫分化和再分化。2024/9/2641第三節(jié)生殖器官的培養(yǎng)2024/9/2642一、花器官的培養(yǎng)二、種子的培養(yǎng)三、胚胎的培養(yǎng)*2024/9/2643一、花器官的培養(yǎng)1.定義：花器官培養(yǎng)指整個(gè)花器及其組成部分如花托、花瓣、花絲、花柄、子房、花藥等的無菌培養(yǎng)。

2024/9/2644一、花器官的培養(yǎng)（花蕾）2、意義：

通過離體花芽培養(yǎng)可了解整體植物和內(nèi)源激素在花芽性別決定中所起的作用可以了解花器各部分對(duì)果實(shí)和種子發(fā)育的作用內(nèi)、外源激素在果實(shí)種子發(fā)育過程中的調(diào)控作用生產(chǎn)上也可用于珍貴品種的擴(kuò)大繁殖。2024/9/26452024/9/2646二、種子培養(yǎng)2024/9/2647定義：

種子培養(yǎng)是指受精后發(fā)育完全的成熟種子和發(fā)育不完全的未成熟種子的無菌培養(yǎng)。2.意義：可以打破種子休眠，促進(jìn)萌發(fā)；通過胚胎拯救解決遠(yuǎn)緣雜種敗育性，產(chǎn)生后代；快速繁殖苗木優(yōu)點(diǎn)：植株分化容易，無菌操作方便2024/9/2648

定義：植物胚胎培養(yǎng)是指對(duì)植物的胚(幼胚、成熟胚)、子房、胚珠和胚乳進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其發(fā)育成完整植株的技術(shù)。2024/9/2649三、胚胎的培養(yǎng)*胚胎培養(yǎng)已有近百年的歷史：1904年的Haning最早成功地培養(yǎng)了蘿卜和辣椒的胚，并萌發(fā)形成小苗。30年代成功地把蘭科植物的胚培養(yǎng)成小植株。40年代在蘋果、桃、柑桔、梨、葡萄、山楂、馬鈴薯、甘藍(lán)與大白菜的種間雜種的胚胎培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)及子房與胚珠培養(yǎng)均取得了不同程度的進(jìn)展2024/9/2650（一）胚胎培養(yǎng)的意義克服遠(yuǎn)緣雜種的不育性；使胚發(fā)育不全的植物獲得后代；縮短育種年限；研究與胚發(fā)育有關(guān)的內(nèi)外因素。2024/9/2651（二）離體胚培養(yǎng)

離體胚培養(yǎng)包括胚胎發(fā)生過程中不同發(fā)育期的胚，一般可分為成熟胚和幼胚培養(yǎng)。2024/9/26521.成熟胚培養(yǎng)

指子葉期后至發(fā)育完全的胚。培養(yǎng)較易成功，在含有大量無機(jī)元素和糖的基本培養(yǎng)基上，就能正常生長成幼苗。將成熟或未成熟種子用70％酒精進(jìn)行幾秒鐘的表面消毒→無菌水沖洗3-4次→無菌條件下進(jìn)行解剖，取出胚并接種在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上培養(yǎng)。2024/9/2653

培養(yǎng)基：WhiteTukeyMS無機(jī)鹽+糖(1-2%)+生長輔助物質(zhì)(激素、AA、活性炭、維生素等)2024/9/2654幼胚是指子葉期以前的幼小胚。由于幼胚培養(yǎng)在遠(yuǎn)緣雜交育種上有極大的利用價(jià)值，其研究應(yīng)用越來越深入廣泛。幼胚培養(yǎng)技術(shù)：心形期胚或更早期的胚（長度僅0.1～0.2mm）胚越小就越難培養(yǎng),幼胚培養(yǎng)成功的有大麥、薺菜、甘蔗、甜菜、胡蘿卜等

2024/9/2655

2.幼胚（未成熟胚）培養(yǎng)：（1）未成熟胚胎的培養(yǎng)有三種不同的發(fā)育方式：a.繼續(xù)進(jìn)行正常的胚胎發(fā)育，維持“胚性生長”；b.早熟萌發(fā)，即培養(yǎng)后迅速萌發(fā)成幼苗；c.胚在培養(yǎng)基中發(fā)生細(xì)胞增殖形成愈傷組織，并由此再分化形成多個(gè)胚狀體或芽原基。

2024/9/2656（2）幼胚培養(yǎng)技術(shù)幼胚培養(yǎng)的操作方法與成熟胚培養(yǎng)方法基本相同。值得注意的是切取幼胚必須在高倍解剖鏡下進(jìn)行，操作時(shí)要細(xì)心，盡量取出完整的胚。幼胚培養(yǎng)成功的關(guān)鍵，是提供幼胚所必需的營養(yǎng)和環(huán)境條件。2024/9/2657

①培養(yǎng)基幼胚對(duì)培養(yǎng)基要求較高，常用的培養(yǎng)基有Tukey，Nitch、MS，B5培養(yǎng)基；2024/9/2658通常存在的影響條件如下：②生長調(diào)節(jié)物質(zhì)

不同植物的胚培養(yǎng)需要的生長物質(zhì)不同。如IAA可明顯促進(jìn)向日葵胚的生長；IAA，Kt的共同作用可促進(jìn)薺菜幼胚的生長；一般認(rèn)為IAA可使胚的長度增加；加入BA可提高胚的生存機(jī)會(huì)；2024/9/2659③天然提取物的作用

椰乳對(duì)胚培養(yǎng)有一定的促進(jìn)作用（番茄胚在含有50%椰乳的培養(yǎng)基中可維持生長）一些瓜類的胚乳提取物能促進(jìn)胚生長的能力。2024/9/2660④溫光條件

對(duì)于大多數(shù)植物的胚來說，在25-30℃為宜早熟果樹如桃的種胚，必須經(jīng)過一定的低溫春化階段才能正常萌發(fā)生長，而馬鈴薯胚以20℃為好。光照可以促進(jìn)某些植物胚的轉(zhuǎn)綠，利于胚芽生長，而黑暗則利于胚根生長。因此以光暗交替培養(yǎng)較為有利。2024/9/2661⑤其它條件

胚培養(yǎng)中除要求較高的蔗糖（4.5%）濃度、高滲透壓以外，還要求較高濃度的氨基酸及無機(jī)鹽。2024/9/26622024/9/2663(三)胚珠培養(yǎng)１.定義：胚珠培養(yǎng)是將授粉的子房在無菌條件下解剖后，取胚珠置于培養(yǎng)基培養(yǎng)的過程。有時(shí)也把胚珠連同胎座一起取下來培養(yǎng)。2024/9/2664柱頭花柱子房花?；ㄍ谢ńM成2024/9/2665胚囊卵細(xì)胞珠心珠孔反足細(xì)胞珠被胚珠極核

株柄2024/9/26662.意義：

胚珠培養(yǎng)可以解決象蘭科植物成熟胚較小不易培養(yǎng)的問題。另一方面在未受精的胚珠培養(yǎng)中，可誘發(fā)大孢子發(fā)育成單倍體，用于單倍體育種。

3.培養(yǎng)技術(shù)：

從花中取出子房→→70%酒精消毒30秒→→無菌水沖洗→→5%次氯酸鈉液中滅菌10分鐘→→無菌水沖洗數(shù)次→→在無菌條件下進(jìn)行解剖→→取出胚珠→→放在培養(yǎng)基上→→培養(yǎng)基本培養(yǎng)基：用Nistch培養(yǎng)基MS、N6、B5等培養(yǎng)基也可采用關(guān)鍵：選擇胚的發(fā)